Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

El objetivo general de los siguientes procedimientos es proporcionar un medio que permita realizar investigaciones sobre la causa y el efecto de la mutilación ventricular y destacar las técnicas que permiten el estudio de la salud del sistema ventricular y sus importantes funciones de barrera y filtración dentro del cerebro. Esto se logra mediante la recolección de secciones coronales del cerebro del ratón o resonancias magnéticas del cerebro humano para generar reconstrucciones en 3D de los ventrículos y calcular los volúmenes de los ventrículos como un segundo paso: el tejido postmortem que incluye preparaciones en foss de la superficie apical de los ventrículos se tiñe con anticuerpos específicos de células para revelar la integridad celular del revestimiento del ventrículo. A continuación, se prepara un montaje de la organización celular en toda la superficie del ventrículo y se representa sobre el modelo 3D del ventrículo para demostrar las regiones de gliosis frente a las células anexadas intactas.

Los resultados muestran regiones de expansión ventricular basadas en el modelado 3D longitudinal de los ventrículos y áreas donde la capa de células anexas del revestimiento del ventrículo ya no está intacta, sino reemplazada por cicatrices gliales. Al combinar los datos de modelado 3D con los datos inmunohistoquímicos, se puede generar un mapa específico de la región 3D de la composición celular del revestimiento del ventrículo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de lesiones cerebrales, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y el envejecimiento normal, todas las cuales suelen mostrar algún nivel de expansión ventricular y, por lo tanto, probablemente escoliosis de la superficie del ventrículo.

La demostración de los procedimientos en ratones estará a cargo de Richard Wolffer y el estudiante de pregrado de nuestro laboratorio de procedimientos realizados con datos de resonancia magnética humana y tejido humano postmortem será demostrado por yeun. Actualmente es estudiante de medicina y Rebecca Chu, estudiante de posgrado en el laboratorio. Prepare los portaobjetos para obtener imágenes mediante la fijación, el seccionamiento, la inmunotinción y el montaje del cerebro del ratón como se describe en la parte escrita del protocolo. Para comenzar el procedimiento, para rastrear los ventrículos laterales del ratón, encienda el microscopio de fluorescencia vertical y la computadora, el microscopio debe estar equipado con una etapa automatizada y una cámara CCD digital.

Inicie el software de mapeo en modo de fluorescencia, abra las opciones de visualización para cargar las barras de herramientas y los paneles de la piscina de acoplamiento necesarios para el trazado. A continuación, haga clic en opciones, opciones de visualización de accesorios y seleccione las barras de herramientas principal y de marcador en el mismo menú. En los paneles del grupo de acoplamiento, seleccione el histograma de la cámara, el control multicanal, la configuración de la cámara y la adquisición de imágenes.

Identificar la primera pieza de tejido que contiene los ventrículos laterales en función de la fuerte fluorescencia beta S 100 que marca las células anexadas. Revestimiento del ventrículo lateral. Oriente los hemisferios izquierdo y derecho identificando la pequeña incisión realizada durante el corte.

Ahora cree un nuevo archivo de datos y designe un punto de referencia para el movimiento de la etapa haciendo clic en la ventana de la imagen sobre el ventrículo lateral izquierdo. Mantenga este punto de referencia en una ubicación consistente en relación con los ventrículos laterales a través de los archivos de trazado. Para ayudar a la importación de contornos para la reconstrucción en serie, seleccione el tipo de contorno preestablecido adecuado en el menú desplegable de contorno.

Use un color único para cada uno de los trazados del ventrículo lateral izquierdo y derecho. Ahora haga clic a lo largo de toda la superficie apical del revestimiento del apéndice para trazar el contorno del ventrículo. Mueva la ventana de seguimiento con las teclas de flecha.

Después de trazar el contorno, haga clic con el botón derecho y seleccione cerrar contorno. Repita el trazado para el ventrículo derecho usando un color diferente. A continuación, seleccione el marcador adecuado en la barra de herramientas de marcadores de la izquierda y haga clic para soltar un marcador en la pantalla de trazado a lo largo de la línea media para ayudar a alinear los contornos en serie para la reconstrucción 3D.

Repita este procedimiento para hacer una segunda marca. Guarde los trazos de tejido seleccionando archivo Guardar archivo de datos como y cree una nueva carpeta y número de nombre de archivo, los trazos de acuerdo con la convención, número de diapositiva, número de tejido de guión, para una fácil identificación de los rastros de las secciones en serie. A continuación, repita el procedimiento que se acaba de mostrar para todas las secciones que contengan un ventrículo.

Para realizar la reconstrucción 3D del ventrículo lateral. Abra el programa de reconstrucción 3D. A continuación, haga clic en el archivo Abrir y seleccione el archivo de contorno de la primera sección de serie de seguimiento.

Importe todos los trazados de contorno del ventrículo izquierdo y derecho, así como los marcadores agregados. Alinee los contornos de acuerdo con las instrucciones de la parte escrita del protocolo. A continuación, seleccione todos los contornos en el panel de la izquierda y, a continuación, haga clic en el botón de visualización 3D para mostrar la reconstrucción 3D final.

Esta imagen muestra la sección coronal del cerebro de ratón, incluidos los ventrículos laterales, delineados por las células anexas inmunorreactivas beta S 100. El asterisco indica los ventrículos laterales. Los corchetes delinean la adherencia y la barra de escala representa 500 micras.

Los ventrículos laterales del ratón se trazan como contornos y se organizan como secciones de subsegmentos. Se eliminan regiones de intraventricular que interfieren con el análisis volumétrico. Esta imagen muestra la reconstrucción final en 3D de los contornos del ventrículo lateral.

El color amarillo representa el contorno de los volúmenes cerebrales completos que abarcan la región de interés que contiene los ventrículos laterales. Debe tener una buena comprensión de cómo crear reconstrucciones de ventrículos en 3D de tejido cerebral cortado con corona Se enumeran protocolos para crear reconstrucción de imágenes en 3D y cuantificación volumétrica de ventrículos laterales y para evaluar los cambios volumétricos a lo largo del tiempo mediante análisis de superposición longitudinal, es importante tener en cuenta que la consistencia en la resonancia magnética. La recopilación de datos R y el procesamiento posterior a la adquisición son criterios extremadamente importantes para la inclusión de conjuntos de datos. Para realizar la segmentación ventricular, ITK SNAP se utiliza para segmentar los ventrículos a partir de imágenes de resonancia magnética ponderadas en T one de alta resolución. Después de iniciar el programa, abra la imagen en escala de grises, seleccione el archivo deseado y ábralo como un archivo ingenioso.

A continuación, desplácese por cada plano anatómico y observe las anomalías ventriculares, como las regiones de la nariz, los cuernos temporales grandes o pequeños o similares. A continuación, en la caja de herramientas principal, haga clic en serpiente, herramienta ROI. A continuación, segmente 3D y seleccione la opción de región de intensidad.

Ahora haga clic en la imagen de preproceso y seleccione arriba. Registre la intensidad máxima con la barra deslizante. A continuación, ajuste el umbral al 15% de la intensidad máxima y registre este valor.

Esto debería resaltar el ROI en blanco. Establezca el parámetro de suavizado en 10. Haga clic en Aceptar.

Y luego lo siguiente. A continuación, agregue de 10 a 12 burbujas de tamaño pequeño a cada ventrículo. Dos en el asta frontal anterior, siete espaciados uniformemente a lo largo de la superficie superior del cuerpo del ventrículo lateral, uno en el asta occipital y uno en el asta temporal del ventrículo lateral.

A continuación, seleccione los parámetros y establezca la fuerza de curvatura en 0,4. A continuación, haga clic en el símbolo de reproducción para iniciar la evolución activa del contorno. Ahora haga clic en actualizar malla para visualizar la superficie.

A continuación, compruebe la actualización automática. Detiene el proceso de segmentación cuando todas las áreas del ventrículo lateral están incluidas en la región de interés. Evite la inclusión del tercer ventrículo.

Finalmente, haga clic en finalizar y guarde los resultados de la segmentación como un formato de archivo ingenioso. Para obtener el volumen total del ventrículo, seleccione segmentación, volumen y estadísticas para obtener el volumen total del ventrículo utilizando una etiqueta de color establecida. En este segmento, los ROI longitudinales se superponen utilizando el software Mango para demostrar cualitativa y cuantitativamente los cambios en el volumen del ventrículo dentro de los sujetos a lo largo del tiempo.

Después de abrir el software, haga clic en abrir, abrir archivo, cargar el archivo ingenioso guardado anteriormente. Una vez cargado el archivo de imagen, haga clic en ROI de carga de archivos y cargue el ROI del punto de tiempo de ROI de referencia en verde. Haga clic en ROI de carga de archivos y cargue el segundo punto de tiempo de ROI en rojo.

Guarde la superposición longitudinal seleccionando el ROI de guardado de archivo, asigne a cada imagen un nombre de archivo de acuerdo con la convención que ahora se muestra en la pantalla. A continuación, abra ITK snap. A continuación, vuelva a abrir el ROI combinado como una imagen en escala de grises, cargue el ROI combinado seleccionando la carga de segmentación del archivo de ROI combinado de imagen para obtener datos de volumen longitudinal, ejecute el siguiente volumen de segmentación y estadísticas.

La etiqueta uno roja es igual al volumen de expansión, la etiqueta dos verde es igual al volumen de estenosis, la etiqueta tres azules es igual al volumen base, comenzando con un hemisferio intacto que se ha fijado en formina al 10% durante un máximo de seis semanas y se ha enjuagado minuciosamente con una rebanada de PBS de 0,1 molar, secciones coronales de 1,5 centímetros de grosor a través de todo el hemisferio con un bisturí grande con un bisturí microquirúrgico. Diseccionar la pared del ventrículo a un centímetro de profundidad, manteniendo una sección continua para toda la pared lateral, subdividir la pared según sea necesario para crear secciones del tamaño adecuado para la tinción. Haz una muesca en la sección del lado opuesto de la pared del ventrículo.

Para identificar la orientación superior inferior, realizar inmunohistoquímica y montar las secciones de acuerdo con el protocolo escrito. Bajo un endoscopio de disección, asegure el tejido con clavos con un bisturí microquirúrgico, cree una sección uniformemente delgada de la pared del ventrículo lateral y coloque un penem a un lado en un portaobjetos Cuando los portaobjetos estén completamente secos, examine las secciones mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia. Establezca el plano focal de la imagen en la superficie del ventrículo según lo determinado por el uso de beta-catenina, un marcador de adherencia apical.

Proteínas de unión de las células anexadas. A continuación, delinee las regiones de cobertura celular anexada y astrogliosis de superficie de acuerdo con la tinción GFAP en la superficie del ventrículo para documentar y montar toda la superficie del ventrículo. Utilice imágenes superpuestas de toda la superficie para crear un montaje de imágenes en serie.

Abra Adobe Photoshop y utilice el diseño interactivo de automática automática de automatización de archivos para seleccionar imágenes para superponer, realizando ajustes manuales si es necesario. Cree una nueva capa para trazar el montaje y generar una representación de dibujos animados de intacto. Dependiendo de la cobertura celular o de la superficie ventricular G escoliosis, compile todas las secciones para reconstruir el mapa de la pared del ventrículo y vincule la región correspondiente en la reconstrucción de la resonancia magnética.

Este es el ensamblaje de imágenes de resonancia magnética humana aquí. El ventrículo lateral se ha definido en rojo como la región de interés. La reconstrucción de la imagen en 3D, como se muestra aquí, permite la cuantificación volumétrica y la visualización cualitativa del ventrículo lateral.

Esta imagen muestra la evaluación de la expansión longitudinal del ventrículo en un paciente anciano. Las resonancias magnéticas longitudinales desde múltiples puntos se pueden alinear y superponer para visualizar y cuantificar la expansión del volumen del ventrículo dentro de los sujetos a lo largo del tiempo. Estas tres últimas imágenes muestran la evaluación inmunohistoquímica y el mapeo regional de la superficie del ventrículo lateral humano. Aquí.

Las áreas de células anexionadas intactas delineadas por beta catina y tinción muestran una apariencia de adoquín como lo indica el asterisco y están demarcadas por una línea punteada de las regiones de astrogliosis en la superficie del ventrículo delineadas por la tinción GFAP. Las imágenes confocales en serie se superponen para generar un montaje regional y se trazan con Adobe Photoshop o una representación de dibujos animados de la organización celular en la superficie del ventrículo. Esta imagen de dibujos animados del montaje se asigna a la superficie del ventrículo en la reconstrucción de ventrículo 3D basada en resonancia magnética correspondiente.

Como se muestra, el color verde indica un apéndice intacto y las áreas rojas de gliosis. Al realizar este procedimiento, es importante mantener una documentación cuidadosa de cada muestra de tejido para realizar la reconstrucción en serie y el mapeo de la integridad celular. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la subsegmentación de los ventrículos laterales, para responder preguntas adicionales sobre la expansión específica de la región a lo largo del tiempo.