Name: Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprende a utilizar el cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar células madre epiteliales en el bucle cervical del incisivo de ratón. Este método permite la manipulación in vitro y el análisis de señalización Wnt en el nicho de células madre dentales.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Jane y Aatos Erkko.

Este protocolo implica el uso de animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités de Ética sobre el Uso y Cuidado de Animales y el Animalario de la Universidad de Helsinki.
1. Preparación de la placa de cultivo de órganos
<ol><li>Realice todos los procedimientos en una campana de flujo laminar. Limpie las superficies de trabajo con etanol al 70% y utilice instrumentos y soluciones de vidrio esterilizados en autoclave. Esterilice las tijeras y otros equipos metálicos en un esterilizador de cuentas de vidrio.</li>
	<li>Prepare filtros normalmente almacenados en etanol al 70% lavándolos tres veces en 1x PBS para eliminar el etanol (Figura 1). Corte los filtros en trozos rectangulares (3 x 3-5 x 5 mm). NOTA: Las piezas filtrantes lavadas se pueden almacenar durante varios días en 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Preparar el medio de cultivo (DMEM:F12 1:1 suplementado con 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido en NaCl al 0,85%, FBS al 10%, ácido ascórbico 150 μg/ml y penicilina [10.000 UI/ml] al 0,2% y estreptomicina [10.000 μg/ml]). Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Coloque las rejillas metálicas de 30 mm (con orificios de 1-2 mm de diámetro que permiten obtener imágenes de tejidos) en una placa de Petri de 35 mm. Agregue suficientes medios para llegar a la superficie de la rejilla sin producir burbujas de aire. Precaliente la placa de cultivo preparada a 37 °C hasta que el tejido esté aislado y listo para el cultivo (en una incubadora estándar con 5% deCO2 y 90%-95% de humedad).</li>
</ol>2. Disección incisiva y aislamiento del extremo proximal
<ol><li>Sacrificar a los animales siguiendo un protocolo aprobado de cuidado de los animales.</li>
	<li>Decapitar al ratón y diseccionar la mandíbula. Para ello, primero retira la piel para exponer la mandíbula y corta a través de los músculos maseteros para separarla del maxilar y del resto de la cabeza.</li>
	<li>Una vez aislada la mandíbula, retire la lengua y la mayor cantidad de tejido blando posible.</li>
	<li>Recoja todas las mandíbulas y manténgalas en una placa de Petri que contenga PBS en hielo, ya que esto mejora la viabilidad de los tejidos.</li>
	<li>Transfiera una mandíbula a una placa de Petri de vidrio y use agujas hipodérmicas desechables de 20/26 G para diseccionar el incisivo bajo un microscopio estereoscópico. Dividir la mandíbula en la línea media, cortando a través de la sínfisis. Limpie el tejido blando y muscular lejos de la superficie ósea para una mejor visualización. NOTA: Una placa de Petri de vidrio es esencial, ya que esto no embotará las agujas.</li>
	<li>Las mandíbulas obtenidas de animales menores de 10 días son más suaves y frágiles, por lo tanto, use agujas hipodérmicas desechables de 20/26 G para abrir cada mitad de la mandíbula longitudinalmente para exponer el diente incisivo. Para ratones mayores de 10 días, use pinzas para agarrar la mandíbula y romper el hueso para exponer el diente.</li>
	<li>Separe suavemente el incisivo del hueso circundante y corte el extremo proximal, que contiene el asa cervical.</li>
	<li>Corte el extremo proximal y retire el esmalte mineralizado y la matriz de dentina.</li>
	<li>Mantenga los extremos proximales recolectados en el PBS de Dulbecco en hielo hasta que estén listos para el cultivo.</li>
</ol>3. Cultura
<ol><li>Coloque cuidadosamente un rectángulo de filtro en la parte superior de una rejilla en un plato de cultivo precalentado.</li>
	<li>Use un microscopio estereoscópico para orientar adecuadamente las piezas de tejido.</li>
	<li>Colocar en una incubadora estándar a 37 °C con 5% deCO2 y 90%-95% de humedad.</li>
	<li>Cambie el medio cada dos días y reemplácelo con un medio fresco, evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Controle el crecimiento del tejido y fotografíe diariamente con una cámara conectada al estereomicroscopio.</li>
</ol>4. Adición de factores solubles al cultivo
<ol><li>Complementar el medio de cultivo con factores solubles y moléculas de interés para estudiar su efecto sobre la regulación de SCs. NOTA: El protocolo de administración de cualquier molécula (factores de crecimiento, moléculas de señalización, anticuerpos bloqueadores, compuestos farmacológicos como inhibidores o activadores, vectores, etc.) depende de su vida media y solubilidad. Estos parámetros también determinan el control apropiado que se utilizará.</li>
</ol>5. Análisis moleculares e histológicos
<ol><li>Retire el medio de cultivo.</li>
	<li>Agregue cuidadosamente metanol helado a los tejidos para evitar que se desprendan de los filtros.</li>
	<li>Dejar el metanol durante 5 min.</li>
	<li>Transfiera los filtros que transportan los explantes de tejido a los tubos de muestreo.</li>
	<li>Fijar los explantes en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-24 h a 4 °C.</li>
	<li>Proceder con los protocolos establecidos para el procesamiento histológico (parafina, congelado, etc.) o inmunotinciones.</li>
</ol>6. Cultivo de rodajas de tejido
NOTA: Hay varias variaciones de este protocolo, que son igualmente exitosas y son una cuestión de elección personal, dependiendo de la velocidad y la habilidad del usuario. Estos se refieren al tampón utilizado para recolectar y mantener la viabilidad del tejido. Para este propósito, se puede usar el tampón de Krebs, PBS suplementado con 2% de glucosa y antibióticos, o PBS. Si se utiliza tampón Krebs, debe hacerse con 1 día de antelación y mantenerse a 4 °C.
<ol><li>Antes del experimento, prepare una agarosa de bajo punto de fusión al 4% -5% disolviendo 2-2.5 g de agarosa de bajo punto de fusión en 50 ml de glucosa / PBS al 2% hirviendo, después de lo cual la solución debe colocarse en un baño maría a 45 ° C.</li>
	<li>Configure el vibratomo, lávelo con etanol al 70% y llénelo con glucosa/PBS al 2% suplementado con antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina).</li>
	<li>Diseccionar los extremos proximales del incisivo y recogerlos en el 2% de glucosa/PBS helado suplementado con antibióticos.</li>
	<li>Coloque un extremo proximal del incisivo en el molde que contenga 4% -5% de agarosa de bajo punto de fusión. Bajo un microscopio estereoscópico, oriente la pieza en la dirección deseada y déjela en hielo para que la agarosa se endurezca.</li>
	<li>Recorte el bloque de agarosa endurecido y colóquelo en el vibratomo. Cortar rodajas gruesas (150-300 μm).</li>
	<li>Recoja las rodajas en una placa de Petri que contenga 2% de glucosa/PBS helada suplementada con antibióticos.</li>
	<li>Utilizar una espátula para transferir las rodajas gruesas en un rectángulo filtrante colocado en la rejilla precalentada preparada como en la sección 1.3.</li>
	<li>Incubar las rodajas gruesas en la incubadora y proceder con la obtención de imágenes (Figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El cultivo de órganos in vitro se ha utilizado ampliamente para estudiar el potencial inductivo y las interacciones epitelial-mesenquimales que gobiernan el crecimiento de los órganos y la morfogénesis. El laboratorio de Thesleff ha demostrado cómo adaptar la modificación de Saxén del cultivo de órganos tipo Trowell y utilizarla para estudiar el desarrollo dental14. Las condiciones reproducibles y los avances en los reporteros fluorescentes han hecho de este un método útil para monitorear...

Los incisivos de ratón crecen continuamente debido a la preservación de por vida de las células madre (SC) que apoyan la producción incesante de componentes dentales. Estos incluyen SC epiteliales, que generan amemeloblastos productores de esmalte, y células madre mesenquimales (MSC), que generan odontoblastos productores de dentina, entre otras células1. Los SC epiteliales en los incisivos de crecimiento continuo se identificaron inicialmente como células que retienen la etiqueta2,3 y desde entonces se ha demostrado que expresan una serie de genes de tallo bien conocidos, incluido Sox24. Estas células comparten características comunes con los SC epiteliales en otros órganos y residen dentro del nicho SC llamado asa cervical ubicada en el lado labial del incisivo. El nicho es una entidad dinámica compuesta por células y matriz extracelular que controlan la actividad SC5. Los estudios de rastreo de linaje han demostrado que los SC epiteliales Sox2+ pueden regenerar todo el compartimiento epitelial del diente y que son cruciales para la formación de dientes sucesionales 6,7. Las MSC con potencial reparador o regenerativo de dentina son reclutadas en gran medida desde fuera del órgano a través de vasos sanguíneos y nervios 8,9,10,11, por lo tanto, proporcionando un modelo adecuado para estudiar el reclutamiento, la migración y el alojamiento de la población de MSC.
Estudiar SCs in vivo no siempre es factible, ya que muchas de las manipulaciones genéticas y/o farmacológicas pueden afectar a la homeostasis de los órganos y/o tener consecuencias letales. Por lo tanto, el cultivo de órganos proporciona una excelente herramienta para estudiar la regulación de SC y sus nichos in vitro. El sistema de cultivo de órganos que utiliza una rejilla metálica fue desarrollado inicialmente por Trowell12 para estudiar el desarrollo de órganos y ha sido modificado por Saxen13 para estudiar las señales inductivas en el desarrollo renal. Desde entonces, este método in vitro de cultivo de la totalidad o parte del órgano se ha aplicado con éxito en diferentes campos. En el campo del desarrollo dental, este método ha sido ampliamente utilizado para estudiar las interacciones epitelial-mesenquimales que gobiernan el desarrollo dental14 y la formación de dientes sucesionales15. El trabajo del laboratorio de Thesleff ha demostrado la utilidad de este sistema para el análisis temporal del crecimiento y la morfogénesis dental, para el análisis del efecto de varias moléculas y factores de crecimiento en el crecimiento dental, y para la imagen en vivo de lapso de tiempo del desarrollo dental16,17. Más recientemente, este método ha sido utilizado para estudiar la regulación de los SC incisivos y su nicho18,19, que se describe en detalle aquí.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de plástico de 1 ml Agujas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hipodérmicas desechables de calibre 20/26</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS Sudamericano (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>divida en alícuotas, almacene a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio, Steri 250 Seconds-Esterilizador</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filtros, 0,1 mmm 25 mm de diámetro</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Almacenar en etanol al 70% a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Ácido L-Ascóbico</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>diluido 100 mg/ml en MilliQ, filtro strerilizado y dividido en 20&mu; l alícuotas, almacenar en la oscuridad, -20 y grados; C</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas metálicas</td><td></td><td></td><td>Disponibles comercialmente, o de fabricación propia con malla de acero inoxidable (resistente a la corrosión, tamaño de la malla 0,7 mm). Corte un disco de aproximadamente 30 mm de diámetro y doble los bordes para dar una altura de 3 mm. Usa clavos para hacer agujeros.</td></tr><tr><td>Micro pinza</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, vidrio de Soda-Cálcica</td><td>DWK Life Sciences 9170442</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petridish 35 mm, con respiradero</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 90 mm, sin ventilación clásico</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso del cultivo de órganos tipo trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

El desarrollo, la función y la regeneración de órganos dependen de las células madre, que residen dentro de espacios anatómicos discretos llamados nichos de células madre. El incisivo de ratón en continuo crecimiento proporciona un excelente modelo para estudiar células madre específicas de tejido. Las células madre específicas del tejido epitelial del incisivo se encuentran en el extremo proximal del diente en un nicho llamado asa cervical. Proporcionan una afluencia continua de células para contrarrestar la abrasión constante de la punta autoafilada del diente. Aquí se presenta un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo del extremo proximal del incisivo de ratón que alberga células madre y su nicho. Este es un protocolo modificado de cultivo de órganos tipo Trowell que permite el cultivo in vitro de piezas de tejido (explantes), así como los cortes gruesos de tejido en la interfaz líquido / aire en un filtro soportado por una rejilla metálica. El protocolo de cultivo de órganos descrito aquí permite manipulaciones de tejidos no factibles in vivo , y cuando se combina con el uso de un informador fluorescente, proporciona una plataforma para la identificación y el seguimiento de poblaciones de células discretas en tejidos vivos a lo largo del tiempo, incluidas las células madre. Varias moléculas reguladoras y compuestos farmacológicos pueden ser probados en este sistema por su efecto sobre las células madre y sus nichos. En última instancia, esto proporciona una herramienta valiosa para estudiar la regulación y el mantenimiento de las células madre.

Los SC epiteliales residen en un nicho llamado asa cervical, que se encuentra en el extremo proximal del incisivo (Figura 3A). Los asas cervicales son estructuras morfológicamente distintas compuestas de epitelio del esmalte interno y externo que encierran el retículo estrellado, un núcleo de células epiteliales poco dispuestas (Figura 3B, C). Hay dos asas cervicales en cada incisivo (Figura 3A), pero solo el asa ce...

El método de cultivo de órganos tipo Trowell se ha utilizado para desentrañar redes de señalización complejas que gobiernan el desarrollo de los dientes y, más recientemente, para estudiar la regulación involucrada en las células madre del incisivo de ratón en continuo crecimiento. Los modelos animales de reporteros fluorescentes y los métodos de imágenes en vivo facilitan los análisis en profundidad de las células madre dentales y su microambiente de nicho específico.

Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

El cultivo de órganos tipo Trowell se utiliza para cultivar explantes de tejidos. Aquí, mostramos cómo usar este método para estudiar las células madre en dientes de crecimiento continuo. Con esta técnica, podemos estudiar las células madre y su comportamiento en el nicho y detectar el efecto de varias moléculas en la supervivencia y mantenimiento de las células madre.Este método también se puede aplicar para estudiar las células madre de otros órganos, como la piel o la glándula mamaria. Comience colocando rejillas metálicas de 30 milímetros con orificios de uno a dos milímetros de diámetro en una placa de Petri de 35 milímetros. Llene el lugar con medios hasta que el medio llegue a la superficie de la cuadrícula.Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados hasta que el tejido esté aislado y listo para cultivar. Después de decapitar al ratón, retire la piel para exponer la mandíbula y corte a través de los músculos maseteros para separar la mandíbula del maxilar y el resto de la cabeza. Una vez aislada la mandíbula, retire la lengua y el máximo tejido blando.Dividir la mandíbula en la línea media cortando a través de la sínfisis. Coloque la mandíbula en la placa de Petri que co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los...

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

El continuo crecimiento de los incisivos ratón proporciona un modelo para el estudio de la renovación de los tejidos dentales a partir de células madre epiteliales dentales (DESCs). Un sistema sólido para la obtención de manera consistente y confiable de estas células de la incisivo y expandir in vitro se informó aquí.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

Ofrecemos protocolos para la evaluación de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental e interacciones de la célula de cáncer de próstata basadas en métodos directos e indirectos de la cultura Co. Condición media y trans-bien membranas son adecuadas analizar actividad paracrina indirecta. Siembra diferencialmente teñidas células juntos es un modelo apropiado para la interacción directa de la célula.

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Este protocolo presenta un método para el cultivo y crecimiento 3D de células similares a ameloblastos en microgravedad para mantener su forma alargada y polarizada, así como la expresión de proteínas específicas del esmalte. También se describen las condiciones de cultivo para el cultivo de construcciones de ingeniería periodontal y órganos pulmonares en microgravedad.

Propagación de células y órganos dentales y respiratorios en microgravedad

Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.

Establecer organoides a partir de dientes humanos como una herramienta poderosa hacia la investigación mecanicista y la terapia regenerativa

Este artículo proporciona una guía paso a paso para establecer un cultivo primario de células madre de pulpas dentales utilizando el método de cultivo de explantes y la caracterización de estas células basada en las directrices del ICSCRT. Las células aisladas por este protocolo pueden considerarse como células madre mesenquimales para aplicaciones posteriores.

Cultivo primario de células madre de pulpa dental

Este protocolo enfatiza la extracción, el cultivo y la preservación de células madre multipotentes de la pulpa dental a través de la digestión enzimática. Además, demuestra su potencial para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, lo que pone de manifiesto la importancia de la precisión y la consistencia en el proceso.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental a partir de dientes humanos deciduos y permanentes

La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

Aprende a utilizar el cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar células madre epiteliales en el bucle cervical del incisivo de ratón. Este método permite la manipulación in vitro y el análisis de señalización Wnt en el nicho de células madre dentales.

Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

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