Name: Construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (Engineered Reporteros CNiFERs) para la detección óptica de los neurotransmisores En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende a construir CNiFERs con células HEK293 para detectar neurotransmisores en vivo mediante imagen fluorescente. Esta técnica permite monitorear dinámicas neuronales en tiempo real.

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Agradecemos a B. Conklin (Universidad de California, San Francisco) para proporcionar los qi5 G y G QS5 ADNc, A. Schweitzer para obtener ayuda con la electrónica, N. Taylor para obtener ayuda con el análisis de clones, Ian y Robert Rifkin Glaaser para la corrección de pruebas y Olivier Griesbeck para TN-XXL. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación a través del Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (NIDA) (DA029706; DA037170), el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) y el &quot;Neurociencia relacionados con las drogas de abuso beca de formación &quot;a través de NIDA (DA007315).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La creación de CNiFERs proporciona una estrategia novedosa y única para medir ópticamente liberación de neurotransmisores en el cerebro in vivo. CNiFERs son ideales para la medición de la liberación extrasináptico, es decir, la conducción volumen, por neurotransmisores. Es importante destacar que cada CNiFER posee las propiedades de la GPCR nativo, proporcionando una medición óptica fisiológica de los cambios en los niveles de neurotransmisores en el cerebro. Hasta la fecha, se han creado CNiFERs para ...

Para comprender completamente cómo se comunican las neuronas en el cerebro, es necesario disponer de un método para medir la liberación de neurotransmisores en vivo. Existen varias técnicas bien establecidas para la medición de los neurotransmisores en vivo. Una técnica comúnmente usada es de microdiálisis, en el que se inserta una cánula en el cerebro y un pequeño volumen de líquido cefalorraquídeo se recoge y se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento y detección electroquímica 1. La microdiálisis tiene una resolución espacial del orden de unos pocos diámetros de la sonda, por ejemplo, ~ 0,5 mm para una microsonda de 200 m de diámetro. La resolución temporal de esta técnica, sin embargo, es lento debido a los intervalos de muestreo que típicamente duran ~ 5 min o más 1. Por otra parte, los análisis no se realizan en tiempo real. Otra técnica es escaneado rápido voltametría cíclica (FSCV), que utiliza una sonda de fibra de carbono que se inserta en el cerebro. FSCV tiene una excelente tempresolución por vía oral (por debajo del segundo), alta sensibilidad (nanomolar), y la resolución espacial con diámetro de la sonda de 5 a 30 micras. Sin embargo, FSCV está limitada a los transmisores que producen una oxidación característica y el perfil de reducción con el voltaje en una sonda potenciométrica de carbono 2. Una tercera técnica para medir los neurotransmisores es directamente a través de neurotransmisores codificado genéticamente biosensores (NT) 3. Con este método, se crea una proteína de fusión que contiene un dominio de unión a ligando para un transmisor acoplado a una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) par de fluoróforos con base 4 o una GFP permutado 5. A diferencia de los dos métodos anteriores, estos biosensores están genéticamente codificados y expresados ​​en la superficie de una célula huésped, tal como una neurona, a través de la producción de animales transgénicos o de forma aguda con el uso de agentes virales para infectar las células. Hasta la fecha, los biosensores codificados genéticamente sólo se han desarrollado para detecting glutamato y GABA 3-5. Limitaciones con estas técnicas han sido la baja sensibilidad, en el rango nM, y la incapacidad para ampliar la detección al gran número de transmisores, por ejemplo, neurotransmisores clásicos, neuropéptidos y neuromoduladores, que señalan a través de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). De hecho, hay cerca de 800 GPCRs en el genoma humano. Para hacer frente a estas deficiencias, hemos desarrollado una herramienta innovadora para la liberación medida ópticamente de cualquier neurotransmisor que las señales a través de un GPCR. (Reporteros ingeniería neurotransmisor fluorescentes basado en células) CNiFERs son células HEK293 clonales ingeniería genética para expresar un GPCR específico que, cuando se estimula, provoca un aumento de intracelular [Ca 2 +] que es detectada por un sensor de Ca2 + a base de FRET codificado genéticamente, TN-XXL. Por lo tanto, CNiFERs transformada de unión en un cambio en la fluorescencia, proporcionando un r óptica en tiempo real directa y receptor neurotransmisoread de salida de la actividad del neurotransmisor local. Mediante la utilización del receptor nativo para un neurotransmisor determinado, CNiFERs retienen la especificidad química, la afinidad y la dinámica temporal de los receptores expresados ​​de forma endógena. Hasta la fecha, hemos creado tres tipos de CNiFERs, una para la detección de la acetilcolina mediante el receptor M1, uno para la detección de la dopamina usando el receptor D2, y uno para la detección de norepinefrina mediante el 6,7 receptor a1a. La tecnología CNiFER es fácilmente ampliable y escalable, por lo que es susceptible de cualquier tipo de GPCR. En este artículo JoVe, describimos e ilustramos la metodología para diseñar, realizar, y la prueba en vivo CNiFERs para cualquier aplicación.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Clonación: para la generación de lentivirus</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Tubo de ensayo de polipropileno de alta claridad de fondo redondo</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 mmm Filtros de células Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0.05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Placa de pocillos, fondo plano, transparente&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 placas de cultivo celular de pocillos&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux fondo transparente negro&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Flexstation</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Cloruro de acetilcolina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Norepinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Clorhidrato de dopamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamine&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamato&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Epinefrina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Sustancia P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Lector de placas de fluorescencia y software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (alto contenido de glucosa) con Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010 Cultivo de</td><td>tejidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139 Cultivo de</td><td>tejidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Pluma/estreptococo&nbsp; antibióticos</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122 Cultivo de</td><td>tejidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromicina&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1 Cultivo de</td><td>tejidos</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos CoolCell LX Caja de congelación celular de tasa controlada sin alcohol</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td>Pegamento</td>de</tr><tr><td>cianoacrilato para cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite nº 495</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>película de parafina plástica&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>Cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Nanoinyector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Electrodos de vidrio</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td> cirugía <td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>taladro de mano</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Rebabas para taladro</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>cirugía e inyección</td></tr> <tr><td>estereotáxicaBaño esterilizador</td><td>FST</td><td>18000-45, Esterilizador de perlas</td><td>calientes Cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Cámara/mascarilla de isoflurano</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Máquina anestésica de mesa con vaporizador de isoflurano, caudalímetro de O2, válvula de banda; 564-0852, cámara de inducción 16X7X7.5cm</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>visor 3D con brazo</td><td>Cirugía Zeiss</td><td></td><td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>cirugía de luz</td><td></td><td></td> de fibra óptica <td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>70 % (v/v) de alcohol</td><td></td><td></td> isopropílico <td>para cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Povidona-Yodo Almohadillas de preparación</td><td>dynarex</td><td>1108</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% (inyección, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)</td><td></td><td></td><td>cirugía y inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Buprenex (inyección) buprenorfina (0,03 &mu; g por g roedor)</td><td>Cirugía Sigma-Aldrich</td><td></td><td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Grip cemento dental</td><td>Dentsply</td><td>#675571,</td><td>cirugía 675572 e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>n.º 0 cubreobjetos</td><td>Cirugía de Fisher</td><td></td><td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>marco estereotáxico&nbsp;</td><td>Cirugía Kopf</td><td></td><td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Sonda rectal y almohadilla térmica</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, controlador de temperatura de CC,40-90-2-06, 6.5X9.5cm almohadilla térmica40-90-5D-02, termistor rectal</td><td>Cirugía de sonda e inyección estereotáxica</td></tr> placa de <tr><td>pruebas óptica para imágenes</td><td>Cirugía de Thorlabs</td><td></td><td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>cirugía y inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Kwik-Cast (Elastómero de silicona)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Sutura&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Estudiante Halsted-Mosquito Hemostáticos</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Kit cauterizador de vasos pequeños Fine Scientific</td><td>Tools</td><td>18000-00</td> cirugía <td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Esterilizadores de perlas calientes</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>cirugía e inyección</td></tr> <tr><td>estereotáxicaEstuche de instrumentos con esterilla de silicona</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td> cirugía <td>e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Recipientes de esterilización de plástico con estera de silicona</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td><td>cirugía e inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Osciloscopio de fluorescencia de platina fija 2P para in vivo</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>Imagen in vivo</td></tr><tr><td>Láser</td> <td>multifotónicoSpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee Imágenes</td><td>in vivo</td></tr><tr><td>Láser verde</td><td>Olympus</td><td>473 nm Láser</td><td>in vivo</td></tr><tr><td>Imágenes XY Base traslacional Scientifica</td><td></td><td>MMBP</td><td>Imágenes in vivo</td></tr><tr><td>FRET Cubo de filtro para YFP y CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imágenes in vivo</td></tr><tr><td>Objetivos de inmersión en agua 10x y 40x</td><td></td> Mesa <td>de aire para imágenes in vivo</td>Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td>Imágenes in vivo</td>de <td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>Jaula hermética a medida</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo</td></tr></tbody></table>

construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (engineered reporteros cnifers) para la detección óptica de los neurotransmisores<em&gt; en vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Reporteros de ingeniería a base de células fluorescentes (neurotransmisor CNiFERs) proporcionan una nueva herramienta para los neurocientíficos para detectar ópticamente la liberación de neurotransmisores en el cerebro in vivo. Un CNiFER específica se crea a partir de una célula de riñón embrionario humano que expresa de forma estable una proteína G-receptor acoplado específica, que se acopla a G q / 11 proteínas G, y una basada en FRET Ca 2+ -detector, TN-XXL. La activación del receptor conduce a un aumento en la señal de FRET. CNiFERs tienen sensibilidad nM y una respuesta temporal de segundo porque un clon CNiFER utiliza el receptor nativo para un neurotransmisor particular, por ejemplo, D2R para la dopamina. CNiFERs se implantan directamente en el cerebro, lo que les permite detectar la liberación de neurotransmisores con una resolución espacial de menos de un centenar de micras, lo que es ideal para medir la transmisión de volumen in vivo. CNiFERs también se puede utilizar para detectar otros fármacos para el potencial de reactividad cruzada en vivo. Recientemente hemos ampliado la familia de CNiFERs para incluir los GPCR que se acoplan a G i / o proteínas G. CNiFERs están disponibles para la detección de la acetilcolina (ACh), dopamina (DA) y norepinefrina (NE). Teniendo en cuenta que cualquier GPCR puede ser utilizado para crear una novela CNiFER y que hay aproximadamente 800 GPCRs en el genoma humano, como se describe aquí el procedimiento general para diseñar, realizar, y probar cualquier tipo de CNiFER.

A CNiFER se deriva de una célula de riñón embrionario humano (HEK293) que está diseñado para expresar de forma estable al menos dos proteínas: una proteína G específica de receptores acoplados (GPCR) y un codificado genéticamente sensor [2 + Ca], TN-XXL. TN-XXL se somete a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre las proteínas fluorescentes cian y amarillo, eCFP y citrino, respectivamente, en respuesta a los iones Ca2 + <su...

Se presenta un protocolo para crear reporteros de ingeniería a base de células fluorescentes (neurotransmisor CNiFERs) para la detección óptica de la liberación de neurotransmisores volumétrica.

Construcción de base de células fluorescentes de neurotransmisores (Engineered Reporteros CNiFERs) para la detección óptica de los neurotransmisores<em&gt; En Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

El objetivo general de este video es describir la metodología para la construcción y prueba de Sensores Fluorescentes Celulares de Neurotransmisores, o CNiFERs, que pueden utilizarse para monitorear ópticamente la liberación de neurotransmisores específicos in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia sobre el momento y la liberación de neuromoduladores en el cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que puede adaptarse para cualquier tipo de neurotransmisor o neuromodulador que actúe a través de GPCS.La demostración regional de este método es útil. La inyección in vivo y la posterior obtención de imágenes de los CNiFERs son técnicamente difíciles. Para comenzar este procedimiento, observe las células HEK293 que contienen el detector de calcio basado en el frente y la proteína G quimérica en un matraz T-25.A continuación, cultive las células en un incubador humedecido a 37 grados Celsius, con cinco por ciento de CO2, hasta alcanzar aproximadamente un 50 % de confluencia. Posteriormente, aspire el medio del frasco T-25. Añada dos mililitros de la mezcla de medio de lentivirus e incube el frasco T-25 a 37 grados Celsius, con 5 % de CO2.Al día siguiente, recolecte las células HEK293 infectadas agregando un mililitro de tripsina. A continuación, resuspenda el botón celular en cinco mililitros de medio de crecimiento para HEK293. Siembre un mililitro de células en un frasco T-75 para congelación y almacenamiento, y 1,5 mililitros de células en un frasco T-25 para análisis por FACS.Para la curva de agonista de 10 puntos, para probar las células infectadas, sembrar las primeras dos filas de una placa de 96 pocillos recubierta con fibronectina con 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo. A continuación, incubar las células HEK293 que crecen en un matraz T-25, un matraz T-75 y una placa de 96 pocillos hasta alcanzar aproximadamente el 90 % de confluencia a 37 grados Celsius con 5 % de CO₂ durante uno o dos días. Antes del análisis por FACS, determinar la expresión funcional del RCPG preparando una placa de fármacos con 10 concentraciones diferentes de agonista que enmarquen la CE50 predicha.Prepare diferentes concentraciones de agonista utilizando un método de dilución en serie y cree una plantilla para llevar un registro de las concentraciones de fármaco. A continuación, ajuste la temperatura del lector de placas a 37 grados Celsius. Luego, programe el lector fluorométrico de placas de 96 pocillos para medir FRET y realizar transferencias de solución.Para medir el FRET con un sensor de calcio basado en FRET codificado genéticamente, TNXXL, ajuste la longitud de onda de excitación a 436 más o menos 4,5 nanómetros. Luego, configure los filtros de emisión y los filtros de corte para ECFP y citrina. A continuación, programe el lector de placas para medir las emisiones cada cuatro segundos, durante un total de 180 segundos.Seleccione las opciones para un volumen de placa de 100 microlitros, una altura de pipeta de 150 microlitros y la entrega de 50 microlitros de fármaco desde la placa de compuesto triple. Establezca el punto de tiempo para la administración del fármaco en 30 segundos. Después, aspire el medio de los pozos A y B, y agregue 100 microlitros de ACSF a la placa de olfato de 96 pozos, que está aproximadamente al 90 % de confluencia.Luego, cargue la placa de fármacos de tres concentraciones y la placa sniffer de 96 pocillos en el lector de placas. Permita 30 minutos para que las placas se equilibren a 37 grados Celsius antes de iniciar el programa. Después de la lectura en el lector de placas, exporte los valores de fluorescencia a un archivo de texto.Luego, importe este archivo a una plantilla de hoja de cálculo previamente creada que normalice las intensidades de fluorescencia respecto a las líneas base previas a la estimulación, calcule la relación máxima de FRET para cada concentración de agonista y genere una curva de respuesta dosis-respuesta. Prepare la pipeta de inyección de CNiFER colocando una micropipeta de vidrio en un extractor de electrodos vertical. Utilice un par de pinzas para romper la punta del electrodo hasta un diámetro aproximado de 40 micrómetros.Coloque una esponja empapada en ACSF sobre una ventana delgada de cráneo de dos por tres milímetros previamente formada en un ratón anestesiado, para mantenerla húmeda mientras se preparan las células para la inyección. A continuación, recolecte el clon CNiFER que se cultivó en un matraz T-75 hasta alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia. Aspire el medio y lave las células con PBS estéril.Elimine el PBS y use 10 mililitros de ACFS para desprender las células del fondo del frasco. A continuación, triture las células para disociar los agregados celulares. Centrifugue durante dos minutos en una centrífuga para cultivo celular.Elimine el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 100 microlitros de ACSF. Posteriormente, centrifugue durante 30 segundos a 1400 ×g y elimine el sobrenadante, dejando un precipitado cubierto con ACSF. Después, rellene la pipeta de inyección con aceite mineral.Coloque la pipeta en un inyector nano. Coloque cinco microlitros de suspensión de células CNiFER sobre una tira de película de parafina plástica cerca de la preparación del ratón. Aspire las células CNiFER dentro de la pipeta estirada.Ahora, mueva la pipeta a las coordenadas x e y objetivo. Baje las pipetas y atraviese el cráneo adelgazado, preparado previamente. Continúe hasta unos 200 a 400 micrómetros por debajo de la superficie del cráneo, en las capas dos y tres de la corteza.Inyecte 4,6 nanolitros de células CNiFER en el sitio más profundo con el nanoinyector. Observe el movimiento en la interfase entre el aceite y las células. Luego, espere cinco minutos para que las células se depositen.Retire la pipeta aproximadamente 100 micrómetros e inyecte otros 4,6 nanolitros de células CNiFER y, nuevamente, espere cinco minutos. Posteriormente, retire la pipeta lentamente y con cuidado para evitar el reflujo de las CNiFER. En este procedimiento, coloque la plataforma de imagen con el ratón con la cabeza inmovilizada debajo de un objetivo de inmersión en agua de 10x en un microscopio de imagen de dos fotones.Inserte el cubo de filtro para la imagen de FRET que tiene un espejo dicróico a 505 nanómetros y filtros de paso de banda que abarcan de 460 nanómetros a 500 nanómetros para medir ECFP y de 520 nanómetros a 560 nanómetros para medir citrina. A continuación, agregue ACSF al pocillo, que contiene la ventana de cráneo delgado, y baje el objetivo de inmersión en agua de 10x hasta el ACSF. Utilice el ocular junto con la lámpara de mercurio y el cubo de filtro GFP para localizar los CNiFERs.Ahora, cambie al objetivo de inmersión en agua de 40x. A continuación, seleccione la trayectoria de luz adecuada para la imagen de dos fotones. Encienda el láser de pulsos femtosegundo de infrarrojo cercano.Seleccione la longitud de onda de 820 nanómetros y un ajuste de potencia del 5 al 15 %. Establezca el voltaje del pmt uno y del pmt dos en un valor submáximo, típicamente entre 500 y 1000 voltios, dependiendo del pmt. Luego, fije la ganancia en uno para cada canal y ponga en cero la posición z del objetivo. Baje el objetivo aproximadamente entre 100 y 200 micrómetros desde la superficie cortical e inicie el escaneo xy.Ajuste la potencia del láser, la ganancia y el voltaje del PMT para cada canal con el fin de optimizar la relación señal-ruido de la fluorescencia del CNiFER. A continuación, utilice el software para restringir la adquisición de imágenes a una región que contenga las células CNiFER, así como una región de fondo. Seleccione la línea de Cowman, promediando dos, para obtener una relación señal-ruido adecuada, y utilice una velocidad de barrido de 3 a 1 hercio con cuatro microsegundos por píxel.A continuación, dibuje una ROI alrededor de las células CNiFER. Rodee aproximadamente de tres a cuatro células por plano. Configure el análisis en tiempo real de las intensidades promedio de la ROI.Luego, inicie la adquisición para monitorear la fluorescencia de los CNiFER a lo largo del tiempo e inicie la estimulación eléctrica o el experimento conductual, mientras se monitorea el FRET. En este ejemplo, la respuesta de FRET de los CNiFER D2R se midió en un lector de placas con un sistema de entrega de soluciones. Este gráfico muestra la respuesta de FRET durante la aplicación de dopamina a los CNiFER D2.Téngase en cuenta que la emisión de ECFP disminuye mientras que la emisión de citrina aumenta con la dopamina. Y aquí se muestra un gráfico de la relación de FRET correspondiente. Se presentan aquí las curvas de respuesta a la dosis para la respuesta de los D2 CNiFERs a la dopamina y a la noradrenalina.Además, se presenta el control CNiFER sensible que carece del D2R. Este gráfico de barras muestra la respuesta de la relación FRET frente a otros neurotransmisores y moduladores a 50 nanomolares y un micromolar. Aquí, la estimulación eléctrica de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra provoca un cambio considerable en la relación FRET para los CNiFERs D2.Observe cómo la amplitud de la respuesta aumenta con una intensidad creciente de la estimulación eléctrica. La combinación de la estimulación con la inyección de cocaína potencia la respuesta del CNiFER. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear, probar y utilizar CNiFERs para imágenes in vivo.Durante el desarrollo de los CNiFERs, es esencial mantener una técnica estéril, ya que estas células serán implantadas finalmente en ratones vivos. La creación de los CNiFERs proporciona una herramienta importante para las investigaciones en el campo de la neurociencia, al permitir medir ópticamente la liberación de cualquier neurotransmisor o neuromodulador que actúe a través de un receptor acoplado a proteína G. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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