El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

El objetivo general de este procedimiento es aislar una región genómica específica que conserve interacciones moleculares para la identificación de moléculas que interactúan con la región genómica. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos de las funciones genómicas, como la transcripción y la regulación epigenética. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación directa de moléculas que interactúan con una región genómica específica.

El demostrador del procedimiento será Toshitsugu Fujita, profesor asistente de mi laboratorio. Siguiendo el protocolo de texto, diseñe las moléculas de unión al ADN de interés. Esto implica generar la secuencia gBlock de interés e insertarla en un retrovirus, por ejemplo, para producir el ARN guía complejado con tres FLAG-dCas9.

Alternativamente, se pueden generar tres proteínas FLAG-TAL que reconocen la secuencia diana. Luego, siguiendo el protocolo de texto, infecte las células con el retrovirus preparado. Confirme la expresión de las moléculas de unión al ADN modificadas y establezca la línea celular.

Ahora, proceda a reticularmente las células con formaldehído. Suspender 20 millones de células transfectadas en 30 mililitros de medio de cultivo regular y agregar 810 microlitros de formaldehído al 37% para una concentración final del 1%Incubar la mezcla durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, mata la reacción de reticulación añadiendo 3,1 mililitros de glicina molar 1,25.

Deje reposar las celdas a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de continuar. A continuación, centrifugar el tubo de la célula a 300 G durante cinco minutos en una centrífuga refrigerada. Deseche con cuidado el sobrenadante y lave el pellet de la celda en 30 mililitros de PBS mezclando y centrifugando.

Realice dos lavados PBS. Si es necesario, el pellet lavado de las celdas fijas se puede almacenar a menos 80 grados centígrados. A continuación, recoge la cromatina de las células.

Suspenderlos en 10 mililitros de tampón de lisis e incubarlos en hielo durante 10 minutos. Luego, usando una centrífuga refrigerada, recoja las células y deseche el sobrenadante con cuidado. Ahora, suspenda el pellet celular en un tampón de lisis nuclear e incube en hielo durante 10 minutos.

Cada pocos minutos durante la incubación se agita brevemente la mezcla. De nuevo, recoja las células por centrifugación. Ahora, lave el pellet con 10 mililitros de PBS y retire la solución de lavado con otra centrifugación.

Esto produce la fracción de cromatina y, si se desea, se puede congelar rápidamente y almacenar a menos 80 grados centígrados. Proceda suspendiendo el pellet de cromatina en 800 microlitros de tampón de lisis modificado tres y transfiera la suspensión a un tubo más pequeño de 1,5 mililitros. Ahora, encienda una sonda de sonicación a nivel tres de potencia con servicio continuo.

Para fragmentar la cromatina, realice un ciclo manual entre 10 segundos de sonicación y 20 segundos en hielo. En cada 5º o 6º ciclo, extienda la fase de hielo a dos minutos para que la muestra no se sobrecaliente. Realice este ciclo de sonicación de 10 a 18 veces, manteniendo la punta de la sonda alejada del fondo del tubo para evitar la formación de espuma en la muestra.

Después de la sonicación, recoja la muestra con una centrifugación refrigerada rápida. A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene la cromatina fragmentada a un nuevo tubo y deseche el pellet. Consulte el protocolo de texto sobre cómo evaluar la fragmentación.

Para prepararse para la inmunoprecipitación, primero conjugue los anticuerpos contra Dynabeads. Esta inmunoprecipitación se escala a muestras derivadas de 20 millones de células. Añada 1/5 de volumen de tampón de lisis modificado tres con Triton X-100 a la cromatina fragmentada para obtener una concentración final de 1% de Triton.

A continuación, agregue la mezcla a las perlas magnéticas conjugadas con IgG de ratón normal. Incubar la reacción durante una hora en un rotador con refrigeración. Más tarde, extraiga las perlas de la solución durante tres minutos en un soporte magnético.

Luego, recoge el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante al tubo de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-FLAG. Ejecute esta reacción de conjugación durante la noche en un rotador a cuatro grados centígrados.

A la mañana siguiente, aplique un imán al tubo durante tres minutos para recoger las cuentas. A continuación, pipetea el sobrenadante y deséchalo. Ahora, lava las cuentas.

Suspenderlos en un mililitro de tampón bajo en sal e incubarlos durante cinco minutos en un rotador a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, aísle la magnetización de las perlas y deseche el sobrenadante. Repita este paso de lavado con tampón bajo en sal una vez más.

Usando la misma técnica, realice dos lavados más con tampón con alto contenido de sal. Continúe usando el método para lavar las perlas en tampón de cloruro de litio dos veces. Por último, lave las cuentas con TBS-IGEPAL CA-630 una sola vez.

Después de los siete pasos de lavado, suspenda las perlas en 200 microlitros de tampón de elución e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Luego, atrae las cuentas por magnetización y recoge el sobrenadante en un nuevo tubo. Repita este paso de elución para aumentar los rendimientos.

Luego, purifique aproximadamente el 5% del ADN para estimar el rendimiento. Comience mezclando la mayor parte del eluido en una reacción de precipitación. Precipitar la cromatina durante la noche a menos 20 grados centígrados.

Al día siguiente, centrifugar la muestra y desechar el sobrenadante. Enjuague el pellet con un mililitro de etanol al 70% y repita la centrifugación durante 10 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y suspenda el pellet en 40 microlitros de tampón de muestra 2x.

Ahora, vórtice la suspensión durante cinco minutos completos. Luego, incube a 100 grados centígrados durante 30 minutos para desnaturalizarlo e invertir la reticulación. Después de hervir, extienda 40 microlitros de la muestra en un gel SDS-PAGE.

Por lo general, se emplea una pendiente del cuatro al 20%. Pasa el gel hasta que el tinte viaje un centímetro por debajo del pocillo. Luego, tiñe el gel y córtalo en cinco pedazos de unos 2 milímetros de largo.

Diluya la proteína de las piezas de gel y utilícela para el análisis de especificaciones de masas. La purificación del ARN, seguida de un análisis de secuenciación, se tratan en el protocolo de texto. En general, hasta el 10% de las regiones genómicas objetivo se pueden purificar con enChIP.

Aquí se muestran los rendimientos de los análisis dirigidos a la región promotora del gen IRF-1 en comparación con el locus Sox2 inespecífico. Otro ejemplo es la focalización de los telómeros frente a los locus gamma-satélite no específicos. enChIP SILAC identificó varias proteínas asociadas con el promotor IRF-1 de una manera específica para el interferón gamma.

Las proteínas de unión a los telómeros también se identificaron mediante enChIP combinado con espectrometría de masas. A continuación, se utilizó la secuenciación del ARN de enChIP para identificar los ARN asociados a los telómeros. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la transcripción y la regulación epigenética exploraran dichos mecanismos en varios sistemas biológicos.