Name: La medición de las respuestas fisiológicas de Drosophila Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a medir respuestas neuronales gustativas en Drosophila mediante imagen de calcio in vivo. Esta técnica permite estudiar la actividad de neuronas individuales a feromonas lipídicas en organismos intactos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (subvención NRF-RF2010-06 a J.Y.Y.).

1. Preparación de muestras <ol><li> Cruzar la línea Gal4 3,22 controlador de UAS-GCaMP5G 19 moscas (1118 w; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Deje que la cruz de crecer a 25 ° C. Nota: Generación vuela con múltiples copias de los transgenes o Gal4 UAS-GCaMP puede ayudar a aumentar la intensidad de la señal fluorescente. Una versión anterior del transgén UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostró intensidad de fluorescencia muy débil cuando se expresa bajo el control del controlador de Gr68a-Gal4. <ol><li> Recoger y separada por sexo recién eclosed moscas adultas y elevar a 25 ° C. Nota: El nivel básico de GCaMP5G florescencia es óptima en las moscas de edades comprendidas entre los 14-28 días. El aislamiento de las moscas por sexo se opone a la posibilidad de interacciones sociales que pueden influir en las respuestas neuronales. </li></ol></li><li> Anestesiar a una mosca en una corriente suave de CO 2. </li><li> Una el fLy a un cubreobjetos de vidrio colocando primero una pequeña gota de esmalte de uñas en el centro de un 0,17 mm cubreobjetos. Con cuidado, coloque una mosca en su lado de la gota de esmalte de uñas transparente y asegurar que toda la gota está cubierto por la mosca. </li><li> Realice los pasos 1.5 y 1.6 bajo un microscopio estereoscópico de disección, que se utiliza con una ampliación de 8X. </li><li> Utilice una brocha húmeda para extender una pata delantera de la mosca. Asegure la pata delantera en su posición mediante la colocación de dos finas tiras de cinta adhesiva sobre la primera y quinta segmentos tarsales (Figura 2A). Esto expondrá segmentos tarsales T2-T4 para formación de imágenes (Figura 2B). </li><li> Para neuronas imagen de la trompa, coloque una tira delgada de cinta adhesiva sobre la tribuna de la trompa para exponer el labelo (Figura 2 C, D). </li><li> Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP para evitar que la solución fluya sobre la superficie del cubreobjetos. Hacer mediciones dentro de los 30 minutos de montaje. </li></ol> 2. Preparación de EstímuloSolución <ol><li> Diluir ligandos lipófilos (como CH503, utilizado en este estudio) en una solución PBST: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Hacer una solución madre de 1 mg / ml del ligando usando PBST. Preparar todas las diluciones posteriores de la solución madre usando PBST. Nota: Dependiendo de la solubilidad del ligando de interés, pueden ser necesarias diferentes disolventes para disolver el ligando. La solubilidad de CH503 en diversos disolventes se describe en la Tabla 1. A diferencia de otros disolventes, PBST no produjo un aumento en la fluorescencia. </li></ol></li></ol> 3. La estimulación de las neuronas y gustativa Adquisición de imágenes <ol><li> Usando una pipeta de 10 l, colocar 10 l de PBST en los segmentos tarsales. Nota: Este paso humedece la pierna y evita que los segmentos tarsales a la deriva. </li><li> Utilice un sistema óptico que tiene una cámara de suficiente velocidad y sensibilidad para lograr una buena señal de fluorescencia a alta resolución en el tiempo. NOTA: Para este estudio se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio y una cámara sCMOS (ver Lista de Materiales). </li><li> Elija el segmento tarsal específico y neuronas para formar una imagen. Adquirir tres pre-estimulación confocal Z-pilas. <ol><li> Idealmente, los ajustes de adquisición de uso que son lo suficientemente rápido como para permitir la resolución tiempo máximo sin dejar de reflejar la totalidad del volumen celular. Ejemplo ajustes de adquisición son los siguientes: 200 mseg exposición, binning 2 x 2 y 6 x 0,5 m 2 secciones ópticas, capturados cada 2 s. Nota: las piernas inmovilizadas han sido fotografiadas con éxito durante un máximo de 10 minutos, a intervalos de 30 seg, sin blanqueo discernible de la señal GCaMP. Para tiempos de grabación más largos, asegúrese de que las piernas se mantienen firmemente en su lugar en el cubreobjetos. </li><li> Optimizar la potencia del láser para la más alta relación señal-ruido alcanzable con photobleaching mínima durante toda la imabio de régimen. Para los experimentos descritos aquí, utilizar un diodo de láser 491 nm (100 mW) a la transmisión de 30% para obtener imágenes de las neuronas Gr68a y gustativas ppk23 en las piernas y proboscis. Utilice 2 x 2 binning para permitir tiempos de exposición más cortos sin dejar de lograr la suficiente resolución espacial. Nota: Los ajustes de potencia láser fueron optimizados para permitir la detección del cambio de fluorescencia que van desde un aumento de 1.2 a 4.5 veces. </li></ol></li><li> Pipetear 10 l de la solución de estímulo en el segmentos tarsales. Para los experimentos de control, añadir otros 10 l de PBST. Inmediatamente adquirir 117 imágenes post-estimulación. Nota: El número de imágenes post-estimulación adquiridos se basa en la cantidad de tiempo en el que se alcanzó el máximo cambio en la fluorescencia (aproximadamente 2 min). <ol><li> Paso crítico: Mientras que la solución pipeteando en la preparación, no tocar la marcha con la punta de la pipeta ya que esto hará que la extremidad un movimiento fuera de posición. Nota: Como alternativa, utiliceun micromanipulador para posicionar con precisión un capilar de vidrio que contiene estímulo cerca del segmento tarsal a explorar. Entregar volúmenes controlados de estímulo usando un dispensador de microinyección intracelular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 4. Procesamiento y Análisis de Imágenes: Cuantificación de la respuesta <ol><li> Abrir una serie de confocal Z-pilas utilizando Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 o ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) análisis y procesamiento de imágenes de software 24. </li><li> Hacer una proyección suma de intensidad de todos los seis rebanadas Z para cada uno de los 120 puntos de tiempo. <ol><li> Seleccionar la opción &quot;Pila&quot; en &quot;Imagen&quot;. Además, seleccione la opción &quot;proyección Z&quot; e introduzca &quot;1&quot; como el segmento de inicio y &quot;4&quot; como rebanada de parada. Para el tipo de proyección, seleccione R20; suma rebanadas &quot;en el menú desplegable y seleccione&quot; Todos los marcos de tiempo &quot;. </li></ol></li><li> Definir la región de interés (ROI) mediante el uso de la herramienta de selección a mano alzada para dibujar un límite alrededor de un cuerpo celular neuronal o proyección. Haga clic en la etiqueta &quot;Analizar&quot; y seleccione la opción &quot;Administrador de retorno de la inversión&quot; en &quot;Herramientas&quot;. </li><li> Cuantificar la fluorescencia del retorno de la inversión mediante la selección de la opción &quot;Establecer mediciones&quot;, en el menú &quot;Analizar&quot; y marcando las casillas para la densidad integrada, área, media y máxima y valor de gris etiqueta. A continuación, seleccione la opción &quot;Más&quot; en el menú de gestor de retorno de la inversión, y además seleccionar la opción &quot;Multi medida&quot;. Nota: Esto generará un cuadro emergente con valores para cada uno de los parámetros seleccionados. </li><li> Compruebe los valores máximos de grises para asegurar que ninguno de los píxeles han alcanzado la saturación (por ejemplo, 65 535 para una cámara de 16 bits). NOTA: Para los experimentos se muestra en tsus papel, las respuestas se midieron ya sea desde los cuerpos celulares neuronales o proyecciones, dependiendo de donde se observó el aumento máximo en Delta F / F. </li><li> Calcular el cambio relativo máximo en la fluorescencia (Delta F / F) en el punto de tiempo t es el siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Restar el fondo de fluorescencia de cada valor F (celular). Para cuantificar la fluorescencia de fondo, medir la densidad integrada de una ROI de tamaño y la forma equivalente de una superficie de la pata delantera (o proboscis) desprovista de neuronas detectables. </li><li> Para cuantificar la fluorescencia después de la estimulación, F (celular) t, medir la densidad integrada del retorno de la inversión del cuerpo celular o proceso en el punto de tiempo &quot;t&quot; después de la estimulación. </li><li> Para cuantificar la fluorescencia pre-estimulación, F (celular) t = 0, analizar las imágenes pre-estímulo del cuerpo de la célula o proceso de la misma manera comola señal post-estimulación. Utilice la densidad integrada media de 3 imágenes para determinar F (celular) t = 0. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Se describe aquí un método para realizar las imágenes en vivo de calcio de las neuronas periféricas de Drosophila en 2 órganos sensoriales diferentes. El Ca2 + -evoked respuestas fluorescentes GCaMP en Gr68a-neuronas inducidos por el ligando feromona CH503 eran dependientes de la dosis y cuantitativa. También era posible discernir diferentes patrones de respuesta neural tales como fásica y respuestas tónicas. Se cree que las neuronas que muestran respuestas fásicas para p...

Los animales dependen de la información olfativa y gustativa para mediar en las decisiones esenciales para la supervivencia y la reproducción. La comprensión de cómo las señales chemosensory se detectan y procesan por el sistema nervioso requiere la identificación del receptor (s) sensorial y los correspondientes ligandos químicos. Drosophila detectar una asombrosa variedad de compuestos volátiles y no volátiles y son un excelente modelo en el que estudiar la fisiológico mecanismos que subyacen chemosensation. Mientras que los órganos olfativos perciben moléculas volátiles, los órganos gustativos están especializados para detectar compuestos de baja volatilidad. A continuación, presentamos un método para medir directamente las respuestas neuronales a partir de los órganos del gusto de Drosophila melanogaster a baja volatilidad, los ligandos lipofílicos. órganos gustativos de la marcha incluyen las patas delanteras, trompa, y las alas. Distribuida en la superficie de los órganos del gusto son estructuras similares a pelos conocidos como sensilla que responden a sugars, amargos, sales, agua y feromonas 8. El sensilla han sido clasificadas morfológicamente en cerdas de sabor y gusto clavijas 9. Hay alrededor de 31 cerdas gustativas en el labelo, que se clasifican en el (tipo L) de largo, corto (de tipo s) y morfologías intermedias (de tipo I). Sensilla casa 4 neuronas sensoriales de los &#39;l&#39; y &#39;s&#39; que responden fisiológicamente al azúcar (la celda S), bajas en sal (la celda L1), alto contenido de sal y compuestos amargos (la celda L2) y agua (la célula W) 10 , 11. La &quot;i&quot; casa 2 neuronas sensoriales sensilla, uno de los cuales responde tanto a baja en sal y azúcar, mientras que el otro responde a alta concentración de sal 12. Hay aproximadamente 41 sensilla gusto en los hombres y 26 en las mujeres sensilla distribuidos en cada una de las patas delanteras. Por tanto machos como hembras, hay 21 sensilla en el midleg, y alrededor del 22 sensilla en la pata trasera 13. Las neuronas gustativas cerrados por la sensilla gusto en las piernas también son classified en tipos L1, L2, W y S. Un método estándar para medir la actividad eléctrica de las neuronas individuales utiliza electrodos extracelulares o intracelulares para grabar el flujo de iones. Mediciones de electrodos permiten la función neuronal que se estudiará en organismos modelo tales como especies de Drosophila, polillas y abejas que carecen de amplias herramientas genéticas para el etiquetado de los nervios. Sin embargo, mientras que los métodos electrofisiológicos se han utilizado habitualmente para medir la actividad de Drosophila sabor sensilla 4,13,14, la aplicación de este enfoque presenta varios retos técnicos. En primer lugar, el sabor cerdas deben ser identificados en base a la morfología y ubicación espacial. Tras la identificación, las mediciones electrofisiológicas pueden verse limitadas por el pequeño tamaño de la sensilla, con acceso limitado debido a la posición, y la dificultad en la aplicación de volúmenes controlados de un estímulo químico de una muestra de cerdas. Además, la estimulación de sensilla puede generar señales de más de unaneuronal de tipo 15. En segundo lugar, la detección de señales eléctricas puede ser confundida por el ruido de fondo resultante de las vibraciones mecánicas y el ruido de los equipos electrónicos. En tercer lugar, el uso de un electrodo de afilado puede dañar la preparación mosca, si se usa incorrectamente 14. Por último, el montaje de una plataforma de electrofisiología requiere componentes electrónicos especializados para la entrega de estímulos, la grabación de la señal, y el análisis de datos y puede ser costoso. En D. melanogaster, la disponibilidad de herramientas codificados genéticamente ha facilitado el desarrollo de técnicas de imagen que permiten estudiar las respuestas de pequeñas poblaciones de neuronas. Uno de estos métodos es el uso del reportero Calexa 16. En este método, las secuencias de genes que codifican el factor de transcripción LexA-VP16 y una sensible al calcio NFAT proteínas se fusionan juntos. la activación de calcio de la fosfatasa calcineurina cataliza la fosforilación de de-NFAT y, a su vez, faciTES su importación en el núcleo. Dentro del núcleo, el dominio LexA se une a un motivo de unión LexAop-DNA que dirige la expresión de un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP), permitiendo así la identificación sostenida de las neuronas funcionalmente activados. El enfoque ha sido utilizado con éxito para medir la respuesta de los glomérulos olfativo específico en el lóbulo antenal después de la exposición de las moscas en vivo a un odorante 16. Recientemente, las respuestas fisiológicas de los receptores gustativos IR52c neuronas se miden a partir de moscas vivas utilizando Calexa 7. Sin embargo, para este estudio, fue necesario moscas de edad para un máximo de 6 semanas para mejorar la transcripción de GFP. Mientras inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la señal Calexa, este método requeriría la fijación del tejido, impidiendo así la posibilidad de formación de imágenes de células vivas. El calcio GCaMP proteína indicador codificado genéticamente también se ha utilizado ampliamente para estudiar las respuestas neuronales en un número de17 especies. El GCaMP proteína fluorescente de baja intensidad antes de la estimulación neuronal. La aplicación de un estímulo desencadena un potencial de acción en la neurona, resultando en la afluencia de Ca2 +. GCaMP, unido a Ca 2 +, sufre un cambio conformacional, haciendo que se fluorescencia con una intensidad más brillante (Figura 1). Se utilizó un enfoque de imágenes de calcio de una sola neurona recientemente desarrollado para identificar la glucosa como el ligando para las neuronas gustativas Gr61a específicos pata delantera 18. En este estudio, las patas delanteras disecados de Drosophila transgénica que expresa GCaMP en las neuronas gustativas Gr61a se cubrieron con una capa de agarosa antes de la imagen. Sin embargo, el uso de tejido diseccionado puede causar eventual resumen de expresión GCaMP, limitando así el tiempo de medición y la sensibilidad de detección. Además, puede limitar la sensibilidad de agarosa debido a los altos niveles de fondo de fluorescencia y sus propiedades de dispersión de la luz. To tratar algunos de estos inconvenientes, se describe el uso de imágenes de calcio mediada por GCaMP para registrar las respuestas fisiológicas de la pata delantera y el trompa neuronas gustativas de los animales intactos. Mostramos las respuestas fisiológicas de Gr68a y neuronas que expresan ppk23 codificado genéticamente GCaMP5G 19 a una feromona de lípidos Drosophila, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Las respuestas neuronales se miden mediante la cuantificación del aumento de la fluorescencia de la señal GCaMP5G durante la estimulación de feromonas. En este protocolo, las neuronas se crean imágenes para una duración total de 120 seg, que es suficiente para diferenciar los patrones de activación neuronal en células individuales.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Regalo de H. Amrein (Texas A& M Centro de Ciencias de la Salud, TX, EE. UU.) y J. Carlson (Universidad de Yale, CT, EE. UU.)</td></tr><tr><td>PPK23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Regalo de K. Scott (Univ. de California, Berkeley, CA, EE. UU.)</td></tr> <tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; Cubreobjetos de</td></tr><tr><td>0,17 mm (cubreobjetos Gold-Seal)Servicios de</td> <td>Microscopía Electrónica</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas, "Duro como las uñas transparente"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma PAP</td><td>Sigma-Aldrich &nbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td><td>pincel de punta fina</td></tr><tr><td>Cinta&nbsp;</td><td>Marca</td><td></td><td></td>escocesa</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich &nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, grado de laboratorio</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexano, grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr><tr>Receta de<td>PBST</td><td></td><td></td><td>descrita en la sección de protocolo</td></tr><tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Synthesis descrita en Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>Microscopio C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>(Ti-Eclipse)</td>Cabezal de escaneo de disco giratorio <td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>de código</td><td></td> abierto<td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

la medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; drosophila</em&gt; las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas uso de imagen de calcio en vivo

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

A diferencia de los mamíferos, insectos, tales como Drosophila tienen múltiples órganos del gusto. Las neuronas quimiosensriales en las piernas, trompa, las alas y ovipositor de Drosophila expresan receptores gustativos 1,2 canales iónicos, 3-6, y los receptores ionotrópicos 7 que están involucrados en la detección de señales sensoriales volátiles y no volátiles. Estas neuronas en contacto directamente con estimulantes del gusto tales como alimentos, sustancias nocivas y las feromonas y por lo tanto influyen muchos comportamientos complejos tales como la alimentación, la puesta de huevos y el apareamiento. grabaciones de electrodos y de imágenes de calcio se han usado ampliamente en los insectos para cuantificar las respuestas neuronales evocadas por estos estimulantes del gusto. Sin embargo, la electrofisiología requiere un equipo especializado y las mediciones de obtener de una sola sensillum sabor puede ser técnicamente difícil dependiendo del tipo de células, tamaño y posición. Además, la resolución de la neurona individual en Drosophila puede ser difícil de lograr ya que Hou sabor sensillase más de un tipo de neurona quimiosensorial. El método de formación de imágenes en vivo de calcio descrito aquí permite respuestas de las neuronas gustativas individuales en moscas vivas que han de medirse. Este método es especialmente adecuado para obtener imágenes de las respuestas neuronales a las feromonas de lípidos y otros tipos de ligandos que tienen baja solubilidad en disolventes a base de agua.

El indicador de calcio GCaMP se expresó genéticamente utilizando conductores ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 o. Poblaciones distintas de neuronas pata delantera y células de apoyo no neuronales son etiquetados por cada conductor (Figura 3A-C). Se observaron respuestas-ligando específico a la feromona CH503 lipofílica en Gr68a-Gal4 y las células que expresan Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). El cambio relativo en la intensidad de fluorescencia de la señal GCaMP5G <e...

Las patas delanteras y la probóscide de Drosophila contienen un rico repertorio de neuronas sensoriales gustativas. Aquí, presentamos un método que utiliza imágenes de calcio para medir las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales en la pata delantera y la probóscide de moscas vivas tras la aplicación exógena de una feromona gustativa.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

El objetivo general de este procedimiento es medir las respuestas fisiológicas de las neuronas gustativas de Drosophila frente a feromonas lipídicas. Esta técnica puede utilizarse para responder preguntas clave en neurobiología sensorial, como la identificación de ligandos para receptores gustativos huérfanos. La principal ventaja de esta técnica radica en que se pueden estudiar las respuestas de neuronas gustativas individuales en un animal intacto y vivo.Después de anestesiar la mosca, sujétela a una cubreobjetivo de 0,17 milímetros utilizando una gota muy pequeña de esmalte de uñas transparente. Aplique toda la gota en el costado de la mosca para fijarla al portaobjetos. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, utilice un pincel húmedo para extender una pata delantera de la mosca.Luego, utilizando dos tiras muy delgadas de cinta adhesiva, sujete los primeros y quintos segmentos tarsales a la laminilla. Si se van a imaginar neuronas en el probóscide, coloque otra tira delgada de cinta sobre el rostro del probóscide para exponer el labéllum. Ahora, haga una pared corta alrededor de la mosca usando un lápiz PAP.Deje que la anestesia desaparezca durante media hora antes d

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

Este video describe las imágenes de calcio in vivo en neuronas de Drosophila usando GCaMP. El clip de protocolo presentado muestra cómo registrar los cambios en la fluorescencia de GCaMP de las neuronas del cuerpo del hongo durante un experimento de acondicionamiento olfativo.

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Este video muestra un método para detectar las respuestas de las neuronas sensoriales en Drosophila utilizando imágenes de unión de ligandos y fluorescencia. Los ligandos se unen a los receptores neuronales, causando la afluencia de calcio. El calcio se une a complejos indicadores, lo que conduce a la emisión de fluorescencia, lo que confirma la respuesta neuronal al ligando.

Detección de respuestas fisiológicas de neuronas sensoriales en Drosophila

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Fuente: Ishimoto, H. et. al., Imágenes de calcio ex vivo para visualizar las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este video muestra las imágenes de calcio para estudiarDrosophila respuestas cerebrales a los neuropéptidos. Las neuronas que expresan un indicador de calcio fluorescente revelan la dinámica del calcio intracelular y las respuestas funcionales a las moléculas de señalización.

Imágenes de calcio ex vivo para estudiar las respuestas cerebrales de Drosophila a los neuropéptidos

Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila.

El calcio de imágenes en<em&gt; Drosophila</em&gt; En la activación del huevo

Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Un enfoque de imágenes de calcio permite el registro de las respuestas inducidas por el gusto en el cerebro de moscas despiertas mientras se aplica una solución al labelo. Las respuestas gustativas primarias en Drosophila melanogaster se utilizan como ejemplo, pero este protocolo se puede adaptar para estudiar neuronas aguas abajo u otras especies.

In vivo Imágenes de calcio de las respuestas neuronales inducidas por el gusto en Drosophila adulta

Presentamos protocolos de imágenes de calcio para una neurona olfativa larvaria de Drosophila , utilizando un adhesivo tisular tópico para la inmovilización. Este método mejora la estabilidad, facilitando experimentos confiables in vivo y ex vivo . Los scripts R personalizados analizan las señales de calcio, proporcionando una plataforma eficiente para la investigación neurofisiológica detallada.

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

Aprende a medir respuestas neuronales gustativas en Drosophila mediante imagen de calcio in vivo. Esta técnica permite estudiar la actividad de neuronas individuales a feromonas lipídicas en organismos intactos.

La medición de las respuestas fisiológicas de Drosophila Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo (Video) | JoVE Journal

La medición de las respuestas fisiológicas de

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