La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

El objetivo general de este procedimiento es eludir las limitaciones de la inmunofluorescencia indirecta para estudiar las células progenitoras neurales. Cuando no se dispone de anticuerpos primarios adecuados de diferentes especies de huéspedes. Inicialmente, se inyecta un análogo de timidina para etiquetar las células en división, después de lo cual el tejido se cosecha, procesa y corta en secciones criogénicas.

A continuación, se realiza la inmunofluorescencia múltiple secuencial para comenzar. Se aplica un anticuerpo primario no marcado, que luego se une a un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. A continuación, las perícopas abiertas del primer anticuerpo secundario se bloquean con suero de la especie de anticuerpo primario, y todas las inmunoglobulinas que podrían ser reconocidas por el segundo anticuerpo secundario se cubren con fragmentos de fab no conjugados.

Esto permite que el tejido sea tratado con un segundo anticuerpo primario, que puede ser marcado por un anticuerpo secundario diferente. En última instancia, las imágenes de las secciones se utilizan para estudiar el desarrollo y la regulación de las células progenitoras neurales en respuesta a estímulos específicos y su participación en funciones cerebrales particulares. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la inmunofluorescencia múltiple simultánea, es que evita los problemas que suelen surgir de la necesidad de utilizar anticuerpos primarios obtenidos en la misma especie huésped.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, como la proliferación de subconjuntos de progenitores del hipocampo en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos, patologías cerebrales o envejecimiento. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque el marcaje múltiple con anticuerpos primarios de la misma especie huésped podría conducir a actividades cruzadas de anticuerpos no deseadas sin un bloqueo adecuado. En primer lugar, pesa los animales que se van a inyectar y prepara una solución madre fresca de 10 miligramos por mililitro de análogo de timidina para la inyección.

Cuando la solución esté lista, prepare una dosis ajustada al peso en una jeringa de dosificación fina con una aguja de calibre 30. A continuación, sujete al ratón por el pescuezo e inyecte el análogo de timidina intraperitoneal en el punto de tiempo deseado, anestesiar profundamente al ratón y trans cardio. Perfundirlo con 10 mililitros de PBS helado, seguido de 40 mililitros de solución fresca de formaldehído helado.

A continuación, disecciona el cerebro y fíjalo en el mismo fijador después de la fijación. Incubar los cerebros recolectados durante 24 horas en sacarosa al 10% a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera los cerebros a sacarosa al 30% e incube durante otras 48 horas.

Con los cerebros listos para la protección criogénica, congélelos en pentano isop de 25 grados centígrados negativos. Más tarde, use un criostato para cortar secciones coronales de 40 micras para el almacenamiento a largo plazo. Transfiera las secciones a una solución anticongelante y manténgalas a menos 20 grados centígrados.

Comience transfiriendo las secciones de la solución anticongelante a TBS con la ayuda de un cepillo fino. Enjuague bien las secciones, comenzando con un lavado nocturno a cuatro grados centígrados, seguido de cinco lavados de 10 minutos a temperatura ambiente. Todas estas incubaciones deben realizarse con una agitación suave y continua.

Si uno de los antígenos de interés es un análogo de timidina, se debe implementar una etapa de desnaturalización del ácido clorhídrico en este punto, seguida de una etapa de neutralización en tampón de perforación. Proceda con permeabilidad y bloqueo de los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos en TBS plus. Deje que esta incubación dure una hora a temperatura ambiente, luego incube en el primer anticuerpo primario diluido en TBS más durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Lave las secciones tres veces en TBS y una vez en TBST. Deje reposar cada baño durante 10 minutos. A continuación, incubar en el primer anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo durante tres horas a temperatura ambiente.

A partir de ahora, proteja las secciones de la exposición a la luz. Después de otra serie de lavados, transfiera las secciones a una solución de suero al 10% de la especie huésped a partir de la cual se produjeron los dos anticuerpos primarios. Incubar las secciones en esta solución durante tres horas para saturar las perícopas abiertas en el primer anticuerpo secundario.

Posteriormente enjuague tres veces en TBS y una vez en TBST para eliminar el suero. A continuación, prepare una solución de TBS plus con 50 microgramos por mililitro de fragmentos de fab monovalentes no conjugados dirigidos contra la especie huésped del anticuerpo primario. Esto cubre los epítopos que de otro modo podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario.

Transfiera las secciones a esta solución e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, enjuague las secciones al menos tres veces en TBS y una vez en TBST. Durante las transferencias, frote los insertos de malla que contienen las secciones en una toalla de papel para eliminar los restos de fabulosa residuales.

Ahora incube las secciones en el segundo anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de otra serie de lavados, aplique el segundo anticuerpo secundario durante tres horas a temperatura ambiente. Finalmente, lave las secciones tres veces en TBS y proceda con el montaje de las secciones de gelatina.

Seque al aire las diapositivas y cúbralas con una imagen de medio de montaje ANTIFA. Las secciones marcadas con fluorescencia con un microscopio de barrido láser confocal. Tome pilas de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión del giro dentado con un aumento de 400 veces.

Analice al menos 50 celdas de interés seleccionadas al azar por hemisferio para el coetiquetado de los diferentes marcadores. Para calcular los números absolutos de poblaciones específicas de células recién nacidas, multiplique los porcentajes de células comarcadas por el número total de células recién nacidas según lo estimado a partir del análisis de tinción de DAB. Los métodos descritos se utilizaron para cuantificar y caracterizar las células recién nacidas en el hipocampo postnatal y adulto de un ciclo deficiente de neurogénesis.

El modelo de ratón D dos knockout, la tinción de DAB contra diferentes marcadores de proliferación como KI 67 o BRDU reveló consistentemente diferencias en el número de células recién nacidas entre ratones de tipo salvaje y knockout. Las células recién nacidas marcadas con BRDU podrían ser fenotipadas con un protocolo convencional de inmunofluorescencia múltiple de aplicación simultánea de anticuerpos primarios contra el nido B-R-D-U-G-F-A-P en GFP y doble courtina. Esto permitió la identificación exitosa de células progenitoras recién nacidas de tipo uno, tipo dos A, tipo dos B y tipo tres dentro de un solo espécimen.

Alternativamente, con intervalos de tiempo más largos entre la inyección de BRDU y el sacrificio del animal, el número final de neuronas recién nacidas podría analizarse mediante inmunotinción simultánea de BRDU new n. El protocolo de inmunomarcaje secuencial funcionó perfectamente si las secciones se incubaron primero simultáneamente con anticuerpos anti KI 67 de conejo, anti GFP de cabra y anti doble cordón de cobaya y, en segundo lugar, con anticuerpos anti GFAP de conejo, pero no al revés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar hasta cuatro antígenos diferentes en una sola sección de tejido utilizando anticuerpos primarios generados en el mismo huésped.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir controles adecuados para eliminar la posibilidad de anticuerpos, reactividad cruzada o falsos positivos. Tenga en cuenta que la secuencia de incubaciones primarias de anticuerpos podría influir en gran medida en el resultado del protocolo.