Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

El objetivo general de este procedimiento es monitorizar la estructura de una proteína a alta resolución mediante la emisión de hidrógeno y deuterio y el marcaje lítico de cadena lateral junto con espectrometría de masas. Esto se logra primero liofilizando la proteína en presencia de diferentes excipientes. En el intercambio de hidrógeno deuterio en estado sólido, la proteína liofilizada se expone al vapor de óxido de deuterio en un desecado sellado bajo humedad relativa y temperatura controladas.

Para el marcaje lítico, la proteína se liofiliza con excipientes y un agente fotorreactivo. A continuación, el vial se irradia con luz ultravioleta para unir covalentemente el agente a la proteína. Para cada método, las muestras se reconstituyen y analizan utilizando un espectrómetro de masas con una resolución a nivel de proteína intacta y péptido.

Estos dos métodos proporcionan información complementaria. Las formulaciones en las que la estructura de la proteína está altamente retenida, muestran una disminución de la absorción de deuterio y un aumento del marcaje lítico, mientras que aquellas con una estructura perturbada muestran una mayor absorción de deuterio y una disminución del marcaje lítico. El marcaje químico, como el intercambio de hidrógeno deuterio y la reticulación fotocruzada, junto con el análisis de espectrometría de masas, se ha adaptado recientemente para estudiar la estructura y las interacciones de las proteínas en soportes animados.

La principal ventaja de estas técnicas sobre los métodos existentes, como la espectroscopia CD y FDIR, es que la estructura y el entorno de las proteínas se pueden sondear con alta resolución en estado sólido. Para comenzar, coloque 200 mililitros de óxido de deuterio en el compartimento inferior de un desecado y agregue 400 gramos de carbonato de potasio Para hacer una solución saturada, coloque la placa desecadora de porcelana dentro y selle el desecado herméticamente. Deje que se equilibre a cinco grados centígrados para alcanzar una humedad relativa estable cercana al 43%A continuación, coloque los viales destapados que contienen proteína liofilizada en el compartimento superior del desecado, selle el desecado e incube a cinco grados centígrados.

Para iniciar la reacción de intercambio de hidrógeno y deuterio para recolectar una muestra, tape el vial inmediatamente después de sacarlo del desecado y luego apague la reacción congelando rápidamente el vial y el nitrógeno líquido. Almacene el vial a menos 80 grados centígrados hasta el análisis por espectrometría de masas. Utilice la espectrometría de masas de alta resolución para analizar las muestras y minimizar el intercambio retrospectivo.

¿Cómo es el sistema de cromatografía líquida dentro de una caja refrigerada? Para configurar primero el instrumento, conecte el circuito de muestra y la trampa de proteínas a la válvula que controla los procesos de desalinización y elución. A continuación, calibre el sistema inyectando la mezcla de ajuste de baja concentración en el espectrómetro de masas y configurando el rango de relación masa-carga de 200 a 3, 200.

A continuación, enfríe el sistema refrigerado a una temperatura de funcionamiento estable de aproximadamente cero grados centígrados. Prepare el tampón de enfriamiento que contiene 0,2 % de ácido fórmico y 5 % de metanol en agua y enfríelo con hielo. Después de transferir las muestras a nitrógeno líquido, retire con cuidado un vial y reconstituya la muestra mediante la adición de dos mililitros de tampón de enfriamiento.

A continuación, cargue un método adecuado de HPLC y espectrometría de masas. Para analizar la muestra aquí, desala 20 picomoles de mioglobina en la trampa de proteínas durante 1,7 minutos con nitrilo acetil al 5% y ácido fórmico al 0,1%. A continuación, eluir la proteína en un gradiente de 3,3 minutos, aumentando a un 80 % de aceto nitrilo y un 0,1 % de ácido fórmico.

Inyecte la muestra y recoja los espectros de masas en un rango de relación masa/carga de 200 a 3, 200. Para determinar la masa de la proteína intacta como referencia, utilice el mismo método con una muestra de proteína calificada indebidamente. Obtenga la masa de la proteína deconvolucionando los espectros sin procesar utilizando el software de análisis de datos Para el análisis de muestras de mioglobina, establezca el rango de masa de 15 a 18, los kilodaltones, la resolución de la masa a un Dalton y la cometa máxima al 90%Para el análisis de péptidos, prepare las muestras utilizando el mismo protocolo que para las proteínas intactas.

Cuando las muestras estén listas para ser analizadas, conecte una columna de pepina inmovilizada y una columna analítica a la válvula y reemplace la trampa de proteínas con una trampa de péptidos. Calibrar el sistema para péptidos ha funcionado para proteínas intactas, pero ajustando el rango de relación masa-carga de 100 a 1700, luego enfríe el sistema refrigerado a una temperatura de funcionamiento estable de aproximadamente cero grados. Una vez calibrado el sistema, programe el método adecuado de HPLC y espectrometría de masas.

Aquí digiere 20 picomoles de mioglobina en la columna de pepina con ácido fórmico al 0,1% en el programa de agua, el método para atrapar y desalinizar los péptidos en la trampa de péptidos durante 1,7 minutos con 10% de nitrilo acetílico y ácido fórmico al 0,1%, y eluir los péptidos en cuatro minutos con un gradiente que aumenta a 60% de nitrilo acetil y ácido fórmico al 0,1%. A continuación, inyecte la muestra y recoja los espectros de masas en un rango de relación masa-carga de 100 a 1700. Analice una muestra de péptido sin fecha con espectrometría de masas en tándem para identificar los fragmentos pépticos.

A continuación, coteja el fragmento determinado experimentalmente con las masas predichas generadas por software. A continuación, establezca el límite de masa en 10 partes por millón para eliminar las masas con alto error para los péptidos con coincidencias. Tenga en cuenta la secuencia peptídica, el estado de carga y el tiempo de retención.

Utilice los datos peptídicos compilados para calcular el número medio de deuteros incorporados por fragmento péptico Utilizando el software de análisis de datos En primer lugar, liofilizar la proteína con el excipiente y la lucina como se indica en el protocolo de texto. Después de preparar las muestras, encienda un reticulante UV que contenga lámparas UV de 365 nanómetros. Deje que las lámparas se calienten durante cinco minutos.

Una vez que las lámparas se hayan calentado, apáguelas y coloque los viales destapados que contienen la formulación dentro de la cámara del reticulante. Irradiar las muestras con luz ultravioleta durante 40 minutos e incluir muestras sin fotoleucina como control Después de irradiar el tapón y almacenar los viales a 20 grados centígrados negativos hasta el análisis por espectrometría de masas. Prepare las muestras para el análisis agregando agua destilada de grado de espectrometría de masas para producir una concentración final de proteína de dos micromolares.

A continuación, analice las muestras utilizando el mismo método de espectrometría de masas que para las proteínas deuteradas intactas. Pero no utilice el sistema lc refrigerado. Adquiera datos de espectrometría de masas de una muestra de proteína no marcada para determinar la masa nativa de la proteína.

Realice el análisis de datos como para las muestras DERATED para el análisis del nivel de péptidos. En primer lugar, realice el marcaje fotolítico de estado sólido con proteínas intactas y almacene a 20 grados centígrados negativos. A continuación, reconstituya la muestra con tampón de bicarbonato de amonio de 100 milimolares para obtener una concentración final de proteína de 10 micromolares.

Mezcle la muestra con tripsina en una proporción de 10 a un molar de proteína a tripsina e incube esta mezcla a 60 grados centígrados durante 16 horas. Mientras tanto, conecte el bucle de muestra, la trampa de péptidos y la columna analítica a la válvula del sistema de HPLC. Después de digerir la proteína, apague la reacción agregando ácido fórmico al 0,1% en agua para producir una concentración final de proteína de dos micromolares.

A continuación, programe el sistema con la HPLC y los métodos de espectrometría de masas. Aquí, inyecte y desale 20 picomoles de la mioglobina digerida en la trampa de péptidos durante 1,5 minutos con 5% de aceto nitrilo y 0,1% de ácido fórmico para eluir los péptidos aumentando el gradiente durante 22 minutos a 55% de nitrilo de acetilo y recoja los espectros de masas en un rango de 100 a 1700 de relación masa-carga. Utilice una herramienta en línea para calcular la masa teórica del péptido.

Aducto de fotoleucina con el número de fotoleucina obtenido previamente del análisis de proteínas intactas. Incluye al menos cuatro escotes omitidos. Cree una lista de masa en Excel para el aducto de leucina foto peptídico.

A continuación, haga coincidir la lista de masas teóricas con las masas observadas experimentalmente estableciendo un punto de corte para identificar las masas con bajo error. Durante el intercambio de hidrógeno y deuterio, el despliegue de la proteína permite el reemplazo del hidrógeno por proteínas de deuterio que conservan su estructura y son menos propensas al intercambio de deuterio. Cuando se realizó espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno y deuterio en estado sólido en formulaciones de mioglobina que contenían talosa y sorbitol, la formulación que contenía sorbitol mostró un 46% más de absorción de deuterio, lo que sugiere que la estructura de la mioglobina en el sorbitol está más perturbada durante el proceso lítico.

Enlaces cruzados de fotoleucina a cadenas laterales de aminoácidos accesibles. El análisis por espectrometría de masas fotolítica de estado sólido de las formulaciones de sorbitol y TLOs que contenían mioglobina mostró una mayor absorción de fotoeine en la formulación de TLOs que su contraparte. Esto sugiere que las cadenas laterales permanecieron accesibles en la formulación de los TLO.

Tanto el intercambio de hidrógeno deuterio como el marcaje lítico utilizan regiones disponibles comercialmente e instrumentación de MS fácilmente disponible para caracterizar proteínas en estado sólido para cualquier formulación dada. El registro de tiempo total desde la preparación de la muestra hasta el análisis completo de los datos es de menos de dos semanas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener información de alta resolución sobre la estructura de la proteína y su importancia en el diseño de formulaciones de proteínas liofilizadas estables.