Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

El objetivo general del siguiente experimento es mostrar la migración de linfocitos T efector no adherentes sobre una monocapa de células tumorales adherentes. Esto se logra primero estableciendo una monocapa de células tumorales adherentes en los pocillos de portaobjetos de teflón recubiertos con poli-D-lisina y enmascarados, como segundo paso, los linfocitos T efector marcados con fluorescencia se sedimentan en el centro de la monocapa utilizando un manifold de sedimentación celular. A continuación, se utiliza microscopía de luz y de fluorescencia para visualizar la migración de las células no adherentes sobre la monocapa.

Los resultados muestran que la migración y las funciones efectoras de los linfocitos T no adherentes en co-cultivo con una monocapa de células tumorales adherentes se mantienen después de que los linfocitos han sido transducidos con un vector retroviral. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que puede medirse la migración radial de linfocitos T efector no adherentes en co-cultivo con células tumorales adherentes. Esto tiene implicaciones de gran alcance para pacientes con tumores cerebrales primarios o metastásicos, ya que se están evaluando linfocitos T citotóxicos alogénicos modificados para expresar un gen activador de profármacos, como la citosina desaminasa, como un enfoque multimodal para eliminar tumores en el cerebro.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para establecer monocapas de células tumorales adherentes debido a la heterogeneidad en el crecimiento celular tumoral respecto a las características de adhesión. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para generar una monocapa tumoral uniforme y una sedimentación eficaz de las L-O-C-T-L no adherentes requieren una comprensión experimentada de las características de ambos tipos celulares. Para comenzar, coloque hasta cuatro esterilizados.

10 portaobjetos de 10 pocillos recubiertos con teflón en una placa de Petri estéril de 150 milímetros por 15 milímetros. Coloque una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros que contenga de dos a tres mililitros de agua estéril junto a los portaobjetos para proporcionar humedad. A continuación, pretrate los portaobjetos cubriendo cada pocillo con una solución de 100 microgramos por mililitro de poli-D-lisina o poli-L-lisina.

Incube las laminillas durante una hora a temperatura ambiente, luego aspire la solución y enjuague la superficie del pocillo dos veces con PBS con los pocillos de muestra preparados. Recoga un frasco confluyente de células tumorales adherentes. Cuente el número de células viables mediante microscopía de luz, y luego suspenda las células a una concentración de cinco veces 10 a la seis células por mililitro.

En medio de crecimiento tamponado, agregue de cinco a 10 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo, según el tipo de célula tumoral, complete el volumen del pocillo hasta 40 microlitros con medio y pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las células. Después de sembrar los pocillos, deje que las células tumorales se asienten a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego coloque la tapa sobre la placa de Petri y transfiérala cuidadosamente a un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono e incube durante al menos 24 horas.

Cambie el medio de cultivo en los pocillos diariamente, retirando cuidadosamente una parte del medio de la monocapa y reemplazándolo con un volumen mayor de medio completo para linfocitos T fresco. Las células generalmente alcanzarán confluencia en uno a tres días para prepararlas para la sedimentación sobre la monocapa de células tumorales. Recoga los linfocitos T no adherentes y márquelas con un colorante de proliferación celular siguiendo el protocolo del fabricante, al menos una hora antes del ensayo.

A continuación, coloque la cámara humidificada que contiene las laminillas con células tumorales dentro de la cabina de seguridad biológica. Lave los pocillos con PBS mediante pipeteo y luego agregue 45 microlitros de medio completo con suero al 10% a los pocillos. Deslice un manifold esterilizado de sedimentación celular sobre los pocillos hasta que el gancho en el extremo del manifold toque el fondo de la laminilla.

Asegúrese de que el medio sea visible en los canales del manifold. Luego cuente las células no adherentes y suspenda de una a dos veces 10 a la quinta células por microlitro en el medio.

Disrupción suave de las células para eliminar cualquier agrupación celular que pudiera interferir con la sedimentación celular. Pipetear lentamente un microlitro de la suspensión celular en el canal del manifold para cada pozo. A continuación, incubar el aparato a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para permitir que las células en el canal se sedimenten sobre la monocapa.

Después de que las células se hayan sedimentado, levante suavemente el manifold verticalmente sin tocar la laminilla. Asegúrese de que los pellet celulares se hayan asentado dentro del perímetro del canal del manifold. Mediante un microscopio, se debe observar que las células asentadas se adhieran ligeramente a la monocapa, de modo que mover suavemente la laminilla no disperse el pellet.

Después de confirmar que las células se han sedimentado, transfiera la preparación a un microscopio invertido equipado con una cámara de dióxido de carbono y humedad. Utilice el objetivo de cuatro x para la imagenología de campo claro e imagenología fluorescente multicanal de las células. Adquiera imágenes de un área determinada en los canales de campo claro y fluorescencia, y luego agregue barras de micrones con el software de captura de imágenes.

Guarde el portaobjetos en un incubador humedecido entre los puntos de tiempo una vez que se hayan adquirido todos los puntos de tiempo. Arrastre y suelte los archivos de imagen en el programa de edición de imágenes y seleccione la opción de agregar capa para crear un archivo de imagen con múltiples capas. Combine las imágenes de luz y las imágenes fluorescentes en una sola capa.

Utilice el software de adquisición para tomar imágenes de un área de ocho milímetros por ocho milímetros. El software debe configurarse para unir automáticamente las imágenes capturadas utilizando el canal que esté mejor representado en toda la placa. Si solo se capturan canales de fluorescencia, este debe ser el canal para la obtención de imágenes de las células adherentes.

Alternativamente, las imágenes pueden unirse utilizando software de edición de imágenes. Esto se realiza alineando las regiones de las imágenes que se conservan de una imagen a otra y superponiendo las imágenes unas sobre otras hasta generar una imagen completa. Una las imágenes mediante el software de imágenes.

Utilice las imágenes combinadas para crear mapas de intensidad de fluorescencia de superficie con el software Image J, con el fin de visualizar la agregación o dispersión de linfocitos T fluorescentes a lo largo del tiempo. Linfocitos T citotóxicos alorreactivos humanos, conocidos como Allo CTL, transducidos con un vector retroviral con capacidad de replicación que codifica un gen de expresión de proteína fluorescente verde esmeralda, se colocaron en el centro de una monocapa de células de glioma. Después de cuatro horas, los Allo CTL habían formado agregados visibles para las 24 horas.

Aparecieron zonas vacías en la monocapa de células adherentes, lo que indicaba la lisis de las células tumorales y que algunos CTL alo había migrado más allá del borde periférico. Los CTL alo murinos marcados con fluorescencia se colocaron en el centro de una monocapa de células de glioma marcadas con fluorescencia una hora después; a las 48 horas, los CTL alo estaban estrechamente asociados con las células de glioma y habían migrado desde el centro de la superficie de la monocapa. Se generaron mapas de fluorescencia a partir de estas imágenes mediante el software ImageJ, los cuales muestran una migración considerable desde el centro tras 48 horas.

Es importante cambiar el medio de cultivo diariamente para la monocapa de células tumorales con el fin de mantener condiciones de cultivo saludables. Además, una vez dominado, el sedimentado de células no adherentes debería tomar aproximadamente 20 minutos siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el rastreo del trayecto celular, pueden utilizarse para responder preguntas sobre la velocidad a la que los linfocitos T citotóxicos alogénicos migran a través de la monocapa o el tiempo que permanecen en contacto con las células tumorales realizando sus funciones citotóxicas.

Este protocolo ayudará a los investigadores en el campo de la inmuno terapia génica a explorar la migración de linfocitos T modificados genéticamente en cultivo conjunto con células tumorales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar células no adherentes y adherentes por cultivo conjunto y cómo utilizar el manifold de sedimentación celular para estudiar la migración radial horizontal de células no adherentes sobre una monocapa de células tumorales.