Construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (Engineered Reporteros CNiFERs) para la detección óptica de los neurotransmisores En Vivo

El objetivo general de este vídeo es describir la metodología para la construcción y las pruebas de reporteros fluorescentes de neurotransmisores basados en células, o CNiFER, que pueden utilizarse para monitorizar ópticamente la liberación de neurotransmisores específicos in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia sobre el momento y la liberación de neuromoduladores en el cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que se puede adaptar a cualquier tipo de neurotransmisor o neuromodulador, que señalice a través de GPCS.

La demostración regional de este método es útil. Se trata de la inyección in vivo, y las imágenes posteriores de los CNiFER son un reto técnico. Para comenzar este procedimiento, observe las células HEK293 que contienen el detector de calcio frontal y la proteína g quimérica en un matraz T-25.

Luego, cultive las células en una incubadora humidificada, a 37 grados centígrados, con un cinco por ciento de CO2, hasta aproximadamente un 50% confluente. A continuación, aspire el medio del matraz T-25. Agregue dos mililitros de la mezcla de medios del virus lenta e incube el matraz T-25 a 37 grados centígrados, con 5% de CO2.

Al día siguiente, recoja las células HEK293 infectadas añadiendo un mililitro de tripsina. A continuación, vuelva a suspender el pellet de células en cinco mililitros de medio de crecimiento HEK293. Siembre un mililitro de células en un matraz T-75 para congelación y almacenamiento, y 1,5 mililitros de células en un matraz T-25 para el análisis FACS.

Para la curva agonista de 10 puntos, para probar las células infectadas, siembre las dos primeras filas de una placa de 96 pocillos recubierta de fibronectina con 100 microlitros de suspensión celular por pocillo. A continuación, incube las células HEK293 que crecen en un matraz T-25, un matraz T-75 y una placa de 96 pocillos hasta que aproximadamente el 90% confluya a 37 grados Celsius con 5% de CO2 durante uno o dos días. Antes del análisis de FACS, determine la expresión funcional del GPCR mediante la preparación de una placa de fármaco con 10 concentraciones diferentes de agonistas que coincidan con la CE 50 predicha.

Prepare diferentes concentraciones de agonista utilizando un método de dilución en serie y cree una plantilla para realizar un seguimiento de las concentraciones del fármaco. A continuación, ajuste la temperatura del lector de placas a 37 grados centígrados. A continuación, programe el lector de placas fluorométricas de 96 pocillos para medir el traste y realizar transferencias de solución.

Para medir el traste con un sensor de calcio basado en traste codificado genéticamente, TNXXL, ajuste la longitud de onda de excitación a 436 más o menos 4,5 nanómetros. A continuación, configure los filtros de emisión y los filtros de corte para ECFP y citrino. A continuación, programe el lector de placas para que mida las emisiones cada cuatro segundos, durante un total de 180 segundos.

Elija las opciones para un volumen de placa de 100 microlíderes, una altura de pipeta de 150 microlitros y la entrega de 50 microlitros de fármaco desde la placa compuesta triple. Establezca el punto de tiempo para la administración del medicamento en 30 segundos. Después de eso, aspire los medios de las filas A y B, y agregue 100 microlitros de ACSF a la placa de rastreo de 96 pocillos, es decir, aproximadamente 90% confluente.

Luego, cargue la placa de medicamento triple y la placa de rastreo de 96 pocillos en el lector de placas. Espere 30 minutos para equilibrar las placas a 37 grados centígrados, antes de comenzar el programa. Una vez ejecutado el lector de placas, exporte los valores del lector de fluorescencia a un archivo de texto.

A continuación, importe este archivo a una plantilla de hoja de cálculo previamente creada que normalice las intensidades de la florescencia a las líneas de base previas al estímulo, calcule la relación de trastes máximos para cada concentración de agonistas y genere una curva de respuesta a la dosis. Prepare la pipeta inyectable CNiFER colocando un capilar de vidrio en un extractor de electrodos vertical. Utilice un par de pinzas para romper la punta del electrodo hasta un diámetro de aproximadamente 40 micrómetros.

Coloque una esponja empapada en ACSF en una ventana de cráneo previamente formada de dos por tres milímetros de espesor de un ratón anestesiado, para mantenerse húmeda mientras prepara las células para la inyección. A continuación, coseche el clon CNiFER que se cultivó en un matraz T-75 hasta aproximadamente un 80% de confluencia. Aspire el medio y lave las células con PBS estéril.

Retire el PBS y use 10 mililitros de ACFS para desalojar las células del fondo del matraz. A continuación, tritrique las células para disociar los grupos de células. Centrifugar durante dos minutos en una centrífuga de cultivo celular.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de ACSF. Posteriormente, centrifugar durante 30 segundos a 1400 veces G, y retirar el sobrenadante, dejando un pellet, cubierto de ACSF. Después, vuelva a llenar la pipeta de inyección con aceite mineral.

Cargue la pipeta en un nanoinyector. Coloque cinco microlitros de suspensión de células CNiFER en una tira de película de parafina plástica cerca de la preparación del ratón. Introduzca las células CNiFER en la pipeta extraída.

Ahora, mueva la pipeta a las coordenadas x e y del objetivo. Baje las pipetas y perfore el cráneo adelgazado, preparado previamente. Continúa hasta unos 200 a 400 micrómetros por debajo de la superficie del cráneo, en las capas dos y tres de la corteza.

Inyecte 4,6 nanolitros de células CNiFER en el sitio más profundo con el nanoinyector. Observe el movimiento en la interfaz entre el aceite y la celda. Y luego, espere cinco minutos para que las celdas dispensen.

Retire la pipeta aproximadamente 100 micrómetros e inyecte otros 4,6 nanolitros de células CNiFER y, de nuevo, espere cinco minutos. A continuación, retire la pipeta lenta y suavemente para evitar el reflujo de los CNiFER. En este procedimiento, coloque la plataforma de imágenes con el ratón con la cabeza sujeta debajo de un objetivo de inmersión en agua de 10x en un microscopio de imágenes de dos fotones.

Inserte el cubo de filtro para la adquisición de imágenes de trastes que tiene un espejo dicroico a 505 nanómetros y filtros de paso de banda que abarcan de 460 nanómetros a 500 nanómetros para medir ECFP y de 520 nanómetros a 560 nanómetros para medir citrino. Luego, agregue ACSF al pozo, que contiene la ventana del cráneo adelgazada y baje el objetivo de inmersión en agua 10x en el ACSF. Utilice el ocular junto con la lámpara de mercurio y el cubo de filtro GFP para localizar los CNiFER.

Ahora, cambia al objetivo de inmersión en agua 40x. A continuación, seleccione la ruta de luz adecuada para la obtención de imágenes de dos fotones. Encienda el láser de pulso de femtosegundo del infrarrojo cercano.

Seleccione la longitud de onda de 820 nanómetros y una configuración de potencia de cinco a 15%Establezca el voltaje pmt uno y pmt dos a un valor submáximo, generalmente 500-1000 voltios, dependiendo del pmt. A continuación, ajusta la ganancia a uno para cada canal y pon a cero la posición z para el objetivo. Baje el objetivo aproximadamente de 100 a 200 micrómetros de la superficie cortical e inicie el escaneo xy.

Ajuste la potencia del láser, la ganancia y el voltaje pmt para cada canal para optimizar la relación señal-ruido de la fluorescencia del CNiFER. A continuación, utilice el software para restringir las imágenes a una región que contenga las células CNiFER, así como a una región de fondo. Seleccione la línea cowman, con un promedio de dos, para obtener una relación señal/ruido adecuada, y utilice una velocidad de escaneo de 3 a un hercio a cuatro microsegundos por píxel.

Después de eso, dibuje un ROI alrededor de las celdas CNiFER. Rodeando alrededor de tres a cuatro celdas por avión. Configure un análisis en tiempo real de las intensidades medias del retorno de la inversión.

Luego, inicie la adquisición para monitorear la floración CNiFER a lo largo del tiempo y comience la estimulación eléctrica o el experimento conductual, mientras monitorea el traste. En este ejemplo, la respuesta del traste D2R CNiFER se midió en un lector de placas con un sistema de administración de solución. Este gráfico muestra la respuesta del traste durante la aplicación de dopamina a los CNiFERs D2.

Tenga en cuenta que la emisión de ECFP disminuye, mientras que la emisión de citrino aumenta con la dopamina. Y aquí hay un gráfico de la relación de trastes correspondiente. Aquí se muestran las curvas de dosis-respuesta para la respuesta de los CNiFER D2 a la dopamina y a la norepineferina.

Además, se presentan los CNiFER de control responsivos que carecen del D2R. Este gráfico de barras muestra la respuesta de la relación de trastes para otros neurotransmisores y moduladores a 50 nano molares y un micro molar. Aquí, la estimulación eléctrica de las neuronas DA en la sustancia negra, provoca un gran cambio en la relación de trastes para los CNiFERs D2.

Obsérvese cómo la amplitud de la respuesta aumenta con el aumento de la intensidad de la estimulación eléctrica. El acoplamiento de la estimulación con la inyección de cocaína aumenta la respuesta del CNiFER. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear, probar y usar CNiFER para imágenes in vivo.

A lo largo del desarrollo de CNiFERs, es fundamental mantener la técnica estéril, ya que estas células se implantarán finalmente en ratones vivos. La realización de CNiFERs proporciona una herramienta importante para los investigadores en el campo de la neurociencia para medir ópticamente la liberación de cualquier neurotransmisor, o neuromodulador, que envía señales a través de un receptor acoplado a una proteína G. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.