Bone Medium acondicionado: Preparación y Bioensayo

El objetivo general de este video es describir cómo preparar un medio condicionado óseo y probar su actividad in vitro. Esto se logra recolectando primero astillas de hueso de la mandíbula de un cerdo con un raspador de huesos. El segundo paso es tratar térmicamente, desmineralizar o no hacer nada con las astillas de hueso antes de incubarlas en medio de cultivo durante 24 horas.

A continuación, se recoge el medio condicionado óseo que contiene todos los factores liberados por las virutas óseas. El paso final es estimular las células con el medio condicionado óseo o preincubar un biomaterial con el medio condicionado óseo y las células semilla en él después del período de incubación. En última instancia, la PCR cuantitativa en tiempo real se utiliza para mostrar los cambios en la expresión génica de las células después del tratamiento.

La utilización de injertos óseos autólogos solos o en combinación con otros biomateriales estimula la regeneración ósea en los defectos óseos periimplantarios y, por lo tanto, garantiza buenos resultados a largo plazo. Este video presenta un bioensayo in vitro, que es útil para determinar la respuesta genética de las células masivas a las biomoléculas dentro de la condición ósea. La condición ósea media puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los traumatismos, maxilofaciales y dentales, como por qué el hueso autólogo es el objetivo del injerto estándar en la regeneración ósea.

La preparación del medio de condición a partir de hueso procesado, como el autoinjerto óseo tratado térmicamente o la matriz ósea izada, puede ser difícil de estandarizar. Por lo tanto, es importante ser preciso. Para empezar, consigue mandíbulas de cerdo frescas de un carnicero local y colócalas sobre una superficie firme.

A continuación, utilice un periostio para liberar un colgajo de periostio de espesor completo prestando especial atención a no dejar ninguno de los tejidos blandos adheridos al hueso. Una vez que se haya extraído el periostio, sujete firmemente el raspador de hueso y use movimientos largos para recolectar astillas de hueso del lado bucal de la mandíbula. Deseche cualquiera de las astillas de hueso que tengan menos de un milímetro de longitud.

Evite que las astillas de hueso se sequen cubriéndolas rápidamente con medio de cultivo en una placa de Petri de 10 centímetros. Después de que se hayan recolectado suficientes astillas de hueso, prepare un lote de control térmico pasteurizando cinco gramos de las astillas de hueso. Pasteurice las patatas fritas calentándolas durante 30 minutos a 80 grados centígrados o autoclavelas durante 20 minutos a 121 grados centígrados.

A continuación, prepare un control desmineralizado agregando cinco gramos de astillas de hueso en una solución molar de ácido clorhídrico y colocándolas en un agitador durante cuatro a seis horas a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar las virutas de hueso repetidamente con medio de cultivo hasta alcanzar un pH neutro. Coloque cinco gramos de chips de hueso fresco y cinco gramos de cada una de las preparaciones de control en platos separados, y agregue 10 mililitros de medio de cultivo fresco a cada plato.

A continuación, incubar las muestras en una atmósfera humidificada a 37 grados centígrados durante 24 horas para crear el medio acondicionado al día siguiente. Retire el medio de cada plato y colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el medio acondicionado para hueso a 200 veces la gravedad durante 10 minutos para eliminar cualquier residuo.

A continuación, retire el sobrenadante y páselo por un filtro estéril de 0,2 micras, almacene los cuádruples Ali congelados a menos 80 grados centígrados hasta que se necesiten. Comience por sembrar células mesenquimales humanas, como células óseas o fibroblastos de ligamento gingival y periodontal, en una placa de 12 ballenas a una concentración de 30.000 células por centímetro cuadrado. Cubra las células con medio de crecimiento y deje que las células se adhieran a la placa durante la noche a la mañana siguiente.

Deseche el medio de cultivo y lave las células con PBS precalentado a 37 grados centígrados. A continuación, estimule las células añadiendo un medio de cultivo libre de suero precalentado con y sin un 20% de medio condicionado óseo. Si también se prueba la capacidad de absorción de un biomaterial, agregue el medio acondicionado para el hueso, incluidos los controles, a los tubos que contengan el biomaterial de interés, e incube los tubos a 37 grados Celsius durante una hora.

A continuación, enjuague el biomaterial vigorosamente con PBS precalentado y siembre células mesenquimales humanas a una concentración de 30.000 células por centímetro cuadrado sobre el material. Incubar las células solas o las sembradas en los biomateriales en una atmósfera humidificada a 37 grados CS durante 24 horas. A continuación, descarte el medio de cultivo.

Enjuague las células con PBS precalentado y extraiga el ARN de las células utilizando un protocolo estándar de aislamiento de ARN. Una vez que se ha aislado el ARN, prepare muestras de CD NA de cada grupo de tratamiento comenzando con concentraciones iguales del ARN extraído y ejecutando una reacción de transcriptasa inversa en cada muestra. A continuación, realice una PCR cuantitativa en tiempo real en las muestras para buscar los niveles de genes seleccionados utilizando los cebadores y las condiciones enumeradas en el protocolo de texto adjunto.

Por último, se calcula la calidad del medio condicionado óseo en función de los niveles relativos de expresión génica normalizando los niveles umbral del ciclo de los genes al gen de mantenimiento Gabb dh utilizando el método de TC delta delta. Estos son algunos resultados típicos que muestran los cambios en la expresión génica de los fibroblastos orales expuestos a un medio condicionado óseo durante 24 horas. Dos genes, la adrenalina y el pent trax y el tres, se redujeron significativamente hasta el 40% de los niveles originales, mientras que las interleucinas 11 y 33, junto con la N-A-D-P-H oxidasa cuatro y el proteglicano cuatro se regularon al alza hasta 200 veces.

Curiosamente, las membranas de barrera de colágeno utilizadas para proteger las astillas óseas del tejido blando circundante absorben gran parte del medio condicionado al hueso que es responsable de los cambios en la expresión génica. Las membranas de colágeno, sin embargo, no lograron absorber los factores que controlan la expresión de la interleucina 33. Por lo tanto, la expresión de interleucina 33 no está regulada en este contexto.

El protocolo aquí descrito se puede adaptar para estudiar la respuesta de diferentes tipos de células que involucran la regeneración ósea. Además, el protocolo se puede utilizar para preparar el medio de condición a partir de hueso de proceso y otros rellenos óseos. La relevancia clínica de este bioensayo sigue sin estar clara.

La respuesta celular al BCM in vivo es probablemente más compleja e incluye un amplio espectro de genes y diferentes células diana, ampliando las aquí presentadas. Sin embargo, nuestro bioensayo proporciona los primeros datos sobre la composición presumiblemente compleja de las moléculas óseas de RAF y la respuesta celular in vitro.