Name: La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a realizar inmunofluorescencia múltiple secuencial para estudiar la neurogénesis adulta en el hipocampo usando anticuerpos de la misma especie anfitriona. Este método permite detectar todas las etapas de desarrollo en una sola sección tisular.

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Los autores agradecen a S. Tausch su excelente asistencia técnica. El trabajo contó con el apoyo de BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) y DFG (FOR1738).

NOTA: Todos los procedimientos con animales vivos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva de la CE 86/609 / CEE directrices sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobado por el comité de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. inyección intraperitoneal de la timidina análogos <ol><li> Pesar los animales el día antes de la inyección. Calcular la cantidad de análogo de timidina requerido para todas las inyecciones previstas en el día siguiente, así como los volúmenes de inyección en función del peso individuales de una solución madre de 10 mg / ml. </li><li> Preparar 10 mg / ml solución timidina valores. (NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos. Siga las hojas de seguridad específicas (MSDS) proporcionadas por los proveedores, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química). <ol><li> Tome análogo de la timidina del congelador y llevarlo a RT, aprox. 21 ° C. Pesar 10 mg y añadirsolución salina estéril (para BrdU y CldU) o 0,04 N NaOH (en solución salina estéril; para IDU), vórtice. Durante, por lo menos 10 - 15 minutos en un baño de agua a 50 ° C y agitar cada 2 - 3 minutos para disolver el polvo. NOTA: Utilice las soluciones para un máximo de 24 horas cuando se almacena a temperatura ambiente y durante varias semanas a -20 ° C. Proteja las soluciones de la luz (cubierta con papel de aluminio). Siempre verifique precipitados y volver a disolver si es necesario. </li></ol></li><li> Restringir el ratón por la piel y por vía intraperitoneal inyectar un volumen apropiado, ajustada al peso de la solución madre (a temperatura ambiente) con una jeringa de dosificación fina con una aguja de 30 G. NOTA: En caso de CldU e IDU tienen que ser administrados secuencialmente en el mismo animal, consideran para inyectar concentraciones equimolares (por ejemplo, 42,5 mg / kg CldU y 57,5 mg / kg IdU, que corresponden a 50 mg / kg de BrdU). Por lo tanto, ajustar los volúmenes de inyección de las soluciones de 10 mg / ml de solución madre en consecuencia. </li></ol> 2. Preparación del tejido <ol><li> Prepare formaldehído al 4% en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4 en el día antes de la perfusión. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Transcardially perfundir los ratones profundamente anestesiados (3,5% de isoflurano) a través del ventrículo izquierdo con PBS 10 ml de hielo-frío, luego con 40 ml de formaldehído enfriada con hielo (tasa de flujo de 5 ml / min). Diseccionar el cerebro y post-fix en el mismo fijador durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Transferir los cerebros consecutivamente en 10% (24 horas a 4 ° C) y 30% de sacarosa (hasta que los sumideros cerebrales, aprox. 48 h). Para la congelación, sumergir lentamente los cerebros crioprotegidas en -25 ° C hasta que no queden burbujas de isopentano emergen del tejido. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Los cortes de secciones coronales de 40 m de espesor en un micrótomo de congelación (temperatura del bloque a -25 hasta -16 ° C). Secciones de transferencia secuencialmente en solución anticongelante que contiene los pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (véase la Figura 1). Almacenar a -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Esquema de transferencia de rebanadas de microtomo en una placa de 24 pocillos. Comienza en A1 y ​​colocar rodajas posteriores en la fila A, después A6 ir a la siguiente fila B y así sucesivamente. Al llegar a D6, volver a A1 y continuar. Esta disposición de las rebanadas permite para la cuantificación de cada n-ésima sección de todo un cerebro. Para la cuantificación de células recién nacidas tomar cada 6 th sección cerebro (equivalente al contenido de una columna), por el fenotipo de inmunofluorescencia tomar cada sección 12ª (equivalente al contenido de 2 filas alternas de una columna). 3. La inmunotinción NOTA: Las secciones se procesan de flotación libre, generalmente en placas de 6 pocillos equipadas con placa de apoyo e inserciones de malla. Como excepción, el bloqueo, las incubaciones de anticuerpos y la reacción ABC se hacen en 12 ó 24 pocillos sin inserciones de malla (de 0,5 a 1 ml por well es suficiente, en función del número de rebanadas que tienen que ser manchado). Durante estos pasos, transferir secciones con la ayuda de un pincel fino (enjuagar con cada nueva solución). Todas las incubaciones se realizan con agitación continua (max 150 rpm). <ol><li> La inmunohistoquímica (método ABC) <ol><li> Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar por completo el anticongelante. </li><li> Incubar durante 30 min en 1,5% de H 2 O 2 en TBS-T para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Preste atención a la formación de burbujas y volver a sumergirse secciones si fuera necesario. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Opcional: Mientras tanto precalentar un armario de calefacción y de 2 N HCl a 37 ° C. Incubar las secciones durante 30 min a 37 ° C en 2 N HCl para desnaturalizar el ADN. Gently secciones separadas con la ayuda de un pincel. </li><li> Opcional: Neutralizar secciones durante 10 minutos en 0,1 M de borato de pH del tampón8,5, RT. Durante la transferencia, limpie brevemente las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras HCl. Enjuague 2 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y para bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT. </li><li> Incubar en anticuerpo primario diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en anticuerpo secundario biotinilado diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. Mientras tanto ... </li><li> Preparar complejo ABC según el protocolo del fabricante (1% A + B al 1% en TBS-T). Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Incubar las secciones de reactivo AB durante 1 hora a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Preparar 50 ml 0.5 mg / ml DAB en TBS-T por 6 ó 12 pocillos placa, dividido en dos mitades y pipetas 4 ml o 2 ml por pocillo, respectivamente. Secciones de transferencia en solución DAB (PRECAUCIÓN! DAB es tóxico. Siga el específic MSDS proporcionados por el proveedor, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química). </li><li> Añadir 0,5 ml 1% H 2 O 2 a la solución DAB 25 ml restantes, mezclar y volúmenes de pipeta equivalentes como anteriormente a cada pocillo para iniciar la reacción de la peroxidasa. Incubar durante 12 min. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje permanente. </li><li> Opcional: Contratinción antes de colocar el cubreobjetos (ver sección 3.5). NOTA: Si la relación señal-ruido es bajo debido a la alta fondo, repita H 2 O 2 de tratamiento después de la incubación con AB reactivo (paso 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-inmunofluorescencia <ol><li> Individual o simultánea inmunofluorescencia múltiple <ol><li> Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar completamente unanticongelante. </li><li> Opcional: que en los pasos 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT. </li><li> Incubar en cóctel primaria de anticuerpos (por ejemplo, α-BrdU rata, cobaya α-DCX, cabra α-GFP) diluidas en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (por ejemplo, Rodamina Red α-rata, Alexa-647 α-cobaya, Alexa-488 α-cabra, todo derivado en burro) diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje acuoso. </li></ol></li><li> Inmunofluorescencia múltiple secuencial con anticuerpos primarios de misma especie hospedadora <ol><li> Como pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubar en fiprimer anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno A), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en primer anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Rodamina Red-conj. Burro α-conejo), 3 horas RT. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en 10% de suero normal de mismo host que los anticuerpos primarios (por ejemplo, suero de conejo) para RT 3 horas para saturar paratopos abiertas en el primer anticuerpo secundario. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en TBSplus con 50 g / ml fragmentos Fab monovalentes no conjugado dirigido contra el anfitrión de los anticuerpos primarios (por ejemplo, α-conejo IgG (H + L)) para cubrir epítopos que podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario, O / N en 4 ° C. </li><li> Enjuague al menos 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada uno. Durante la transferencia, la SWA brevementeb las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras Fab. </li><li> Incubar en segundo anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno B), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en segundo anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Alexa-488-conj. Burro α-conejo), 3 hr RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. NOTA: Para etiquetar antígenos con anticuerpos de diferentes especies huésped que añadir al paso 3.2.2.2 y los respectivos anticuerpos secundarios al paso 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Uno de los anticuerpos secundarios a partir de una misma especie como uno de los anticuerpos primarios NOTA: Este protocolo es adecuado para cuádruple tinción contra BrdU o Ki67 junto con GFAP, nestin-GFP y DCX. <ol><li> Siga estrictamente el protocolo pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Hasta este punto, utilizar sólo suero burro en TBSplus. </li><li> Incubar en TBSplus que contiene 3% de suero de cabra durante 1 hora a RT. Esto cubre paratopos abiertas en el anticuerpo secundario-α de cabra. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en AMCA-conj. cabra α-conejo diluido en TBSplus, RT 3 hr o O / N 4 ° C. Enjuague tres veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. </li></ol></li><li> CldU, IdU co-tinción <ol><li> Enjuague, desnaturaliza y neutralizar secciones como se describe en la sección 3.2.1 (pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubar con 20 g / ml fragmentos Fab no conjugados α-ratón IgG (H + L) en TBSplus, 1 hr a RT. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpos primario que contiene α-BrdU de rata (1: 400; purificado IgG2) y α-BrdU de ratón (1: 350) diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpo secundario que contiene burro biotinilados α-rata (1: 500) y FITC-conj. burro α-ratón fragmentos Fab (1: 100). Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en Rodamina Red-conj. Estreptavidina, 2 horas a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. </li></ol></li><li> La amplificación de señal de fluorescencia en ratones nestin-GFP <ol><li> Añadir cabra α-GFP al cóctel de anticuerpo primario. </li><li> Añadir un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo con propiedades espectrales similares a GFP (como Alexa 488 conj. Burro α-cabra) al cóctel de anticuerpo secundario. </li></ol></li></ol></li><li> Recuperación del epítopo <ol><li> Llevar a cabo la recuperación de epítopo después de aclarar el anticongelante. Precalentar el vapor con 6 ó 12 pocillos que contenían tampón 0,1 M de citrato de pH de 6,0 a 95 a 99 ° C (aproximadamente 25 min). </li><li> Transferir las secciones en el tampón de citrato caliente y vapor durante 30 minutos (cubrir las placas con papel de aluminio como el plástico lIDs no se calientan-resistente). </li><li> Inmediatamente colocar las placas en un baño de hielo para refrescarse. Esto ayuda a proteger la morfología del tejido, lo cual es de particular importancia cuando se trabaja con secciones de cerebro de animales postnatales. </li><li> Enjuagar 3 veces en TBS durante 10 minutos cada uno para enjuagar y neutralizar el citrato y continuar tinción. </li></ol></li><li> Ratón anticuerpos en tejido de ratón <ol><li> Añadir 20 g / ml fragmentos Fab monovalentes α-ratón IgG (H + L; mismo host-especies que anticuerpo secundario) para la primera etapa de bloqueo (por ejemplo, paso 3.1.5 o 3.2.1.3). </li><li> Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno, y proceda con el protocolo respectivo. </li></ol></li><li> Cresil violeta counterstaining <ol><li> Solución de Precalienta cresil violeta a 60 ° C (en frasco de vidrio). Incubar los portaobjetos en la solución caliente durante 3 minutos. </li><li> Enjuague en ac. dest. y deshidratar 2 veces durante 1 min cada uno en 70%, 96% y 100% de isopropanol. </li&gt; <li> Borrar para 5 - 6 min en xileno o un sustituto de xileno y el cubreobjetos con un medio de montaje permanente compatible. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Contar las células recién nacidos peroxidasa teñidas en cada sección 6º a lo largo de toda la extensión rostrocaudal del giro dentado. Utilice un microscopio de luz con un aumento de 400X. </li><li> Multiplicar el número de células resultantes con el intervalo de intersección para obtener una estimación del número total de células recién nacidos. </li><li> Imagen de la fluorescencia etiquetada secciones con un microscopio láser confocal equipado con láseres y sistemas de filtros adecuados. Tome pilas de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión de la circunvolución dentada con una ampliación de 400X y analizar al menos 50 celdas seleccionadas al azar de interés por hemisferio para co-etiquetado con otros marcadores. </li><li> Multiplique los porcentajes resultantes de las células co-etiquetado (% / 100) con el número total de células recién nacidas para calcular absolutanúmero de poblaciones específicas de células recién nacidas. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La cuantificación e identificación de las subpoblaciones de células recién nacidas es un tema central en la investigación neurogénesis adulta. Combinando marcadores de proliferación y anticuerpos contra las proteínas expresadas durante etapas específicas de la neurogénesis adulta permite la detección inmunohistoquímica de estas subpoblaciones. Algunos de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos requieren condiciones de tinción específicas. Etiquetado de células que se dividen con análo...

Dos regiones del cerebro generar nuevas neuronas constitutivamente largo de la vida, la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo (DG). Las neuronas recién nacidas se derivan de las células progenitoras neurales y pasan por diferentes etapas de desarrollo morfológico y fisiológico antes de alcanzar la madurez 1,2. Desde un dividiendo lentamente-glía radial como células madre (tipo 1) etapas consecutivas de tránsito amplificar surgen células progenitoras intermedias. Los subtipos más indiferenciados (tipo 2a y 2b tipo) tienen una forma irregular con cortos, procesos tangenciales. Generan neuroblastos (tipo 3) que salen gradualmente del ciclo celular para convertirse en neuronas inmaduras (con dendritas extienden hacia la capa molecular) y finalmente integrar en la red del hipocampo células granulares como maduros. Debido a sus características fisiológicas estas células proporcionan los circuitos con una mejora de la plasticidad 3 sugeting un papel único en la función del hipocampo. En realidad, los estudios de la última década generado evidencia sustancial de que la neurogénesis adulta contribuye a la memoria espacial, la separación patrón de comportamiento emocional y 4,5. Neurogénesis adulta se puede estudiar utilizando diferentes enfoques. Análogos de timidina incorporan en el ADN durante la fase S del ciclo celular y permiten nacimiento de citas, la cuantificación y el destino análisis de las células recién nacidos 6-8. La aplicación secuencial de los diferentes análogos de timidina (por ejemplo, CldU, EdU o IDU) puede ser usado para estudiar la renovación celular o poblaciones de células nacidos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de un experimento 9. Una alternativa, marcador endógeno para la proliferación celular es Ki67. Se expresa en las células en división durante todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) excepto la fase de reposo (G0) y el comienzo de G1 10,11. Para analizar el fenotipo de las poblaciones de células recién nacidas en el adulto dentate gyrus varios marcadores moleculares específicos de la etapa se pueden utilizar como GFAP, nestina, DCX y NeuN 1,6. GFAP es un marcador de astrocitos maduros pero también se expresa en células gliales-como radiales en el cerebro anterior adulto. Nestin es un filamento intermedio específico para células gliales como radiales y células progenitoras intermedios tempranos. DCX es una proteína asociada a microtúbulos expresado en progenitores intermedios, los neuroblastos y las neuronas inmaduras. Sobre la base de la (co) expresión de estos tres marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina + , DCX -), el tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) y tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etiquetado de DCX junto con NeuN, que se expresa en las neuronas postmitóticas, permite la diferenciación de immature (DCX +, NeuN +) y maduros (DCX -, NeuN +) neuronas granulares. Los marcadores mencionados anteriormente se utilizan con frecuencia para inmunofluorescencia co-etiquetado y microscopía confocal posterior para analizar el número y la identidad de las células recién nacidos. Esto requiere típicamente anticuerpos de diferentes especies huésped para evitar anticuerpo no deseado reactividad cruzada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos primarios adecuados para la investigación neurogénesis resucitan ya sea en conejos o ratones (por ejemplo, ratón α-BrdU, ratón α-NeuN, conejo α-Ki67, conejo α-GFAP). Esto conduce a graves limitaciones en el número y la combinación de antígenos que se pudieron evaluar en una sola porción. Esto a su vez no sólo aumenta el esfuerzo de tinción, como múltiples coloraciones tienen que ser realizadas, pero también podría comprometer la fiabilidad de los resultados. Además, algunos antígenos son susceptibles a la formalina enmascaramiento epítopo inducida por la fijación (por ejemplo, Ki67, Nestina). Esta revisión se describen las modificaciones de los protocolos immunolabeling múltiple y simple clásicos (por ejemplo, la recuperación de epítopo, inmunotinción secuencial múltiple, uso de nestin-GFP ratones transgénicos 12) que superar muchas de estas cuestiones. En particular, el protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple permite tinción contra un máximo de cuatro antígenos diferentes, incluso si una parte de los anticuerpos se deriva de la misma máquina. Esto permite la detección simultánea de tipo 1, tipo 2a, tipo 2b y tipo de células progenitoras 3, así como su actividad proliferativa dentro de una sola sección.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Administración de análogos de timidina</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-desoxiuridina, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>tóxico (mutagénico, teratogénico)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-desoxiuridina, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>tóxico (mutagénico, teratogénico)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-desoxiuridina, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>tóxico (mutagénico, teratogénico)</td></tr><tr><td>5-Iodo-2&prime;-desoxiuridina, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>tóxicos (mutagénicos, teratogénicos)</td></tr><tr><td colspan="4">Preparación de tejidos</td></tr><tr><td>Isoflurano-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído en polvo (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; EN</td><td>16005</td><td>tóxico, inflamable</td></tr><tr><td>Bomba de perfusión PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon Tubo de laboratorio, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de alimentación, recta, 21 G, 1,75 mm punta de aceituna, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de congelación Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas multipocillas de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal Vaporera Vitacuisine</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell Insertos de membrana de malla de poliéster de 24 mm</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>precargado en placas de cultivo de 6 pocillos Netwell</td></tr><tr><td>Inserciones de membrana de malla de poliéster de</td> <td>15 mmCorning</td><td>3477</td><td>precargado en placas de cultivo de 12 pocillos Kit</td></tr><tr><td>de soporte de plástico Netwell para 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>para insertos de membrana de malla de poliéster de 24 mm Kit</td></tr><tr><td>de soporte de plástico Netwell para 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>para insertos de membrana de malla de poliéster de 15 mm</td></tr><tr><td>Kit Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Hidrato de tetraclorhidrato de diaminobenzidina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>cancerígeno, sensible a la luz</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Anticuerpos primarios</td></tr><tr><td>Conejo IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; requiere recuperación de epítopos</td></tr><tr><td>Conejo &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG de cabra (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Acris Anticuerpos</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Ratón IgG1 &alpha;-nestina</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; requiere recuperación de epítopos conejillo</td></tr> de <tr><td>indias IgG (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rata IgG2a &alpha;- BrdU (ascitis)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>para la detección de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Rata IgG2a &alpha;-BrdU (purificado)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>para la detección de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Ratón IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ratón IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Para la detección de IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">Anticuerpos secundarios</td></tr><tr><td>burro &alfa;-cobaya IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-rata IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-ratón IgG (H+L)-Biotina</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>cabra &alfa;-rata IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-ratón IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-ratón IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-cobaya IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-rata IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alfa;-conejo IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Burro &alpha;-cobaya IgG (H+L)-Rodamina Rojo-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Estreptavidina-rodamina Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-conejo IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, funciona solo con conejo &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondas Moleculares</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Bloqueo </td></tr><tr><td>Burro con fragmento de fabuloso &alpha;-ratón IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Burro con fragmento de fab &alpha;-conejo IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Suero de conejo normal</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>sustituto no tóxico del xileno</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>medio</td></tr> <tr>de montaje permanente<td colspan="4">Microscopía</td></tr><tr><td>Microscopía</td><td></td><td></td> <td>Axioskop 2</td> Carl Zeiss</tr><tr><td>LSM 710</td><td>Microscopía</td><td></td><td></td> Carl Zeiss</tr></tbody></table>

la inmunohistoquímica y etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogénesis adulta es un proceso multi-etapa altamente regulado en el que las nuevas neuronas se generan a partir de una célula madre neural activado a través de cada vez más comprometida subtipos progenitoras intermedias. Cada uno de estos subtipos expresa un conjunto de marcadores moleculares específicos que, junto con los criterios morfológicos específicos, pueden ser utilizados para su identificación. Por lo general, las técnicas de inmunofluorescencia se aplican implica anticuerpos específicos de subtipo en combinación con marcadores de proliferación exo o endógenos. Nosotros describimos en la presente memoria métodos para la detección y cuantificación de todas las etapas de neurogénesis en el hipocampo adulto immunolabeling. Estos comprenden la aplicación de los análogos de timidina, perfusión transcardial, procesamiento de tejido, de recuperación de epítopo inducida por calor, ABC de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta múltiple, microscopía confocal y cuantificación de células. Además se presenta un protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple que evita problemas usually que surge de la necesidad de la utilización de anticuerpos primarios planteados en la misma especie hospedadora. Se permite una identificación precisa de todos los subtipos progenitoras del hipocampo, junto con un marcador de proliferación dentro de una sola sección. Estas técnicas son una poderosa herramienta para estudiar la regulación de los diferentes subtipos progenitoras en paralelo, su implicación en patologías cerebrales y su papel en las funciones específicas del cerebro.

Se aplicaron los métodos descritos anteriormente para cuantificar y caracterizar las células recién nacidas en el hipocampo postnatal y adulto. Por lo tanto, hemos utilizado de tipo salvaje y la neurogénesis deficiente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 ratones alojados en condiciones conocidas por afectar la tasa de neurogénesis (es decir, el medio ambiente enriquecido, EE) 13,14. Tinción inmunohistoquímica DAB contra cualquiera de Ki67, BrdU, CldU o IdU reveló consistentemente diferencias en ...

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

El objetivo general de este procedimiento es sortear las limitaciones de la inmunofluorescencia indirecta para estudiar las células progenitoras neurales cuando no hay disponibles anticuerpos primarios adecuados procedentes de diferentes especies huésped. Inicialmente, se inyecta un análogo de timidina para marcar las células en división, tras lo cual se extrae el tejido, se procesa y se corta en secciones criostáticas.Luego se realiza la inmunofluorescencia múltiple secuencial para comenzar. Se aplica un anticuerpo primario no marcado, que luego es reconocido por un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. A continuación, los epítopos libres del primer anticuerpo secundario se bloquean con suero de la especie del anticuerpo primario, y todas las inmunoglobulinas que podrían ser reconocidas por el segundo anticuerpo secundario se cubren con fragmentos Fab no conjugados.Esto permite tratar el tejido con un segundo anticuerpo primario, que puede marcarse mediante un anticuerpo secundario diferente. En última instancia, las imágenes de las secciones se utilizan para estudiar el desarrollo y la regulación de las células progenitoras neurales en respuesta a estímulos específicos y su participación en funciones cerebrales particulares. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunofluorescencia múltiple simultánea es que evita los problemas que suelen surgir debido a la necesidad de usar anticuerpos primarios producidos en la misma especie de huésped.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, como la proliferación de subconjuntos de progenitores del hipocampo en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos, patologías cerebrales o al envejecimiento. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la marcación múltiple con anticuerpos primarios de la misma especie de origen puede provocar actividades cruzadas no deseadas de los anticuerpos sin un bloqueo adecuado. Primero, pese a los animales que serán inyectados y prepare una solución stock fresca del análogo de timidina a 10 miligramos por mililitro para la inyección.Cuando la solución esté lista, prepare una dosis ajustada por peso en una jeringa de dosificación fina con una aguja de calibre 30. Luego, sujete al ratón por la nuca e inyecte el análogo de timidina por vía intraperitoneal en el punto temporal deseado, anestesie profundamente al ratón y realice una perfusión transcardial. Perfunda con 10 mililitros de PBS frío con hielo, seguido de 40 mililitros de solución fresca de formaldehído fría con hielo.Luego, extraiga el cerebro y colóquelo en el mismo fijador siguiendo la fijación. Incube los cerebros recolectados durante 24 horas en sacarosa al 10 % a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, transfiera los cerebros a sacarosa al 30 % e incube durante otras 48 horas.Con los cerebros listos para la crioprotección, congélelos en isopentano a menos 25 grados Celsius. Posteriormente, utilice un criostato para cortar secciones coronales de 40 micrones para almacenamiento a largo plazo. Transfiera las secciones a una solución anticongelante y manténgalas a menos 20 grados Celsius.Comience transfiriendo los cortes de la solución anticongelante al TBS con la ayuda de un pincel fino. Lave cuidadosamente los cortes, iniciando con un lavado nocturno a cuatro grados Celsius, seguido de cinco lavados de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Todas estas incubaciones deben realizarse con agitación suave y continua.Si uno de los antígenos de interés es un análogo de timidina, en este punto debe implementarse un paso de desnaturalización con ácido clorhídrico, seguido de un paso de neutralización en tampón bore. Continúe con la permeabilización y la bloqueo de los sitios de unión inespecíficos de anticuerpos en TBS plus. Incube durante una hora a temperatura ambiente, luego incube en el primer anticuerpo primario diluido en TBS plus durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente.Lave las secciones tres veces en TBS y una vez en TBST. Deje cada baño durante 10 minutos. A continuación, incube con el anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo primario durante tres horas a temperatura ambiente.A partir de ahora, proteja las secciones de la exposición a la luz. Después de otra serie de lavados, transfiera las secciones a una solución de suero al 10% de la especie huésped en la que se produjeron los dos anticuerpos primarios. Incube las secciones en esta solución durante tres horas para saturar los paratopos libres en el primer anticuerpo secundario.Luego, lavar tres veces con TBS y una vez con TBST para eliminar el suero. A continuación, preparar una solución de TBS más 50 microgramos por mililitro de fragmentos fab monovalentes no conjugados dirigidos contra la especie huésped del anticuerpo primario. Esto cubre los epítopos que de otra manera podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario.Transfiera los cortes a esta solución e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de la incubación, enjuague los cortes al menos tres veces en TBS y una vez en TBST. Durante las transferencias, pase suavemente los insertos de malla que contienen los cortes sobre una toalla de papel para eliminar los restos de fab.Ahora incube las secciones en el segundo anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de otra serie de lavados, aplique el segundo anticuerpo secundario durante tres horas a temperatura ambiente. Finalmente, lave las secciones tres veces en TBS y proceda a montar las secciones con gelatina.Deje secar al aire las laminillas y monte las cubiertas con un medio de montaje ANTIFA imagen. Observe las secciones marcadas con fluorescencia mediante un microscopio confocal de barrido láser. Tome series de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión del giro dentado con un aumento de 400 veces.Analice al menos 50 células de interés seleccionadas al azar por hemisferio para la doble marcación de los diferentes marcadores. Para calcular los números absolutos de poblaciones específicas de células recién formadas, multiplique los porcentajes de células doblemente marcadas por los números totales de células recién formadas estimados a partir del análisis de tinción con DAB. Los métodos descritos se utilizaron para cuantificar y caracterizar las células recién formadas en el hipocampo postnatal y adulto de un ciclo con deficiencia de neurogénesis.En un modelo murino con deleción génica, la tinción con DAB frente a diferentes marcadores de proliferación como KI 67 o BRDU reveló de forma consistente diferencias en el número de células recién formadas entre ratones de tipo salvaje y ratones knock-out. Las células recién formadas marcadas con BRDU pudieron fenotipificarse mediante un protocolo convencional de inmunofluorescencia múltiple, aplicando simultáneamente anticuerpos primarios frente a B-R-D-U-G-F-A-P, nestina en GFP y doblecortina. Esto permitió la identificación exitosa de células progenitoras recién formadas de tipo uno, tipo dos A, tipo dos B y tipo tres dentro de una única muestra.Alternativamente, con intervalos de tiempo más largos entre la inyección de BRDU y el sacrificio del animal, se podría analizar el número final de neuronas recién formadas mediante tinción inmunohistoquímica simultánea de BRDU y neuronas nuevas. El protocolo de etiquetado inmunológico secuencial funcionó perfectamente si primero se incubaron simultáneamente las secciones con anticuerpos de conejo anti KI 67, de cabra anti GFP y de cobayo anti doble cordón, y en segundo lugar, con anticuerpo de conejo anti GFAP, pero no a la inversa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar hasta cuatro antígenos diferentes en una única sección de tejido utilizando anticuerpos primarios producidos en el mismo huésped.Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir controles adecuados para eliminar la posibilidad de reactividad cruzada del anticuerpo o resultados falsos positivos. Tenga en cuenta que la secuencia de incubaciones con los anticuerpos primarios podría influir fuertemente en el resultado del protocolo.

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Investigación

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Neurociencia

El video ilustra un método de tinción de inmunofluorescencia utilizado para examinar la neurogénesis en el hipocampo adulto. Inicialmente, una sección del cerebro de un ratón se somete a un tratamiento con anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas marcadoras asociadas con la neurogénesis en las células progenitoras neuronales. A continuación, se marca con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos. A continuación, se observa la sección del cerebro bajo un microscopio confocal para...

Una técnica de tinción de inmunofluorescencia para detectar la neurogénesis del hipocampo adulto

Este video muestra el procedimiento para teñir células madre neurales recién proliferadas en secciones de tejido cerebral utilizando la incorporación de EdU, seguido de inmunofluorescencia para visualizar proteínas específicas, mejorando la comprensión de la dinámica celular y la proliferación.

Tinción de inmunofluorescencia para la visualización de células madre neurales proliferadas en secciones de cerebro de ratón

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.

Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Este artículo presenta cuatro de las técnicas más comunes para visualizar células BrdU positivas para medir la neurogénesis adulta en ratas. Este trabajo incluye instrucciones para la preparación de reactivos, administración de análogos de timidina, perfusión transcárdica, preparación de tejidos, reacción inmunohistoquímica de la peroxidasa, inmunofluorescencia, amplificación de señales, contratinción, imágenes de microscopía y análisis celular.

Técnicas de inmunohistoquímica para analizar la proliferación celular y la neurogénesis en ratas utilizando el análogo de timidina BrdU

Aquí, el protocolo describe cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Además, puede incluir el tercer anticuerpo de un huésped diferente en este protocolo. Este enfoque se puede hacer en cualquier tipo de célula y patógenos.

Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Aprenda a realizar inmunofluorescencia múltiple secuencial para estudiar la neurogénesis adulta en el hipocampo usando anticuerpos de la misma especie anfitriona. Este método permite detectar todas las etapas de desarrollo en una sola sección tisular.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis (Video) | JoVE Journal

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

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