ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

この手順の全体的な目的は、ヒト扁桃腺サンプルからBおよびTリンパ球分画を得ることです。この手法は、外科的に摘出してから3時間以内に、ウイルス性疾患の病態におけるBTリンパ球分画の役割は何かといった、ウイルス学分野における重要な疑問への回答に寄与します。扁桃組織は、サプリメントを含む氷冷した滅菌HBSSを満たした50 milliliter遠心チューブに入れて研究室まで運搬してください。

その後、ヒト組織の取り扱いに推奨される適切なバイオセーフティー手順に従い、HBSSを含む新鮮なサプリメントで組織を湿らせ、扁桃腺を氷上の60 mmプラスチック細胞培養プレートに移します。ピンセットを用いて、目に見える血栓や脂肪組織、結合組織を除去し、その後、サプリメントを含む5 mLのHBSSが入った新しい60 mmプレートに扁桃腺を移します。

次に、扁桃組織の塊を3〜10 mmの断片に切り分けます。続いて、プラスチック製シリンジのプランジャー端を用いて、これらの断片を、サプリメント添加済みの新鮮なHBSS 10 mLが入った新しい60 mm細胞培養プレート上の100 µmプラスチックセルストレーナーに滑らかに移動させます。組織断片が常にHBSSに完全に浸っているように注意しながら、セルストレーナーを通して組織断片を押し出し、組織をすべて摩砕した後、ストレーナーを廃棄し、得られた細胞懸濁液を氷上の50 mLプラスチック遠心チューブに移します。

サプリメントを含む新鮮なHBSSを用いて細胞溶液を最終容量35 millilitersまで調整し、その後、室温の密度勾配溶液10 millilitersを数本の50 milliliterコニカルチューブに分注します。溶液が混ざらないように注意しながら、密度勾配の上に細胞懸濁液を静かに重層し、遠心分離によって細胞を分離させます。単核細胞は赤血球、線維芽細胞、および細胞残渣との界面にふわふわとした白い層として分離し、それらはチューブ底部の沈殿物となります。

10 mLピペットを用いて、単核細胞層を慎重に回収し、新しい50 mLチューブに移します。次に、1回あたり25 mLの氷冷PBSで細胞を3回洗浄し、最終的なペレットを15 mLのPBSで再懸濁します。生存細胞数をカウントした後、磁気ビーズ分離法により扁桃 T 細胞を単離するため、細胞を氷上に置きます。

単核細胞懸濁液を遠心分離し、1×10⁷個の細胞につき80 µLの氷冷分離バッファーでペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を滅菌済みの2 mLチューブに移し、20 µLのCD3磁気抗体を加え、細胞が懸濁状態に保たれるよう絶えず緩やかに混合しながら、4 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、細胞を5 mLの氷冷分離バッファーを含む15 mLチューブに移して洗浄します。洗浄中に、磁気セパレーターをスタンドに取り付け、カラムをマグネットにロードします。

カラムを氷冷した分離バッファー 500 µL で洗浄し、カラムの上部に 40 µm ストレーナーを設置します。次に、細胞ペレットを新鮮な分離バッファー 500 µL で再懸濁し、ストレーナーを介して細胞をカラムにロードして、B細胞を含むEITを 15 mL コニカルチューブに回収します。すべての細胞が回収チューブに通過した後、氷上に置きます。

1×10⁷個の細胞に対し、分離バッファー500 µLを用いてカラムを4回洗浄します。次回の洗浄を行う前に、カラムのリザーバーが空になるまで待機してください。最後の洗浄後、カラムを新しい15 mL回収チューブに移します。次に、カラムプランジャーを使用して分離バッファー2 mLをカラムに通してチューブに回収し、CD3陽性T細胞画分を回収します。

単離したB細胞およびt tonsor細胞分画を解析するために、CD3陽性およびCD3陰性の細胞分画をペレット化し、2回目の遠心後、0.2% BSAを添加したPBSまたはPBSA 1 mLで両方の細胞セットを洗浄します。細胞とPBSAの100 µL分注液を、FACSラベリング用の適切な数のチューブに分配し、各チューブに適切な量のFluoro 4標識モノクローナル抗体またはコントロール抗体を加えます。その後、チューブを短時間ボルテックスし、4 °Cの暗所で30分間インキュベートします。

チューブを新鮮なPBSAで2回洗浄し、その後、1%パラホルムアルデヒドで細胞染色を固定して、PCRにより細胞内のアデノウイルスDNAの存在を検出します。適切なサイクル条件でPCR増幅を行い、得られたPCR増幅産物を1.5%AGROSゲルおよびinterestate EDTAバッファーで分離します。最後に、適切な核酸染色剤を用いて得られたバンドを可視化します。

標準的なプロトコルによれば、扁桃単核細胞の分離が成功すると、抗CD20抗体および抗CD2抗体を用いてそれぞれBリンパ球およびTリンパ球集団を検出するフローサイトメトリー分析で確認されるように、高度に精製されたBNTリンパ球のサブポピュレーションが得られます。対照的に、単核細胞の分離が不十分な場合、得られる細胞画分はBリンパ球とTリンパ球の両方の細胞が混合した状態になります。前述のように、磁気ビーズで分離されたBリンパ球およびTリンパ球から、ダウンストリーム解析のためのサブポピュレーション、DNA、およびRNAを抽出することが可能です。

例えば、ここではPCRによって検出されたTONSOR Tリンパ球におけるアデノウイルスDNAの特異的検出が細胞質に示されています。単離されたtonsor B NTリンパ球からもRNAを抽出することが可能です。手法が適切に実施されていれば、一度に2つの扁桃サンプルを6時間以内に処理することができます。

この手順を実施する際は、扁桃腺サンプルを可能な限り迅速に処理することが重要です。また、洗浄ステップの回数および洗浄バッファーの容量も、良好な結果を得るための重要なパラメータとなります。本手順の後、ウイルスDNAおよびmRNAの定量的な存在に関するさらなる疑問を解消するために、qPCRやRT-qPCRなどの他の手法を実施することが可能です。

この手法により、ウイルス学分野の研究者がヒトリンパ組織におけるさまざまなウイルス種の病原性と潜伏性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヒト扁桃腺サンプルからBTリンパ球画分を分離する方法について十分に理解できるはずです。血液や組織などのスクリーニングされていないヒト由来物質を扱うことは、非常に危険である可能性があることに留意してください。

したがって、適切な安全慣行に従ってください。