Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

El objetivo general del siguiente experimento es mostrar la migración de linfocitos T efectores no adherentes sobre una monocapa de células tumorales adherentes. Esto se logra estableciendo primero una monocapa de células tumorales adherentes en los pocillos de portaobjetos enmascarados de teflón recubiertos de poli D lisina como efector marcado con fluorescencia en el segundo paso, los linfocitos T se sedimentan en el centro de la monocapa utilizando un colector de sedimentación celular. A continuación, se utiliza la microscopía de luz y fluorescencia para visualizar la migración de las células no adherentes sobre la monocapa.

Los resultados muestran que la migración y las funciones efectoras de los linfocitos T no adherentes en cocultivo con una monocapa de células tumorales adherentes se mantienen después de que los linfocitos han sido transducidos con un vector retroviral. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la migración radial de los linfocitos T efectores no adherentes se puede medir en cultivo en carbón con células tumorales adherentes. Esto tiene implicaciones de largo alcance para los pacientes con tumores cerebrales primarios o metastásicos porque los linfocitos T citotóxicos alogénicos que se modifican para expresar un gen activador profármaco, como la citosina desaminasa, se están probando como un enfoque multimodal para eliminar el tumor en el cerebro.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para establecer monocapas de células tumorales adherentes debido a la heterogeneidad del crecimiento de las células tumorales en las características de adherencia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para generar una monocapa tumoral uniforme y una sedimentación efectiva de L-O-C-T-L no adherente requieren una comprensión experimentada de las características de ambos tipos de células. Para empezar, coloque hasta cuatro esterilizados.

Portaobjetos recubiertos de teflón de 10 pocillos en una placa de Petri estéril de 150 milímetros por 15 milímetros. Coloque una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros que contenga de dos a tres mililitros de agua estéril junto a los portaobjetos para proporcionar humedad. A continuación, precubra los portaobjetos cubriendo cada pocillo con una solución de 100 microgramos por mililitro de poli D licina o poli L lisina.

Incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente, luego aspirar la solución y enjuagar la superficie del pocillo dos veces con PBS con los pocillos de muestra preparados. Recolecta un matraz confluente de células tumorales adheridas. Cuente el número de células viables mediante microscopía óptica y luego suspenda las células a una concentración de cinco veces 10 a seis células por mililitro.

En un medio de crecimiento tamponado, agregue de cinco a 10 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo, dependiendo del tipo de célula tumoral, eleve el volumen del pocillo a 40 microlitros con medio y pipetee hacia arriba y hacia abajo lentamente para distribuir uniformemente las células. Después de sembrar los pocillos, deje que las células tumorales se asienten a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego coloque la tapa en la placa de Petri y transfiérala con cuidado a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono incubada durante al menos 24 horas.

Cambie el medio de cultivo en los pocillos diariamente retirando cuidadosamente parte del medio de la monocapa y reemplazándolo con un volumen más grande de medio de células T completo y fresco. Por lo general, las células confluyen en un plazo de uno a tres días para preparar las células para la sedimentación en la monocapa de células tumorales. Recoja las células T no adherentes y etiquételas con un tinte de proliferación celular de acuerdo con el protocolo del fabricante al menos una hora antes del ensayo.

A continuación, coloque la cámara humidificada que contiene los portaobjetos de células tumorales en el gabinete de seguridad biológica. Lavar los pocillos con PBS mediante pipeteo y luego agregar 45 microlitros de medio completo con 10% de suero a los pocillos. Deslice un colector de sedimentación celular esterilizado sobre los pocillos hasta que el gancho en el extremo del colector toque el fondo del portaobjetos.

Asegúrese de que el medio esté visible en los canales del colector. Luego cuente las celdas no adherentes y suspenda a una o dos veces 10 a la quinta. Células por microlitro en el medio.

Altere suavemente las células para eliminar cualquier grupo de células que interfiera con la sedimentación celular. Pipetee lentamente un microlitro de la suspensión celular en el canal del colector para cada uno. A continuación, incube el aparato a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para permitir que las células del canal se asienten en la monocapa.

Una vez que las celdas se hayan asentado, levante suavemente el colector hacia arriba sin tocar la corredera. Asegúrese de que los gránulos de la celda se hayan asentado dentro de la circunferencia del canal del colector. Usando un microscopio, las células asentadas deben adherirse ligeramente a la monocapa para que al mover suavemente el portaobjetos no se disperse el pellet.

Después de confirmar que las células se han sedimentado, transfiera el portaobjetos a un microscopio invertido equipado con una cámara de dióxido de carbono y humedad. Utilice el objetivo de cuatro x para obtener imágenes fluorescentes de campo claro y multicanal de las células. Adquiera imágenes de un área determinada en canales fluorescentes y de campo claro y, a continuación, agregue barras de micras con el software de captura de imágenes.

Guarde el portaobjetos en una incubadora humidificada entre puntos de tiempo una vez que se hayan adquirido todos los puntos de tiempo. Arrastre y suelte los archivos de imagen en el programa de edición de imágenes y seleccione la opción agregar capa para crear un archivo de imagen con varias capas. Fusiona la luz y las imágenes fluorescentes en una sola capa.

Utilice el software de adquisición para tomar fotografías de un área de ocho milímetros por ocho milímetros. El software debe configurarse para unir automáticamente las imágenes capturadas utilizando el canal que esté mejor representado en todo el pozo. Si solo se obtienen imágenes de canales de fluorescencia, este debería ser el canal para obtener imágenes de las células adherentes.

Alternativamente, las imágenes se pueden unir con un software de edición de imágenes. Esto se hace alineando las regiones de las imágenes que se conservan de una imagen a otra y superponiendo las imágenes una encima de la otra hasta que se genera una imagen completa. Une las imágenes con el software de imagen.

Utilice las imágenes combinadas para crear mapas de fluorescencia de intensidad superficial con el software Image J para visualizar la agregación o propagación de células T fluorescentes a lo largo del tiempo. Los linfocitos T citotóxicos de reacción alogénica humana conocidos como Allo CTL transducidos, con un vector retroviral competente para la replicación que codifica un gen de expresión de proteínas fluorescentes de color verde esmeralda, se asentaron en el centro de una monocapa de células de glioma. Después de cuatro horas, todas las OCTL habían formado agregados visibles a las 24 horas.

Aparecieron parches vacíos en la monocapa celular adherente, lo que indica lisis de las células tumorales y algunos CTL habían migrado más allá del borde de ataque. Las células de glioma allo marcadas con fluorescencia murino se asentaron en el centro de una monocapa de células de glioma marcadas con fluorescencia a una hora Allo CTL estrechamente asociadas con las células de glioma a las 48 horas, Allo CTL había migrado lejos del centro de la intensidad de la superficie de la monocapa. Los mapas de fluorescencia se generaron a partir de estas imágenes con el software image J y muestran una migración sustancial lejos del centro después de 48 horas.

Es importante cambiar el medio de cultivo diariamente para que la monocapa de células tumorales mantenga condiciones de cultivo saludables. Además, una vez dominada la sedimentación de las células no adherentes debería tardar unos 20 minutos siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el rastreo de la ruta celular, se pueden utilizar para responder preguntas sobre la velocidad a la que todos los CTL migran a través de la monocapa o el tiempo que están en contacto con las células tumorales realizando sus funciones citotóxicas.

Este protocolo ayudará a los investigadores en el campo de la inmunoterapia génica a explorar la migración de linfocitos T modificados genéticamente en cocultivo con células tumorales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar células no adherentes y adherentes por cocultivo y cómo usar el colector de sedimentación celular para estudiar la migración radial horizontal de células no adherentes sobre la monocapa de células tumorales.