Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este conjunto de experimentos es medir el pH somal facosomal en células vivas mediante microscopía de fluorescencia métrica proporcional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los fagocitos, como la identificación de moléculas clave en las interacciones de patógenos o el efecto de la disrupción genética o los fármacos en la fagocitosis. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de los métodos basados en la población, como los hechos o la espectroscopia, se pueden detectar efectos como los cambios en la migración de la unión de las partículas o en la heterogeneidad de los fagosomas individuales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestras terapias contra organismos químicos patógenos, ya que muchos de estos microorganismos pueden alterar el pH frágil para evitar distracciones dentro de los fagosomas. Para comenzar este procedimiento, agregue 20 miligramos de Xan seco a 10 mililitros de vórtice PBS estéril y caliente en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Luego enfriar y centrifugar a 2000 Gs durante cinco minutos.

Después de eso, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el Xan en un mililitro de PBS. Sonicar durante 10 minutos en un baño de agua. A continuación, el sonicato transfiere 500 microlitros del Xan resuspendido a dos tubos de 1,5 mililitros y los centrifuga a 11.000 Gs durante cinco minutos.

Repetir el lavado con 500 microlitros de PBS. A continuación, lavar el Xan dos veces en 500 microlitros de solución de carbonato de sodio 0,1 molar recién preparada a pH 9,3 y RESUSPENDIDO en 490 microlitros de solución de carbonato de sodio después del lavado final. Posteriormente, agregue 10 microlitros de FZ disueltos en DMSO a 10 miligramos por mililitro al vórtice Xan.

Cubrir con papel de aluminio e incubar agitando durante cuatro horas a temperatura ambiente Para eliminar el ojo suelto, primero lávese con 0,5 mililitros de DMSO más 150 microlitros de PBS, incluida la sonicación entre las etapas de lavado. A continuación, lavar con 0,5 mililitros de DMSO más 300 microlitros de PBS, luego lavar con 0,5 mililitros de DMSO más 450 microlitros de PBS seguido de PBS solo. Después de eso, agregue un microlitro de Xan a 500 microlitros de PBS y vórtice.

A continuación, añada 10 microlitros de arena xma diluida en el borde de la cámara del hemocitómetro donde se encuentra con el cubreobjetos, monte el hemocitómetro en un microscopio de campo claro equipado con un objetivo de 20 x. Concéntrese en la esquina superior izquierda que contiene 16 cuadrados y cuente todas las partículas de arena navideña en esta área. Usando un contador de cuentas, repita el procedimiento en la esquina inferior derecha.

A continuación, calcule la concentración de Xan utilizando esta ecuación. A continuación, opsonice el Xan marcado con el anticuerpo anti Xan rabioso en un vórtice de dilución de uno a 100 e incube la muestra durante una hora en un baño de agua a 37 grados Celsius. Posteriormente, cuente la arena de Navidad con un hemocitómetro y luego diluya a 100 veces 10 a la sexta partículas por mililitro.

Después de aislar los neutrófilos primarios de ratón, agregue dos veces 10 al quinto de neutrófilos al centro de un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros. Luego esparce la gota agregando 50 microlitros de medio e incuba a 37 grados centígrados durante cinco minutos para permitir que las células se adhieran. Luego, agregue un mililitro de HBSS tibio a 37 grados Celsius que contenga un inhibidor de la mieloperoxidasa.

Monte el plato en un microscopio de fluorescencia de campo amplio, equipado con un sistema de calentamiento de 37 grados Celsius y un objetivo de aceite de 40 x. Incube las células sin imágenes durante 10 minutos para permitir que las células y el equipo se equilibren. A continuación, ajuste la configuración del microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo claro con una excitación de 440 nanómetros o 490 nanómetros y una emisión de 535 nanómetros cada 30 segundos.

Después de dos minutos, agregue 10 por 10 a la arena fitzy zy de seis pulgadas en el centro del plato y continúe tomando imágenes durante 30 minutos. Después de 30 minutos, detenga la adquisición de lapso de tiempo e inicie un temporizador. Mueva el escenario y capture 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión para obtener imágenes de otras zonas vaga en cinco minutos.

En este procedimiento, descongele las soluciones de calibración y caliéntelas a 37 grados centígrados en un baño de agua. Verifique el pH con un medidor de pH y regístrese. A continuación, monte una bomba peristáltica en el plato con fondo de vidrio antes de la adquisición de la imagen.

Luego, realice microscopía de video en vivo al final del período de adquisición de 30 minutos. Encienda la bomba para eliminar la solución del plato. A continuación, añada un mililitro de la primera solución de calibración y detenga la bomba.

Espere cinco minutos hasta que la señal se estabilice. Repita el procedimiento con cada solución de calibración. Para analizar las películas de lapso de tiempo y las instantáneas de fagosomas, abra las imágenes con la imagen J.Reste el fondo en el canal 490 dibujando un pequeño cuadrado ROI en un área sin celdas.

Usando la herramienta de selección de polígonos cuadrados y haciendo clic en plugins. A continuación, la resta de BG. Cargue el mismo ROI en el canal 440 haciendo clic en editar.

A continuación, la selección seguida de la selección de restauración y se repite el procedimiento de sustracción en segundo plano. Haga una imagen con una relación de 32 bits del canal 490 dividida por el canal 440 haciendo clic en el proceso de primer clic. A continuación, la calculadora de imágenes.

Después de eso, seleccione las imágenes apropiadas en los menús desplegables de imagen uno e imagen dos. Seleccione dividir en el menú desplegable de operaciones y marque la casilla de verificación de resultados de 32 bits. Después de eso, cambie la tabla de búsqueda de codificación de colores a una codificación de color compatible con la proporción haciendo clic en la imagen, luego en las tablas.

A continuación, el arcoíris RGB. Establezca un umbral para la proporción de la imagen para eliminar los píxeles cero e infinito haciendo clic en la imagen. A continuación, ajuste seguido del umbral.

Ajuste las barras de desplazamiento para que el Xan aparezca en rojo y haga clic en aplicar, y asegúrese de que la casilla de verificación establecer píxeles de fondo a nan esté seleccionada. Si los valores de la señal de fondo y Xan producen valores de relación muy similares que dan como resultado una imagen de relación ruidosa, vuelva a agregar una pequeña cantidad de fondo al canal 440 haciendo clic en el proceso. Luego las matemáticas.

Luego agregue, luego rehaga la imagen de proporción para obtener un resultado más limpio. Como alternativa, omita la sustracción de fondo de 440 canales. A continuación, combine esta pila de relación con un canal de campo claro en una composición multicanal haciendo clic en el color de la imagen.

A continuación, fusione los canales. Seleccione la imagen de campo claro en el menú desplegable del canal gris y la imagen de proporción en el menú desplegable del canal verde. A continuación, seleccione la casilla de verificación Conservar imágenes de origen.

Después, escanee las películas de lapso de tiempo o las instantáneas comparando los canales de campo claro y relación para determinar qué fagosomas se van a analizar, dibuje un ROI alrededor de los fagosomas utilizando la herramienta de selección de polígonos ovalados y agréguelos al administrador de ROI haciendo clic en las herramientas de análisis. A continuación, el administrador de ROI, seguido de agregar posteriormente mida su relación de intensidad Xan haciendo clic en más medida múltiple y anule la selección de la casilla de verificación de una fila por corte. Para películas de lapso de tiempo.

Realice un seguimiento de las zonas FGA de una en una dibujando un control de tipo ROI M para medir cada punto de tiempo y mover el ROI cuando sea necesario para realizar un seguimiento de los valores de intensidad a lo largo del tiempo. A continuación, copie las mediciones de la ventana de resultados a una hoja de cálculo para convertir la fluorescencia en valores de pH. Después de medir la relación de 490 a 440 para los fagosomas en las películas de lapso de tiempo de calibración en una hoja de cálculo, trace los valores de relación a lo largo del tiempo.

A continuación, calcule los valores medios de la relación para todos los fagosomas dentro del campo de visión en cinco puntos de tiempo dentro de la mitad del período de tiempo correspondiente a cada solución de calibración de pH. Traza estos valores de proporción promedio de 490 a 440 contra el pH medido real combinando al menos tres calibraciones independientes en un solo gráfico. A continuación, realice un análisis de regresión no lineal para obtener una ecuación que transforme los valores de la relación a pH.

Esta figura muestra cómo se distinguen los fagosomas y el Xan ingerido. El panel de la izquierda muestra una imagen de campo claro combinada y una relación de Fitz zy de 490 a 440. Mientras que el panel derecho muestra solo la imagen de campo claro.

Los fagosomas se pueden distinguir de las partículas externas que no se colocalizan con las células o cuya fluorescencia no coincide con un centro oscuro rodeado por un anillo más brillante característico de los fagosomas en la imagen de campo claro mostrada. Estos son los cursos de tiempo típicos de los neutrófilos de tipo salvaje y HV CN un pH omal de FGA knockout en los neutrófilos de tipo salvaje, el pH neu neutro o ligeramente alcalino durante los primeros puntos de tiempo Después de la ingestión, los fagosomas de los neutrófilos HV CN one knockout pueden ser alcalinos o ácidos. Las instantáneas tomadas de 30 a 35 minutos después de la adición de los objetivos permiten calcular el pH pequeño de la población promedio a partir de un gran número de fagosomas en los histogramas de las proporciones de Fitz Xan que se muestran aquí.

Pudimos ver las diferencias en el pH diminuto entre los neutrófilos de tipo salvaje y los HVCN una vez dominados, esta técnica se puede realizar en seis horas. A partir del paso de optimización al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar las condiciones de la imagen. En primer lugar, la optimización de la concentración de anticuerpos para el paso de optimización también puede ser útil para garantizar una fagocitosis robusta después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la medición de la producción de Ross o la medición de la muerte de bacterias, para responder a preguntas adicionales como si el Ross pequeño o la capacidad del fagosoma para matar bacterias se altera junto con el pH después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de fagocitos exploraran qué factores influyen en la capacidad de las células fagocíticas para matar o procesar los materiales ingeridos para provocar más respuestas inmunitarias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar microscopía de fluorescencia geométrica para medir los parámetros fisiológicos de los fagosomas en tiempo real en células vivas.

No olvide que trabajar con inhibidores de UNIFOR y células vivas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes mientras se realiza este procedimiento.