Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

El objetivo de este vídeo es demostrar el método para el aislamiento e identificación de ARNs y componentes proteicos de complejos ribonucleoproteicos a partir de extractos celulares utilizando métodos de inmunoprecipitación. Hola, mi nombre es Garrett Dom y soy un estudiante graduado en el departamento de Molecular y Microbiología e Inmunología de la Universidad de Missouri que estudia con el Dr. Eli sso. A partir del avance en la secuenciación de alto rendimiento y el análisis eficiente de microarrays, la expresión y el análisis de genes globales se han convertido en una forma fácil y fácilmente disponible de recopilación de datos en muchos modelos de investigación y enfermedades.

Sin embargo, los niveles de ARNm del gen diana en el estado de estudio no siempre se correlacionan directamente con los niveles de proteínas en estado estacionario. La regulación génica postranscripcional es una explicación probable de la divergencia entre los dos. Impulsado por las interacciones de las proteínas de unión al ARN.

La regulación postranscripcional afecta a la localización, estabilidad y traducción del ARNm mediante la formación de un complejo de proteínas de núcleo costillar con ARNm diana. La identificación de estos objetivos desconocidos de ARNm de Denovo a partir de extractos celulares de este complejo es fundamental para comprender los mecanismos y funciones de la proteína de unión al ARN y su efecto resultante en la producción de proteínas. Este protocolo describe un método denominado riboproteína, inmunoinmunoprecipitación o RIP, que permite la identificación de ARNm específicos asociados en el complejo de ribonucleoproteínas.

Antes de comenzar el experimento, es fundamental tener todos los reactivos, recipientes y utensilios. Los ARN libres de ARN tratan la cristalería con un inhibidor de la R nasa, como el ARN ZAP de ambion, seguido de un enjuague con agua tratada con dpci, lo que garantiza que todos los reactivos se confirmen como libres de ARN. El primer paso del procedimiento es cosechar el complejo proteico del nucleo costilla del lisado celular cosechar células de tejido en crecimiento exponencial para producir entre dos y cinco miligramos de proteína total por cada muestra utilizada, por lo general dos placas de cultivo P 1 50 son suficientes.

Aquí estamos recolectando MB 2, 31 y MC, siete líneas celulares de cáncer de mama humano, e investigando las interacciones del núcleo de ribón de la proteína de unión al ARN. Es importante tener en cuenta que para cada proteína de unión al ARN que se está investigando, el número total de células y las cantidades de proteínas deben optimizarse para maximizar las interacciones adecuadas entre el ARNm objetivo y la proteína de unión al ARN. Células de pellets mediante centrifugación a 1000 RPM durante aproximadamente ocho a 10 minutos a cuatro grados Celsius, luego lavar tres veces con PBS helado Después del lavado final, golpee suavemente la parte inferior del tubo y vuelva a suspender la celda de pellets en volúmenes iguales de tampón de lisis polisomal preparado con ARN e inhibidores de proteasa.

Se recomienda medir suavemente el volumen exacto de la mezcla de gránulos de células para separar los grupos de células e incubar el lisado en hielo durante cinco minutos. Centrifugar a 13.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para limpiar el lisado de residuos y transferir inmediatamente el sobrenadante aclarado a los ARN preenfriados. Los tubos de microcentrífuga libres se mantienen en hielo y se almacenan a menos 80 grados centígrados.

Este lisado puede almacenarse hasta seis meses a menos 80 grados centígrados. Evite los repetidos ciclos de congelación y descongelación, ya que esto puede provocar la degradación de proteínas o ARNm. Lo mejor es hacer la IP inmediatamente.

Realice una cuantificación rápida de la concentración de proteína y el lisado utilizando el ensayo estándar de proteínas de Bradford. A continuación, necesitaremos preparar los materiales para el aislamiento de nuestra proteína específica de interés. Primera proteína pre hinchada.

Un Sphero perlas durante la noche en un tampón N NT dos complementado con un 5% de almacenamiento de BSA a cuatro grados centígrados. Utilice el tampón NT dos en una proporción de cuatro a uno con perlas PAS. Es posible el almacenamiento a largo plazo de hasta varios meses a cuatro grados centígrados.

Cuando se suplementa con azi de sodio al 0,1% antes de usar, elimine el exceso de tampón NT dos para que la proporción final de perlas a tampón sea de uno a uno. Usando tubos de microcentrífuga sin ARN de 1,5 mililitros, retire 100 microlitros de lodo de velocidad SRO y agregue 30 microgramos de anticuerpo para cada reacción IP individual. Por ejemplo, en nuestro experimento usamos un anticuerpo que es, que es un anticuerpo IgG de ratón.

Por lo tanto, nuestro anticuerpo de control también es IgG. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de tampón NT dos a la mezcla de perlas de anticuerpos. Además, se debe utilizar en paralelo un anticuerpo con el isotipo o un suero normal completo de la misma especie como control de anticuerpos contra el ARN de fondo.

Agregue el anticuerpo apropiado a la mezcla de perlas e incube durante la noche cayendo sobre el extremo a cuatro grados centígrados. Prepare las perlas recubiertas de anticuerpos inmediatamente antes de usarlas lavándolas con un mililitro de NT frío como hielo, dos tampones, cinco veces, lavándolas por centrifugación a 13.000 G durante uno o dos minutos a cuatro grados. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta manual o un aspirador.

Este lavado ayuda a eliminar los anticuerpos no unidos, así como los contaminantes de ARN de la mezcla de anticuerpos. Una vez finalizado el lavado final, se suspenden las perlas y 700 microlitros de tampón T dos helados, seguido de un tratamiento con varios inhibidores de ARN para proteger los ARNm objetivo, incluidos 10 microlitros de ARN, 10 microlitros de DTT de 100 milimolares y 15 microlitros de EDTA. Lleva el volumen a 900 microlitros con tampón NT dos.

A continuación, inmunoprecipitaremos el complejo diana. Recomendamos encarecidamente utilizar un paso de pre-clearing para reducir la señal de fondo en su análisis de ARN después del procedimiento de rip pre-clear con 15 microgramos de control de isotipo durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Añadir 50 microlitros de perlas de PAS preinflamadas no recubiertas de anticuerpos.

Incubar 30 minutos a cuatro grados centígrados con rotación y más en centrífuga a 10.000 g a cuatro grados centígrados. Dos perdigones. Guarde el super natin para ip.

A continuación, agregue 100 microlitros de lisado aclarado aislado con aproximadamente dos a cinco miligramos de proteína a la mezcla de anticuerpos preparada. La dilución del lisado ayudará a reducir el tubo de envoltura de fondo y la paraforma para garantizar un techo hermético e incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro horas dando vueltas y vueltas en las siguientes perlas de pellets a 5.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y guardar supernat para el análisis potencial almacenando a menos 80 grados centígrados como se describió anteriormente. Lave las perlas cinco veces con un mililitro de hielo frío y tampón T dos y centrifugación.

A continuación, retire la supernatina con una pipeta manual o un aspirador. Se pueden utilizar métodos más estrictos para reducir el fondo complementando el tampón NT dos con desoxicoato de sodio, una uria o SDS. Mantenga las muestras en hielo tanto como sea posible y trabaje rápidamente para minimizar la degradación del ARNm objetivo.

Por último, utilizaremos tratamientos con ADNs y proteinasa K seguidos de precipitación de ARN para aislar los ARNs de la proteína nuclear ribón después del lavado resuspender las perlas con 100 microlitros de N NT dos tampones suplementados con cinco microlitros de ARNs libres de ADNs uno. Mantenga las muestras a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Añadir un mililitro de tampón N NT dos y centrifugar a 5.000 g durante cinco minutos.

Deseche el pellet de proteína de espín SUPERNAT Reese a SROs y 100 microlitros de NT, dos tampones con cinco microlitros de proteinasa K a 10 miligramos por mililitro y un microlitro de 10%SDS, incube la mezcla de perlas resuspendidas durante 30 minutos en un baño de agua a 55 grados centígrados, agitando suavemente cada 10 minutos. La proteinasa K ayudará en la liberación de los componentes de la proteína del núcleo de la costilla. Perlas de pellets.

Agregue 5, 000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, recoja el súper nombre, que debe tener aproximadamente 100 microlitros de volumen. A continuación, agregue 200 microlitros de centrífuga NT dos tampón a 5, 000 G durante dos minutos. Recoja aproximadamente 200 microlitros de súper natina y deseche las cuentas.

Combine la supernatina y agregue 300 microlitros de vórtice de fenol ácido de la capa inferior. Un minuto a temperatura ambiente y centrifugar la velocidad máxima a temperatura ambiente durante un minuto. Recoge 250 microlitros de la capa superior.

Tenga mucho cuidado de no perturbar la interfaz, ya que esto contaminará. Agregue 25 microlitros de acetato de sodio a un pH de 5.2 625 microlitros de etanol 100% refrigerado y cinco microlitros de mezcla de azul glico. Almacene bien durante la noche a menos 20 grados centígrados.

Además, para garantizar la correcta recuperación del ARN. La adición de azul glicogénico aumentará la visibilidad de la bolita de ARN al actuar como molécula portadora al día siguiente, los tubos mixtos se invertirán de tres a cinco veces, luego girarán a 12, 000 G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos y desecharán la súper natina. Agregue un mililitro de etanol enfriado al 70% al pellet azul y mezcle por inversión o centrífuga de vórtice.

Muestrear a 12.000 g a cuatro grados centígrados durante dos minutos. Deseche el supernat y centrifugue a 12.000 g durante un minuto a cuatro grados centígrados. Elimine cualquier residuo de etanol al 70% con una pipeta y pellet de secado al aire.

Agregue la temperatura ambiente durante cinco minutos. Re gastar en 20 a 40 microlitros de ARN, agua libre de ADN. La muestra ya está lista para su cuantificación mediante espectrometría NanoDrop y se han realizado otras aplicaciones posteriores, como la PCR cuantitativa en tiempo real o el análisis de microarrays después del aislamiento de ARN, microarrays y PCR cuantitativa en tiempo real para revelar los objetivos de ARNm de la proteína de unión al ARN y su enriquecimiento resultante de la inmunoprecipitación.

La confirmación por Western blot revela un aislamiento limpio de quiénes son proteínas. La PCR cuantitativa demuestra el enriquecimiento de pliegues de la actina beta diana del ARNm en comparación con los controles de IgG uno. Si bien el análisis de microarrays revela perfiles genéticos únicos entre MC seven y MB 2 31, la inmunoprecipitación de nucleoproteínas costillas de líneas celulares de cáncer de mama se ha establecido como una excelente herramienta utilizada para aislar y estudiar las interacciones entre las proteínas de unión al ARN y su RM. A los objetivos de nuestro grupo, así como de muchos otros grupos de investigación, aunque sensibles en su naturaleza y en la práctica, la correcta ejecución de este procedimiento permitirá aislar estos complejos de proteínas del núcleo de las costillas, que hasta hace poco habían sido inaccesibles para su descubrimiento y análisis.