Name: Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprende a medir el pH fagosómico en fagocitos vivos mediante microscopía de fluorescencia ratiométrica. Esta técnica permite monitorear cambios de pH en tiempo real y analizar la heterogeneidad individual de los fagosomas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores cuentan con el apoyo financiero de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia a través de una subvención operativa N° 31003A-149566 (a N.D.), y de The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust a través de una Beca para Jóvenes Investigadores (a P.N.).

Declaración de Ética: Todas las manipulaciones animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Ginebra. 1. Preparación de Metas fagocíticas <ol><li> Añadir 20 mg de zymosan se secó a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Vortex y el calor en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Enfriar y centrifugar a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 10 minutos en un sonicador de baño de agua. Transferir 500 l a dos tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min. </li><li> Repita el lavado con 500 l de PBS. El zymosan hervida puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C. </li><li> Lave zimosán dos veces en 500 l recién preparados 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 que el anterior (paso 1.2). </li><li> Resuspender en 490 l después del lavado final. Añadir 10 l de 10 mg / ml de FITC disuelto en dimetil sulfoxide (DMSO), vórtice, cubrir con papel de aluminio, y se incuba con agitación durante 4 horas a temperatura ambiente. </li><li> Para quitar colorante no fijado, lávese que el anterior (paso 1.2), primero con 0,5 ml de DMSO + 150 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 300 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 450 l de PBS, a continuación PBS solo. </li><li> Cuente zimosán utilizando un hemocitómetro. Añadir 1 l de zymosan a 500 l de PBS, vórtice, a continuación, añadir 10 l hasta el borde de la cámara de hemocitómetro, donde se encuentra con el cubreobjetos se coloca sobre la rejilla central. Montar el hemocitómetro en un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 20X. </li><li> Centrarse en la esquina superior izquierda contiene 16 cuadrados y contar todas las partículas zymosan en esta área utilizando un contador de recuento mano. Repita con la esquina inferior derecha. Calcular la concentración zymosan usando la siguiente ecuación: concentración Zymosan = Cantidad / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Zimosán marcado puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C. </li><li> Opsonizar el wi zimosán etiquetadoth un conejo anticuerpo anti-zymosan en 1: 100 dilución. Vortex e incubar durante 1 hora en un 37 ° C baño de agua. Lavar con 500 l de PBS que el anterior (paso 1.2). Nota: La sonicación es muy recomendable, sobre todo después de la opsonización, como zimosán tiende a formar montones que pueden hacer análisis más difíciles más adelante. Opsonización con 65% v / v de rata o de suero humano se puede utilizar como una alternativa. </li><li> Contar zymosan usando un hemocitómetro como se describe en los pasos 1,7-1,8, y se diluye hasta 100 x 10 6 partículas / ml. Opsonización con otros estimuladores fagocíticas, como complemento o no la opsonización, se puede realizar alternativamente. </li></ol> 2. Live Video Microscopía <ol><li> Aislar neutrófilos primarios de ratón como se describe en detalle en otra parte 38. <ol><li> También puede utilizar cualquier tipo de célula fagocítica. Mantener los neutrófilos en hielo en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a una concentración de 10 x 10 6 células / ml hasta que esté listo para su uso. Otros tipos de células se pueden sembrar 1-4 días antes. </li></ol></li><li> Añadir 2 x 10 5 (20 l) de los neutrófilos hacia el centro de un plato de fondo de vidrio 35 mm, se extendió la caída mediante la adición de 50 l de medio y se incuba a 37 ° C durante 5 min para permitir que las células se adhieran. </li><li> Añadir 1 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) se calentaron a 37 ° C que contiene la específica MPO hidrazida inhibidor 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 M). Los inhibidores no específicos de la MPO, como azida de sodio (5 mM), también se pueden utilizar, pero se han sugerido recientemente para ejercer efectos no específicos adicionales en pH 39. </li><li> Montar el plato en un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un sistema de calefacción C 37 ° y un objetivo de aceite de 40X. Se incuban las células sin formación de imágenes durante 10 min para permitir que las células y los equipos se equilibren. </li><li> Ajuste la configuración de microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo brillante [phase o contraste de interferencia diferencial (DIC), si está disponible] con 440 nm o 490 nm de excitación y 535 nm de emisión cada 30 segundos. </li><li> Ajuste el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de acuerdo con el sistema de microscopio para evitar el exceso de fotoblanqueo y fototoxicidad y en función de las preguntas experimentales se preguntó. Comience la adquisición de imágenes. </li><li> Después de 2 min, añadir 10 x 10 6 (50 l) opsonizado-FITC zymosan al centro del plato. Ajuste de destino: proporciones de células dependiendo del tipo de fagocito y de destino utilizado. </li><li> Continuar de imágenes para 30 min. Después de 30 minutos detener la adquisición de lapso de tiempo y comenzar un temporizador. Mueva el escenario y capturar 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión de imagen otros fagosomas, todo dentro de 5 min. </li></ol> 3. Los experimentos de calibración y control <ol><li> Preparar las soluciones de calibración pH (recetas se describen en la Tabla 1) antes del día del experimento y congelar en alícuotas de 10 ml.Descongele las soluciones de calibración y caliente a 37 ° C en un baño de agua. Comprobar el pH con un medidor de pH y registrar el pH real de las soluciones. </li><li> Montar una bomba peristáltica en la parte inferior plato de cristal antes de la adquisición de la imagen y realizar microscopía de vídeo en directo como se describe anteriormente (sección 2). </li><li> Al final del período de adquisición de 30 min encienda la bomba para eliminar la solución dentro del plato, añadir 1 ml de la primera solución de calibración y detener la bomba. </li><li> Espere hasta que la señal se estabiliza, por lo general 5 min. Repita el procedimiento con cada solución de calibración. <ol><li> Realizar al menos una calibración por día experimental, y calibrar comenzando con el más alto pH y secuencial de trabajo a la más baja, así como a partir de la pH más bajo y trabajando de forma secuencial hacia el más alto. </li></ol></li><li> Como control, añadir 100 l de 100 mM de yoduro de propionium difenil inhibidor de la NADPH oxidasa (DPI) diluido en HBSS a las células en 900 l de HBSS en el plato de fondo de vidrio, yincubar durante 10 min. </li><li> Comience adquisición y añadir zimosán que el anterior (paso 2.7). Después de 15 min de la fagocitosis, añadir 10 l de 10 mM inhibidor de la V-ATPasa concanamycin A (ConcA) diluido en HBSS y continuar de imágenes para un adicional de 15 min. </li></ol> 4. Análisis <ol><li> Análisis de películas a intervalos y las instantáneas fagosoma. Nota: Las siguientes instrucciones son específicas para ImageJ. Paso a paso las instrucciones pueden variar ampliamente dependiendo del software utilizado, pero las funciones descritas en esta sección están disponibles en la mayoría de software de análisis de imagen profesional. <ol><li> Abra las imágenes con software de análisis de imagen profesional. Reste el fondo en el canal 490 dibujando una pequeña ROI cuadrado con la herramienta de selección poligonal cuadrados en una zona donde no hay células, y haciendo clic en Plugins&gt; BG Sustracción de retorno de la inversión. Luego cargue el mismo ROI en el canal 440 haciendo clic en Editar&gt; Cambios&gt; Restaurar selección y repetir. </li><li>Hacer una imagen de relación de 32 bits del canal de 490 dividido por el canal 440 haciendo clic en Proceso&gt; Calculadora Imagen ..., la selección de las imágenes apropiadas en los menús desplegables Image1 y Image2, luego seleccionando &quot;brecha&quot; en el menú desplegable de la Operación y comprobar el resultado casilla 32-bit (float). </li><li> Cambie la tabla de consulta de códigos de colores para un código de colores compatibles con relación haciendo clic en Imagen&gt; tablas de búsqueda&gt; Rainbow RGB. Umbral de la imagen relación de eliminar 0 e infinito píxeles haciendo clic en Imagen&gt; Ajustar&gt; Umbral .... Ajuste las barras de desplazamiento para que zimosán aparece en rojo y haga clic en Aplicar, asegurándose de que los valores de ajuste píxeles de fondo casilla NaN a se selecciona. </li><li> Combine esta relación pila con el canal de campo brillante en un compuesto de varios canales haciendo clic en Imagen&gt; Color&gt; Combinar Canales, y la selección de la imagen de campo brillante en el menú desplegable canal gris y la imagen de relación en el menú desplegable canal verde, y la selección de laMantenga imágenes fuente casilla de verificación. Analiza las películas a intervalos o instantáneas para determinar qué fagosomas se van a analizar. El canal de campo brillante es útil para esto. </li><li> Dibuje las regiones de interés (ROI) mediante la herramienta de selección poligonal óvalo alrededor fagosomas, y añadirlos a la gerente ROI haciendo clic en Análisis&gt; Herramientas&gt; Administrador ROI&gt; Agregar. Mida su relación de intensidad zimosán haciendo clic en Más&gt; Multi-Medida y de-seleccionar la una fila por cada rebanada de casilla. </li><li> Para las películas de lapso de tiempo, los fagosomas pista uno a la vez mediante la elaboración de un retorno de la inversión, tecleando Ctrl + M para medir cada punto de tiempo, y moviendo el retorno de la inversión cuando sea necesario para realizar un seguimiento de los valores de intensidad con el tiempo. Copie las mediciones de la ventana Resultados en una hoja de cálculo. Nota: El análisis de los 15 (5 cursos de tiempo por experimento x 3) experimentos independientes es ideal, pero más o menos puede ser necesaria en función de la variabilidad observada. Salvando las regiones de interés es siempre recomendable. Algunos paquetes de software permiten regi imagentración y actualización dinámica de rendimiento de la inversión, facilitando de esta parte del análisis. </li></ol></li><li> La conversión de fluorescencia para valores de pH <ol><li> Medir la relación 490/440 para fagosomas en las películas a intervalos de calibración como se describe en la sección 4.1. </li><li> En una hoja de cálculo, trazar los valores de la relación con el tiempo, y calcular los valores medios de relación de todos los fagosomas dentro del campo de visión (por lo general, entre 5-20) a partir de 5 puntos de tiempo dentro de la mitad del período de tiempo correspondiente a cada calibración pH solución. (Véanse también las cajas de color rojo en la figura 5A.) </li><li> Trazar estos medios 490/440 valores de la relación contra el pH medido real. Combine por lo menos 3 calibraciones independientes en un solo gráfico. Use un paquete de software estadístico o numérica para realizar una regresión no lineal (curva de mejor ajuste), por lo general a una ecuación sigmoidal. Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación utilizada fue una sigmoidal Boltzmann [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], donde los valores de Y son los 490/440 ratios, X son los valores de pH y la parte superior, inferior parámetros V50 y pendiente son calculados por el software. </li><li> Utilice la ecuación obtenida para transformar valores de la relación de pH. Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación obtenida para la curva de calibración en presencia de azida de sodio es 490/440 = 1,103 + Ratio [(2,89 a 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Resolviendo para pH da la siguiente ecuación: pH = 6.993 - 0,9291 * [ln ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li>
<li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li>
<li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li>
<li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+and+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fhydrogen+exchanger%3A+a+possible+mediator+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li>
<li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channels%2C+including+ClC-3%2C+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function%2C+phagocytosis%2C+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li>
<li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets%3A+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li>
<li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome%3A+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li>
<li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li>
<li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li>
<li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li>
<li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li>
<li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li>
<li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+activity%2C+counterion+conductance%2C+and+H%2B+%27leak%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li>
<li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li>
<li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li>
<li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+meets+prey%3A+uptake%2C+internalization%2C+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li>
<li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li>
<li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li>
<li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+%28AIM%29+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670(2013).</li>
<li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Res+Opin%22%5BJournal%5D)">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSOP%2FHv1+proton+channels+sustain+calcium+entry%2C+neutrophil+migration%2C+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock%3A+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li>
<li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque más lento que los métodos alternativos, como la espectroscopia y FACS, que emplean una estrategia similar de uso de un colorante sensible al pH, junto a los objetivos, pero miden el pH promedio de una población de fagosomas, microscopía ofrece varias ventajas. En primer lugar es que interna y externa obligado, pero no interiorizada, las partículas pueden ser fácilmente distinguido sin tener que añadir otros productos químicos, tales como tripán azul o anticuerpos, para calmar o etiquetar partículas externas, resp...

La fagocitosis, el proceso a través del cual las células inmunitarias innatas engullen partículas grandes, evolucionó a partir del mecanismo de alimentación de los organismos unicelulares, e implica unirse a un objetivo, envolverlo con una membrana y pellizcar la membrana para formar una vacuola dentro del citosol llamada fagosoma. Mientras que la membrana fagosomal se deriva de la membrana plasmática, la clasificación activa de proteínas y lípidos, así como la fusión con endomembranas durante la formación de fagosomas, transforman el fagosoma en un orgánulo distinto dentro de la célula con propiedades degradativas que permiten la eliminación, neutralización y descomposición del material ingerido1-3. Este proceso, llamado maduración fagosomal, se basa en la entrega de una gran cantidad de enzimas proteolíticas y microbicidas, incluida la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, que transfiere electrones a los fagosomas que producen el oxidante fuerteO2- y sus especies reactivas derivadas de oxígeno (ROS) 2,4. 
El pH luminal de los fagosomas tiene una profunda influencia en varios eventos necesarios para la función del fagosoma. En primer lugar, el pH influye en el tráfico de endomembranas en general, ya que los cambios conformacionales dependientes del pH de los reguladores del tráfico transmembrana alteran el reclutamiento de determinantes del tráfico como Arfs, Rabs y proteínas de la cubierta vesicular, que a su vez definen qué vesículas pueden fusionarse con los fagosomas 5-8. En segundo lugar, la composición iónica del lumen fagosomal también se transforma a medida que los fagosomas maduran, y algunos transportadores de iones, como el intercambiador de Na+/H+ o los antiportadores Cl-/H+ de la familia ClC, que promueven la función fagocítica, dependen de la translocación de H+ 9,10. Del mismo modo, la producción de ROS está íntimamente relacionada con el pH fagosomal. Las ROS y sus subproductos oxidantes tóxicos han sido reconocidos durante mucho tiempo como cruciales para la muerte fagosomal en los neutrófilos 4,11,12, y se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en otros fagocitos, incluidos los macrófagos, las células dendríticas (CD) y las amebas 13-16. La NADPH oxidasa es una enzima electrogénica que libera H+ en el citosol a medida que se consume NADPH, y que requiere la transferencia simultánea de H+ a través de canales HVCN1 asociados junto con los electrones transportados al lumen fagosomal, con el fin de aliviar la despolarización masiva que de otro modo conduciría a la autoinhibición de la enzima 17-21. Finalmente, varias enzimas proteolíticas tienen una actividad óptima a diferentes pH, por lo que los cambios en el pH fagosomal dependientes del tiempo pueden influir en qué enzimas están activas y cuándo. La importancia del pH fagosomal es resaltada por organismos como Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis y Salmonella typherium que subvierten la muerte fagocítica al menos en parte al alterar el pH fagosomal 22-24.
En los mamíferos, los fagocitos principales son los neutrófilos, los macrófagos y las células dendríticas, y dependiendo del tipo de célula, los cambios en el pH fagosomal dependientes del tiempo pueden variar ampliamente y parecen desempeñar diferentes funciones. En los macrófagos, una acidificación fuerte y rápida mediada por la ATPasa vacuolar (V-ATPasa) de la bomba de protones dependiente de ATP es uno de los factores clave que median la muerte 25-27, asemejándose a los mecanismos presentes en las amebas que utilizan la fagocitosis como mecanismo de alimentación 28. En estas células, se cree que la activación de las proteasas ácidas desempeña un papel clave. Por el contrario, la eliminación de neutrófilos depende más de las ROS que del HOCl producido por la mieloperoxidasa (MPO)11, y el pH permanece neutro o alcalino durante los primeros 30 min, acidificándose solo más tarde 29,30. Se ha sugerido que el pH neutro favorece la actividad de las proteasas oxidativas, como ciertas catepsinas. En las CD, el pH fagosomal es controvertido, ya que algunas reportan acidificación y otras pH neutro o alcalino 31,32, pero las ROS y el pH pueden influir profundamente en la capacidad de estas células para presentar antígenos a las células T, una de sus principales funciones 33. 
Es importante destacar que las hormonas, quimiocinas y citocinas pueden producir eventos de señalización que inducen la maduración y cambios en el comportamiento de los fagocitos, y a su vez influyen en el pH fagosomal 34,35. Del mismo modo, los fármacos, por ejemplo la cloroquina antipalúdica, que también se considera para las terapias contra el cáncer 36, pueden afectar al pH fagosomal y, por lo tanto, a los resultados inmunitarios. Por lo tanto, una variedad de biólogos celulares, inmunólogos, microbiólogos y desarrolladores de fármacos pueden estar interesados en medir el pH fagosomal cuando buscan comprender los mecanismos subyacentes a los efectos de una disrupción genética particular, un compuesto bioactivo o un microorganismo en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. 
Aquí describimos un método para medir el pH fagosomal en neutrófilos que nos permitió mostrar la importancia del canal HVCN1 en la regulación del pH fagosomal de neutrófilos 19. El método se basa en la propiedad radiométrica del isotiocianato de fluoresceína (FITC), cuya emisión de fluorescencia a 535 nm es sensible al pH cuando se excita a 490 nm, pero no a 440 nm 37. Cuando este colorante se acopla químicamente a un objetivo, en este caso zymosan, se puede seguir mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio, donde se obtienen imágenes de las células a medida que fagocitan, y los cambios de pH fagosomal se miden en tiempo real a medida que el fagosoma madura. A continuación, se obtiene el pH real mediante la realización de un experimento de calibración en el que las células que se han fagocitado se exponen a soluciones de diferente pH que contienen los ionóforos nigericina y monensina, que permiten el rápido equilibrio del pH dentro de los fagosomas con la solución externa. A continuación, los valores de la relación se comparan con el pH conocido de las soluciones, se construye una curva de calibración mediante regresión no lineal y la ecuación resultante se utiliza para calcular el pH a partir del valor de la relación.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-zymosan (reactivo oponizante de biopartículas Zymosan A)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 es un producto equivalente. Alternativamente, se puede utilizar un suero al 25% como reactivo oponizante.</td></tr><tr><td>4-Hidrazida aminobenzoica (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Cloruro de difenileniodonio (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Concanamicina A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Tóxico, use guantes, existen varios proveedores</td></tr><tr><td>La solución salina de equilibrio de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>La solución salina equilibrada de Ringer u otros tampones fisiológicos claros pueden ser sustituido.</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Existen varios proveedores</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Existen</td></tr> <tr><td>varios proveedoresPlacas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &micro;-clear se pueden sustituir por placas o cubreobjetos con cámaras de imagen adecuadas</td></tr><tr><td>Baño de agua Sonicating</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>En su lugar, se puede utilizar un sonicador, existen varios proveedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Heamocitómetro</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Existen</td></tr> <tr><td>varios proveedores de instrumentosMicroscopio de imagen en vivo de campo amplio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Existen varios proveedores de instrumentos, pero el microscopio debe ser capaz de obtener imágenes de excitación/emisión 440/535 respectivamente. Las configuraciones confocales de disco giratorio con capacidades de campo claro pueden sustituirse, pero el zymosan tiende a desenfocarse con más frecuencia. &nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Existen varios proveedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Existen varios proveedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Manual</td><td>Counter Milian SA</td><td></td><td>Existen varios proveedores de instrumentos</td></tr></tbody></table>

medición de ph fagosoma por ratiometric microscopía de fluorescencia

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

La fagocitosis es un proceso fundamental a través del cual las células inmunitarias innatas engullen las bacterias, células apoptóticas u otras partículas extrañas con el fin de matar o neutralizar el material ingerido, o presentarlo como antígenos e iniciar la respuesta inmune adaptativa. El pH de los fagosomas es un parámetro crítico regulación de fisión o fusión con endomembranes y la activación de las enzimas proteolíticas, eventos que permiten la vacuola fagocítica a madurar en un orgánulo degradativa. Además, se requiere la translocación de H + para la producción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son esenciales para la matanza eficiente y señalización a otros tejidos del huésped. Muchos patógenos intracelulares subvierten asesinato fagocitosis mediante la limitación de la acidificación phagosomal, destacando la importancia del pH en la biología fagosoma. Aquí se describe un método radiométrico para la medición de pH phagosomal en los neutrófilos utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con zymosan como targ fagocíticaets y imágenes de células vivas. El ensayo se basa en las propiedades de fluorescencia de FITC, que se inactivó mediante pH ácido cuando se excita a 490 nm pero no cuando se excita a 440 nm, lo que permite la cuantificación de una relación dependiente del pH, en vez de la fluorescencia absoluta, de un solo colorante. También se proporciona un protocolo detallado para llevar a cabo en la calibración de tinte situ y la conversión de la relación de a valores de pH real. Métodos radiométricos de un solo tinte se consideran en general superior a la longitud de onda única o protocolos pseudo-radiométrica de doble tinte, ya que son menos sensibles a las perturbaciones tales como blanqueo, se centran cambios, variaciones láser y etiquetado irregular, que distorsionan la señal medida. Este método se puede modificar fácilmente para medir el pH en otros tipos de células fagocíticas, y zymosan puede ser reemplazado por cualquier otra partícula que contiene amina, a partir de perlas inertes a los microorganismos vivos. Por último, este método puede ser adaptado para hacer uso de otras sondas fluorescentes sensibles a diferentes intervalos de pH o de otros phagosomactividades al, por lo que es un protocolo generalizado para la proyección de imagen funcional de fagosomas.

Los siguientes son resultados representativos de un experimento en el que el pH phagosomal de los neutrófilos primarios de ratón aislado de la médula ósea de tipo salvaje o Hvcn1 - / - los ratones fueron comparados. Para un experimento exitoso, es importante obtener suficientes fagosomas dentro del campo de visión durante toda la duración de la película de lapso de tiempo, evitando al mismo tiempo demasiados fagosomas, que más tarde serán más difíciles de segmento durante el análisis de im...

El pH fagosomal influye en la maduración del fagosoma, la producción de oxidantes, la eliminación del fagosoma y la presentación de antígenos. Aquí describimos un método radiométrico para medir los cambios de pH en el curso del tiempo y el punto final en fagosomas individuales en fagocitos vivos utilizando microscopía de fluorescencia.

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

El objetivo general de este conjunto de experimentos es medir el pH fagosomal en células vivas utilizando microscopía de fluorescencia ratiométrica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los fagocitos, como la identificación de moléculas clave en las interacciones con patógenos o el efecto de la alteración genética o de fármacos sobre la fagocitosis. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de los métodos basados en poblaciones como FACS o espectroscopía, se pueden detectar efectos tales como cambios en la migración o unión de partículas, o en la heterogeneidad de los fagosomas individuales.La implicación de esta técnica se extiende a nuestras terapias contra organismos químicos patógenos, ya que muchos de estos microorganismos pueden alterar el pH fagosómico para evitar su destrucción dentro de los fagosomas. Para comenzar este procedimiento, agregue 20 miligramos de Xan seco a 10 mililitros de PBS estéril, vortexee y caliente en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Luego, enfríe y centrifugue a 2000 Gs durante cinco minutos.A continuación, elimine el sobrenadante y re suspenda el Xan en un mililitro de PBS. Someta la muestra a ultrasonido durante 10 minutos en un baño de agua. Luego de la sonicación, transfiera 500 microlitros del Xan re suspendido a dos tubos de 1,5 mililitros y centrifugue a 11.000 G durante cinco minutos.Repita el lavado con 500 microlitros de PBS. Luego lave el Xan dos veces en 500 microlitros de solución recién preparada de carbonato de sodio 0,1 molar a pH 9,3 y RESUSPENDA en 490 microlitros de solución de carbonato de sodio tras el lavado final. Posteriormente, añada 10 microlitros de FZ disuelto en DMSO a 10 miligramos por mililitro al vórtex del Xan.Cubra con papel de aluminio e incube con agitación durante cuatro horas a temperatura ambiente. Para eliminar el ojo no unido, lave primero con 0,5 mililitros de DMSO más 150 microlitros de PBS, incluyendo sonicación entre los pasos de lavado. A continuación, lave con 0,5 mililitros de DMSO más 300 microlitros de PBS, luego lave con 0,5 mililitros de DMSO más 450 microlitros de PBS, seguido de PBS solo. Después de eso, agregue un microlitro de Xan a 500 microlitros de PBS y vortexee.Luego, agregue 10 microlitros de arena xma diluida al borde de la cámara del hemocitómetro donde se encuentra con la cubierta. Monte el hemocitómetro en un microscopio de campo claro equipado con un objetivo de 20 x. Enfóquese en la esquina superior izquierda que contiene 16 cuadrados y cuente todas las partículas de arena xma en esta área. Utilizando un contador manual, repita el procedimiento en la esquina inferior derecha.Luego, calcule la concentración de Xan utilizando esta ecuación. A continuación, opsonice la Xan marcada con el anticuerpo antirrábico anti-Xan a una dilución de uno a 100 mediante vortex y incube la muestra durante una hora en un baño de agua a 37 grados Celsius. Posteriormente, cuente las partículas de xmas utilizando un hemocitómetro y luego dilúyalas a 100 veces 10 a la sexta partículas por mililitro.Después de aislar los neutrófilos primarios de ratón, agregue dos veces 10 a la quinta de neutrófilos al centro de un recipiente de vidrio de 35 milímetros con fondo de vidrio. Luego, distribuya la gota agregando 50 microlitros de medio e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos para permitir que las células se adhieran. Posteriormente, agregue un mililitro de HBSS calentado a 37 grados Celsius que contenga inhibidor de mieloperoxidasa.Monte el cultivo en un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un sistema de calentamiento a 37 grados Celsius y un objetivo de inmersión en aceite de 40x. Incube las células sin realizar imágenes durante 10 minutos para permitir que las células y el equipo alcancen el equilibrio. A continuación, ajuste la configuración del microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo claro con excitación a 440 nanómetros o 490 nanómetros y emisión a 535 nanómetros cada 30 segundos.Después de dos minutos, agregue 10 veces 10 a la seis partículas de arena fitzy zy al centro del platillo y continúe la adquisición de imágenes durante 30 minutos. Después de 30 minutos, detenga la adquisición de lapsos de tiempo e inicie un temporizador. Mueva la platina y capture 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión para imaginar otras zonas vaga dentro de los cinco minutos siguientes.En este procedimiento, descongele las soluciones de calibración y caliente a 37 grados Celsius en un baño de agua. Verifique el pH con un medidor de pH y regístrelo. A continuación, monte una bomba peristáltica sobre el recipiente de vidrio con fondo de vidrio antes de la adquisición de imágenes.Luego, realice microscopía de video en vivo al final del período de adquisición de 30 minutos. Encienda la bomba para eliminar la solución del recipiente. Posteriormente, agregue un mililitro de la primera solución de calibración y detenga la bomba.Espere cinco minutos hasta que la señal se estabilice. Repita el procedimiento con cada solución de calibración. Para analizar las películas de lapsos de tiempo y las imágenes fijas de fagosomas, abra las imágenes con ImageJ. Reste el fondo en el canal de 490 dibujando un área rectangular pequeña (ROI) en una zona sin células.Utilice la herramienta de selección de polígono cuadrado y haga clic en complementos. Luego, reste el fondo. Cargue la misma ROI en el canal 440 haciendo clic en editar.Luego seleccione, seguido de restaurar la selección y repita el procedimiento de sustracción del fondo. Cree una imagen de relación de 32 bits del canal 490 dividido por el canal 440 haciendo clic primero en Procesar. Luego en Calculadora de imágenes.A continuación, seleccione las imágenes adecuadas en los menús desplegables de imagen uno e imagen dos. Seleccione dividir en el menú desplegable de operación y marque la casilla de resultado de 32 bits. Después, cambie la tabla de búsqueda de codificación de colores a una codificación de colores compatible con la relación haciendo clic en imagen y luego en tablas ascendentes.Luego arcoíris RGB. Establezca un umbral para la imagen de razón para eliminar píxeles cero e infinito haciendo clic en la imagen. A continuación, ajuste y luego umbral.Ajuste las barras de desplazamiento para que la Xan aparezca en rojo y haga clic en aplicar, y asegúrese de que la casilla establecer píxeles de fondo a nan esté seleccionada. Si los valores de señal de fondo y de Xan producen valores de razón muy similares, lo que resulta en una imagen de razón ruidosa, agregue nuevamente una pequeña cantidad de fondo al canal 440 haciendo clic en procesar. Luego matemáticas.Luego agregue y vuelva a crear la imagen de relación para obtener un resultado más limpio. Alternativamente, omita la sustracción del fondo del canal 440. A continuación, combine esta pila de relaciones con un canal de campo claro en un compuesto multicanal haciendo clic en color de la imagen.Luego combine los canales. Seleccione la imagen de campo brillante en el menú desplegable del canal gris y la imagen de relación en el menú desplegable del canal verde. A continuación, seleccione la casilla de verificación para mantener las imágenes originales.Posteriormente, escanee las películas de lapso de tiempo o las imágenes fijas comparando los canales de campo brillante y de razón para determinar qué fagosomas deben analizarse, dibuje una ROI alrededor de los fagosomas utilizando la herramienta de selección de polígono ovalado y agréguelos al administrador de ROI haciendo clic en las herramientas de análisis. Luego, el administrador de ROI, seguido de agregar; posteriormente, mida su relación de intensidad Xan haciendo clic en más mediciones múltiples y desactive la casilla de verificación de una fila por corte. Para películas de lapso de tiempo.Realice un seguimiento de las zonas de FGA una a la vez dibujando un control de tipo ROI M para medir cada punto temporal y mueva el ROI cuando sea necesario para rastrear los valores de intensidad a lo largo del tiempo. Luego, copie las mediciones de la ventana de resultados a una hoja de cálculo para convertir la fluorescencia en valores de pH. Después de medir la relación de 490 a 440 para los fagosomas en las películas cronológicas de calibración en una hoja de cálculo, grafique los valores de la relación en función del tiempo.Luego, calcule los valores promedio de la relación para todos los fagocitos dentro del campo de visión en cinco puntos de tiempo en la parte media del período correspondiente a cada solución de calibración de pH. Represente gráficamente estos valores promedio de la relación 490 a 440 frente al pH medido real combinando al menos tres calibraciones independientes en un solo gráfico. A continuación, realice un análisis de regresión no lineal para obtener una ecuación que permita transformar los valores de la relación en pH.Esta figura muestra cómo se distinguen los fagosomas y las Xan ingeridas. El panel izquierdo muestra una imagen combinada de campo brillante y una relación Fitz zy de 490 a 440. Mientras que el panel derecho muestra únicamente la imagen de campo brillante.Los fagosomas pueden distinguirse de las partículas externas que o bien no coinciden con las células o cuya fluorescencia no coincide con un centro oscuro rodeado por un anillo más brillante, característico de los fagosomas en la imagen de campo brillante mostrada. A continuación se muestran los cursos temporales típicos del pH intrafagosómico en neutrófilos salvajes y en neutrófilos con deleción de HV CN uno. En los neutrófilos de tipo salvaje, el pH es neutro o ligeramente alcalino durante los primeros momentos. Tras la ingestión, los fagosomas de los neutrófilos con deleción de HV CN uno pueden ser alcalinos o ácidos. Las imágenes tomadas entre 30 y 35 minutos después de la adición de los objetivos permiten calcular el pH medio poblacional a partir de un gran número de fagosomas en los histogramas de las relaciones Fitz Xan mostrados aquí.Pudimos observar las diferencias en pequeños valores de pH entre neutrófilos de tipo silvestre y neutrófilos con deleción de HVCN1. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en seis horas. A partir del paso de optimización, al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar las condiciones de imagen. Primero, optimizar la concentración de anticuerpos para el paso de optimización también puede ser útil para asegurar una fagocitosis robusta siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como medir la producción de Ross o la capacidad de eliminación bacteriana, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como si la cantidad de Ross pequeña o la capacidad del fagosome para matar bacterias se alteran junto con el pH tras su formación. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los fagocitos exploraran qué factores influyen en la capacidad de las células fagocíticas para destruir o procesar los materiales ingeridos y así desencadenar respuestas inmunitarias adicionales. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar microscopía de fluorescencia geométrica para medir parámetros fisiológicos de los fagosomas en tiempo real en células vivas.No olvide que trabajar con inhibidores UNIFOR y células vivas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Existen varios métodos para medir el pH intracelular, pero muy pocos de ellos permiten la medición simultánea del pH citoplasmático y orgoncelar. Aquí, describimos en detalle una metodología rápida y precisa para medir simultáneamente el pH citoplasmático y vesicular mediante imágenes radiométricas de células vivas.

Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Este manuscrito describe un método simple para medir el pH phagosomal y zona, así como el pH citoplasmático de los neutrófilos humanos y de ratón utilizando el indicador radiométrica seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Esto se consigue utilizando células vivas microscopía de fluorescencia confocal y análisis de imágenes.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

Aprende a medir el pH fagosómico en fagocitos vivos mediante microscopía de fluorescencia ratiométrica. Esta técnica permite monitorear cambios de pH en tiempo real y analizar la heterogeneidad individual de los fagosomas.

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Explorar más videos