El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

El objetivo general de este procedimiento es aislar una región genómica específica conservando las interacciones moleculares para la identificación de moléculas que interactúan con dicha región genómica. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de funciones genómicas, como la transcripción y la regulación epigenética. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación directa de moléculas que interactúan con una región genómica específica.

El procedimiento será demostrado por Toshitsugu Fujita, profesor asistente de mi laboratorio. Siguiendo el protocolo escrito, diseñe las moléculas de unión al ADN de interés. Esto implica generar la secuencia gBlock de interés e insertarla en un retrovirus, por ejemplo, para producir el ARN guía complejado con tres FLAG-dCas9.

Alternativamente, se pueden generar tres proteínas FLAG-TAL que reconozcan la secuencia diana. A continuación, siga el protocolo del texto para infectar las células con el retrovirus preparado. Confirme la expresión de las moléculas de unión al ADN modificadas y establezca la línea celular.

A continuación, proceda a entrecruzar las células con formaldehído. Suspenda 20 millones de células transfectadas en 30 mililitros de medio de cultivo normal y agregue 810 microlitros de formaldehído al 37 % para obtener una concentración final del 1 %. Incube la mezcla durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Después de cinco minutos, detenga la reacción de entrecruzamiento añadiendo 3,1 mililitros de glicina 1,25 molar.

Deje que las células reposen a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de continuar. A continuación, centrifugue el tubo celular a 300 G durante cinco minutos en una centrífuga refrigerada. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y lave el botón celular en 30 mililitros de PBS mediante mezcla y centrifugación.

Realice dos lavados con PBS. Si es necesario, el precipitado lavado de células fijadas puede almacenarse a menos 80 grados Celsius. A continuación, recoja la cromatina de las células.

Suspéndalos en 10 mililitros de tampón de lisis e incúbelos en hielo durante 10 minutos. Luego, utilizando una centrífuga refrigerada, recopile las células y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Ahora, suspenda el botón celular en tampón de lisis nuclear e incube en hielo durante 10 minutos.

Cada pocos minutos durante la incubación, agite brevemente la mezcla en un vórtex. Nuevamente, recoja las células mediante centrifugación. Ahora, lave el sedimento con 10 mililitros de PBS y elimine la solución de lavado mediante otra centrifugación.

Esto produce la fracción de cromatina y, si se desea, puede congelarse rápidamente y almacenarse a menos 80 grados Celsius. Continúe suspendiendo el precipitado de cromatina en 800 microlitros de tampón de lisis modificado tres y transfiera la suspensión a un tubo más pequeño de 1,5 mililitros. Ahora, encienda una sonda de sonicación a nivel tres de potencia con ciclo continuo.

Para fragmentar la cromatina, realice manualmente ciclos de 10 segundos de sonicación seguidos de 20 segundos en hielo. En cada ciclo quinto o sexto, prolongue la fase en hielo hasta dos minutos para que la muestra no se sobrecaliente. Realice este ciclo de sonicación entre 10 y 18 veces, manteniendo la punta de la sonda alejada del fondo del tubo para evitar que la muestra espume.

Después de la sonicación, recopile la muestra mediante una centrifugación rápida y refrigerada. Luego, transfiera el sobrenadante que contiene la cromatina fragmentada a un nuevo tubo y deseche el precipitado. Consulte el protocolo escrito para saber cómo evaluar la fragmentación.

Para preparar la inmunoprecipitación, primero conjugar los anticuerpos a las Dynabeads. Esta inmunoprecipitación se escala para muestras derivadas de 20 millones de células. Añadir un volumen igual a 1/5 de tampón de lisis modificado tres con Triton X-100 al cromatina fragmentado para obtener una concentración final de 1 % Triton.

A continuación, agregue la mezcla a las perlas magnéticas conjugadas con IgG de ratón normal. Incube la reacción durante una hora en un rotador con refrigeración. Posteriormente, atraiga las perlas desde la solución durante tres minutos en un soporte magnético.

Luego, recolecte el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante al tubo de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-FLAG. Incube esta reacción de conjugación durante la noche en un rotador a cuatro grados Celsius.

A la mañana siguiente, aplique un imán al tubo durante tres minutos para recolectar las perlas. Luego, retire el sobrenadante con una pipeta y deséchelo. Ahora, lave las perlas.

Suspéndalos en un mililitro de tampón de baja salinidad e incúbelos durante cinco minutos en un rotador a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, aísle las perlas mediante magnetización y deseche el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más con tampón de baja salinidad.

Utilizando la misma técnica, realice dos lavados más usando tampón de alto contenido salino. Continúe utilizando el método para lavar los perlas con tampón de cloruro de litio dos veces. Finalmente, lave las perlas con TBS-IGEPAL CA-630 solo una vez.

Después de los siete pasos de lavado, suspenda las perlas en 200 microlitros de tampón de elución e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Luego, atraiga las perlas mediante magnetización y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Repita este paso de elución para aumentar los rendimientos.

Luego, purifique aproximadamente el 5 % del ADN para estimar el rendimiento. Comience mezclando la mayor parte del eluato en una reacción de precipitación. Precipite la cromatina durante la noche a menos 20 grados Celsius.

Al día siguiente, centrifugue la muestra y deseche el sobrenadante. Lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % y repita la centrifugación durante 10 minutos. Luego, deseche el sobrenadante y suspenda el precipitado en 40 microlitros de tampón de muestra 2x.

Ahora, agite la suspensión mediante vortex durante cinco minutos completos. Luego, incúbela a 100 grados Celsius durante 30 minutos para desnaturalizar e invertir el entrecruzamiento. Después de la ebullición, cargue 40 microlitros de la muestra en un gel de electroforesis SDS-PAGE.

Normalmente se utiliza un gradiente de cuatro al 20 %. Ejecute el gel hasta que el colorante avance un centímetro por debajo del pocillo. Luego, tiña el gel y córtelo en cinco fragmentos de aproximadamente 2 milímetros de largo.

Diluya la proteína de los trozos de gel y utilícela para el análisis de espectrometría de masas. La purificación del ARN, seguida del análisis de secuenciación, se describe en el protocolo escrito. En general, hasta el 10 % de las regiones genómicas diana se pueden purificar utilizando enChIP.

Se muestran aquí los rendimientos de análisis dirigidos a la región promotora del gen IRF-1 en comparación con el locus no específico de Sox2. Otro ejemplo es el enfoque en los telómeros frente al locus satélite gamma no específico. enChIP SILAC identificó varias proteínas asociadas con el promotor de IRF-1 de manera específica a la interferona gamma.

Las proteínas que se unen a los telómeros también se identificaron mediante enChIP combinado con espectrometría de masas. Luego, mediante secuenciación de ARN con enChIP se identificaron los ARN asociados con los telómeros. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en los campos de la transcripción y la regulación epigenética exploraran dichos mecanismos en diversos sistemas biológicos.