Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

El objetivo general de este procedimiento es aislar vesículas extracelulares utilizando una plataforma basada en papel. Esto se logra laminando primero con dos láminas de poliestireno con celulosa circular, recortes de papel alineados en una serie de orificios pasantes registrados. El segundo paso es conjugar químicamente las moléculas que unirían las vesículas extracelulares a la zona de prueba de papel.

A continuación, la muestra biológica se puede pipetear directamente en la zona de prueba de papel y las vesículas extracelulares se aíslan después del paso de enjuague. El paso final es caracterizar las vesículas extracelulares capturadas mediante microscopía electrónica, Eliza o análisis transcriptómico. En última instancia, se pueden purificar y concentrar subconjuntos de vesículas extracelulares de muestras de suero de tan solo 10 microlitros.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la ultra educación es que es mucho más suave y fácil de realizar. Demostrando el procedimiento será un estudiante de posgrado. Comenzando con dos láminas de poliestireno, crea una serie de recortes circulares.

Cada uno con un diámetro de menos de cinco milímetros con una perforadora manual o un plotter de corte automatizado CAD. Además, corte una serie de cromatografía de cinco milímetros de diámetro, discos de papel con una perforadora. Coloque una hoja de poliestireno en el banco y superponga un solo disco de papel encima de cada orificio pasante correspondiente.

Intercala los discos de papel registrando y superponiendo la segunda hoja de poliestireno. Verifique la alineación general antes de unir el sándwich en una laminadora térmica. A continuación, comience las modificaciones químicas de la superficie de los discos de papel insertando el dispositivo laminado en una cámara de plasma.

Active brevemente la superficie del papel con plasma de oxígeno al liberar el vacío de la cámara, transfiera inmediatamente el dispositivo de papel a la solución de cilindro e incube durante 30 minutos. Ajuste la temperatura ambiente. Elimine el exceso de carriles cíclicos enjuagando el dispositivo con cinco mililitros de etanol de 200 grados.

A continuación, incube el dispositivo con la solución enlazadora A-G-M-B-S durante 15 minutos. Ajuste la temperatura ambiente. Elimine el exceso de molécula enlazadora con abundantes enjuagues de etanol.

A continuación, incube el dispositivo con avendón durante una hora a cuatro grados centígrados y elimine el avendón suelto con un lavado PBS de cinco mililitros. A continuación, el dispositivo puede pasar a la etapa de unión de anticuerpos o almacenarse a cuatro grados centígrados durante cuatro semanas si es necesario. Tras la fijación de Aden, pipetee 10 microlitros de solución de bloqueo en las regiones expuestas del disco de papel e incube el papel durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, repita la adición de 10 microlitros de solución bloqueante y la incubación a temperatura ambiente de 10 minutos. Dos veces más para completar la biofuncionalización del sustrato de papel expuesto, pipetee 10 microlitros de las moléculas de captura biotiniladas en los discos e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para vesículas extracelulares, las moléculas de captura elegidas pueden ser anticuerpos anti CD 63 o una xin cinco. Repita el pipeteo de 10 microlitros y los procesos de incubación de 10 minutos.

Dos veces más después de la captura de la unión de la molécula. Lave el exceso de restos pipeteando. 10 microlitros del tampón de lavado adecuado en cada disco de papel.

Incube el lavado durante un minuto a temperatura ambiente y repita los pasos de lavado de 10 microlitros y un minuto de incubación dos veces más. El dispositivo de papel totalmente funcionalizado ya está preparado para aislar vesículas extracelulares del suero o del humor acuoso para el procesamiento del suero. Recoja 10 mililitros de sangre periférica en un tubo vacutainer e invierta suavemente el tubo cinco veces.

Coloque el tubo en posición vertical y espere 30 minutos. Ajuste la temperatura ambiente, centrifugue la muestra de sangre durante 15 minutos. Ajuste la temperatura ambiente.

Transfiera la capa superior de suero transparente a un tubo de plástico limpio y deseche la fase semisólida inferior. Clarificar el suero a una velocidad de centrifugación más alta durante 30 minutos. Ajuste la temperatura ambiente.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y elimine las partículas finas pasando el sobrenadante a través de un filtro de 0,8 micrómetros. El suero filtrado resultante puede utilizarse inmediatamente o almacenarse a menos 80 grados centígrados. Si las vesículas extracelulares se van a extraer del humor, recoja el humor acuoso de los pacientes directamente a través de procedimientos invasivos y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados.

Hasta su uso, no se necesitan pasos de filtración o clarificación para las muestras de humor vítreo. Para aislar las vesículas extracelulares del suero o del humor acuoso, coloque una pipetea de cinco microlitros de la muestra biológica en cada disco de sustrato de papel biofuncionalizado. Incubar el lugar durante un minuto a temperatura ambiente y repetir los procesos de pipeteo de cinco microlitros y de incubación de un minuto.

Dos veces más Después de la unión por afinidad, enjuague las vesículas no unidas pipeteando primero 10 microlitros del tampón de lavado adecuado. Incubar el tampón durante un minuto a temperatura ambiente y repetir el lavado de 10 microlitros y la posterior incubación. Da dos pasos más.

Las vesículas extracelulares capturadas ya están listas para los siguientes ensayos posteriores para fijar las vesículas capturadas en la pipeta de soporte de papel funcionalizada de 10 microlitros de fijador karnofsky de 0,5 x en cada disco de papel. Deje que la reacción de reticulación proceda a temperatura ambiente durante 10 minutos y enjuague todos los discos con grandes cantidades de PBS durante cinco minutos. A continuación, deshidrata los sustratos de papel aplicando los siguientes lavados en orden.

Una incubación de etanol al 35%, dos incubaciones de etanol al 50%, dos incubaciones de etanol al 70%, dos incubaciones de etanol al 95% y cuatro incubaciones de etanol al 100%. Para cada lavado individual, deje que la solución de etanol se incube sobre los discos de papel a temperatura ambiente durante 10 minutos. Cuando el dispositivo de papel esté completamente seco, cubra las muestras con una capa de 18 nanómetros de oro paladio en un pulverizador de metal.

Inserte la muestra en un microscopio electrónico de barrido y realice la microscopía a cinco kilovoltios para evitar la carga excesiva de la muestra biológica para detectar las vesículas capturadas mediante inmunoensayos. Comience agregando cinco microlitros de anticuerpo primario anti CD nueve en cada disco de papel e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Elimine todos los anticuerpos no unidos lavando el dispositivo de papel con 30 mililitros de PBS a temperatura ambiente mediante agitación mecánica.

A continuación, pipetee cinco microlitros de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante en cada papel. Disco e incubar a temperatura ambiente durante un minuto. Lave el dispositivo con 30 mililitros de PBS mediante agitación mecánica para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Finalmente, agregue cinco microlitros de mezcla de color y sustrato métrico en cada papel. Disco. Incube la reacción a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos y escanee el cambio resultante en la intensidad del color directo con un escáner de escritorio. Para empezar, aísle los discos de papel individuales del dispositivo a granel cortando las regiones de exceso de laminado de poliestireno con unas tijeras o una cuchilla de afeitar.

Coloque cada disco de papel en una microcentrífuga limpia de 1,5 mililitros. Dos lisas las vesículas capturadas mediante la adición de 265 microlitros de tampón de lisis. Y 35 microlitros de portador de eliminación de polisacáridos a base de PVP a cada vórtice de tubo vigorosamente.

Para asegurar la vesícula completa, la lisis y el desplazamiento de las moléculas de ARN liberadas, agregue 30 microlitros de solución homogeneizada al vórtice de lisado para mezclar e incubar el tubo en hielo durante 10 minutos. A continuación, agregue 330 microlitros de mezcla de cloroformo de fenol ácido al lisado para garantizar una separación adecuada de fase específica del ARN de ambas proteínas y el vórtice de ADN vigorosamente durante al menos 15 segundos por tubo. Centrifugar el tubo a toda velocidad durante cinco minutos.

A temperatura ambiente, transfiera el ARN que contiene la fase acuosa superior a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y deseche la fase orgánica inferior. Agregue 1,25 volúmenes acuosos de etanol al 100% al ARN y al vórtice brevemente para mezclar. A continuación, aplique la mezcla en una columna de extracción de sólidos de ARN comercial.

Centrifugar el tubo durante 15 segundos a temperatura ambiente y desechar la fracción de paso del flujo. Lave la columna agregando 700 microlitros de solución de trabajo. Número uno, centrifugar el tubo durante cinco a 10 segundos y desechar el flujo.

A continuación, lave la columna con 500 microlitros de solución de trabajo. Número dos, centrifugar el tubo durante cinco a 10 segundos. Deseche el flujo y repita el lavado una vez más.

Elimine cualquier etanol residual con un centrifugado final de un minuto a temperatura ambiente y transfiera la columna de extracción seca a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Agregue 100 microlitros de agua precalentada sin ARN R. Centrifugar el tubo a toda velocidad durante cinco a 10 segundos y desechar la columna de extracción superior si se considera necesario.

Concentre y purifique aún más el ARN EIT utilizando un kit comercial de limpieza de ARN con biotina marcada con fluorescencia. Como reportero de la movilización de la IM de superficie. La eficacia y especificidad del protocolo de funcionalización del papel se puede ver comparando la alta fluorescencia incurrida en la superficie modificada con reticulante sobre las superficies de papel no funcionalizadas.

Además, cuando la molécula reportera es reemplazada por un anticuerpo anti CD 63 biotinilado, el sustrato de papel correctamente funcionalizado facilitará una mayor tasa de captura de vesículas extracelulares sobre un sustrato de papel de control negativo. Cuando se inmovilizan diferentes moléculas de captura sobre sustratos de papel, diferentes subgrupos de vesículas extracelulares parecen exhibir diferentes distribuciones de tamaño utilizando el dispositivo de papel. También se puede determinar tanto el contenido de ARN intravesical como la abundancia de proteínas de superficie específicas de la vesícula.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y atender el aumento de las células extracelulares utilizando un dispositivo de papel.