La medición de las respuestas fisiológicas de Drosophila Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

El objetivo general de este procedimiento es medir las respuestas fisiológicas de las neuronas gustativas de Drosophila a las feromonas lipídicas. Esta técnica se puede utilizar para responder a preguntas clave en neurobiología sensorial, como la identificación de los ligandos de los receptores gustativos huérfanos. La principal ventaja de esta técnica es que las respuestas de las neuronas gustativas individuales se pueden estudiar en un animal vivo e intacto.

Después de anestesiar la mosca, colócala en un cubreobjetos de 0,17 milímetros con una gota muy pequeña de esmalte de uñas transparente. Fije el lado de la mosca a la corredera usando toda la gota. A continuación, bajo un microscopio de disección, use un pincel húmedo para extender una pata delantera de la mosca.

Luego, con dos tiras muy delgadas de cinta adhesiva, asegure el primer y quinto segmento tarsiano al cubreobjetos. Si se van a obtener imágenes de las neuronas de la probóscide, coloque otra tira delgada de cinta adhesiva sobre el rostro de la probóscide para exponer el labelo. Ahora, haz una pared corta alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP.

Deje que el efecto de la anestesia desaparezca durante media hora antes de tomar medidas. Para este protocolo, prepare las diluciones necesarias de la solución de ligando madre de un miligramo por mililitro, utilizando PBST. Para comenzar el procedimiento, superponga 10 microlitros de PBST en los segmentos tarsales asegurados y expuestos.

Esto humedece la pierna y evita que se desenfoque. A continuación, concéntrese en los segmentos utilizando un sistema óptico que pueda lograr una buena señal fluorescente con una resolución de tiempo rápida, como un microscopio confocal de disco giratorio con una cámara sCMOS. Recoge tres pilas Z de preestimulación de las neuronas de interés en el segmento tarsiano.

En este ejemplo, las imágenes se capturan con exposiciones de 200 milisegundos y un agrupamiento de dos por dos en una sección de seis micras por media micra cada dos segundos. Asegúrese de optimizar la potencia del láser para minimizar el fotoblanqueo y, al mismo tiempo, permitir una alta relación señal-ruido. Aquí, un láser de 491 nanómetros y 100 milivatios funciona con una transmisión del 30%.

La señal debe ser detectable antes de la estimulación, pero no debe acercarse a la saturación. Ahora, pipetee 10 microlitros de solución de estimulación en el segmento tarsiano de interés. Mientras pipetea, tenga mucho cuidado de evitar tocar la pata o cualquier parte del cuerpo de la mosca o los tarsos se moverán de su posición.

Luego, adquiera inmediatamente las primeras imágenes posteriores a la estimulación y continúe recopilando suficientes imágenes para documentar el cambio máximo en la fluorescencia. Para el análisis, abra una serie de pilas Z confocales con el software de análisis y procesamiento de imágenes Fiji o ImageJ. Realice una proyección de suma e intensidad de todos los segmentos Z para cada uno de los puntos de tiempo.

Aquí, hay seis segmentos y 120 puntos de tiempo. Primero, seleccione la opción de pila en la imagen y luego seleccione la opción de proyección Z. Introduzca uno para el sector inicial y cuatro para el sector de parada.

Para el tipo de proyección, introduzca segmentos de suma y seleccione todos los fotogramas de tiempo. Ahora, defina una región de interés, o ROI, como un cuerpo celular o una proyección neuronal. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar alrededor de los límites de la estructura.

A continuación, haz clic en la etiqueta de análisis y selecciona la opción de gestor de ROI en herramientas. Cuantifique la fluorescencia del ROI seleccionando primero la opción establecer mediciones en el menú analizar. Marque las casillas de densidad integrada, área, valor medio y máximo de gris y etiqueta.

A continuación, seleccione la opción más en el menú del administrador de ROI y elija la opción de medición múltiple. Ahora, calcule el cambio máximo en fluorescencia para el punto de tiempo t. Para cuantificar la fluorescencia posterior a la estimulación, mida la densidad integrada del ROI.

Para t igual a cero, mida la fluorescencia previa a la estimulación de las imágenes de préntimo del ROI de la misma manera. El promedio de los valores de tres imágenes para este t es igual a cero. Para cuantificar la fluorescencia de fondo, mida la densidad integrada de un área de tejido desprovista de neuronas detectables que tenga el mismo tamaño y forma que el ROI.

Recopile un valor de fondo único para cada punto de tiempo. El indicador de calcio GCamP se expresó utilizando dos patrones de expresión de Gal4 diferentes. Cada patrón etiqueta una población distinta de neuronas de la pata delantera y células de apoyo no neuronales.

Para ambos patrones de expresión, se observaron respuestas específicas del ligando a la feromona lipofílica CH503. El cambio relativo en la intensidad de fluorescencia de la señal GCamP aumentó con concentraciones más altas de CH503. Curiosamente, una dosis de cinco nanogramos de CH503 puede suprimir la respuesta neuronal.

Las respuestas medidas de las neuronas Gr68a y ppk23 difieren. La respuesta neuronal de las neuronas marcadas con el controlador Gr68a Gal4 exhibió un patrón tónico, mientras que las neuronas ppk23 mostraron una respuesta fásica y oscilatoria en la pierna. En la probóscide, las neuronas ppk23 mostraron una respuesta tónica de inicio tardío del cuerpo celular y una respuesta oscilatoria de una proyección axonal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las respuestas fisiológicas de las neuronas gustativas individuales a las feromonas lipídicas y otros ligandos hidrofóbicos. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología quimiosensorial midan las respuestas de las neuronas gustativas individuales en Drosophila melanogaster. Con esta técnica, la actividad neuronal puede silenciarse o activarse utilizando un shibiré de temperatura controlada o un transgén TRiP a-one acoplando el microscopio de disco giratorio a una incubadora de escenario con temperatura controlada.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cinco minutos, excluyendo el tiempo que tarda la mosca en recuperarse de la anestesia. Al realizar este método, es importante fijar la mosca firmemente en el cubreobjetos sin dañar su pata delantera. Durante la toma de imágenes, es importante adquirir imágenes tan pronto como la pata delantera se estimule con una solución de feromonas.