Caracterización del tejido después de un nuevo método de desagregación para la piel micro-injertos Generación

El objetivo general de esta invención quirúrgica es producir microinjertos de piel autóloga listos para ser utilizados inmediatamente en la misma cirugía con fines de cicatrización de heridas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos de la piel sobre cosas como la cicatrización crónica de heridas, quemaduras y úlceras postraumáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es muy fácil de usar por el médico sin necesidad de una técnica expectisil, y es igual de rápida y asequible.

Para comenzar, use un punzón de biopsia para recolectar muestras de piel de un paciente. A continuación, retire y deseche la capa epitelial. Combine cada muestra de tejido con 1 mililitro de solución salina para generar microinjertos autólogos.

Para preparar biocomplejos para su aplicación clínica, transfiera 1 mililitro de la solución de microinjerto a esponjas de colágeno. Aplique inmediatamente el biocomplejo sobre el área lesionada del paciente. Para probar in vitro, la viabilidad del biocomplejo.

Después de tres días de cultivo, verter formalina al 0,3% directamente sobre los biocomplejos y fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Use un micrótomo para cortar secciones de 5 micrómetros de grosor y montarlas directamente en un portaobjetos de vidrio. Luego coloque las secciones en 15 a 20 mililitros de xileno durante tres minutos.

A continuación, sumerja las rodajas en grados decrecientes de etanol durante una hora cada una antes de colocarlas en agua desionizada para desparafinar y rehidratar las secciones. Luego use de 1 a 2 mililitros de 1 gramo por litro de hematoxilina durante uno o dos minutos para teñir las secciones. Y transfiera al agua para enjuagar la mancha.

Ahora con 1 a 2 mililitros de 1% de eosina Y y 70% de etanol y diluirlo en agua, tiñe las secciones durante cuatro o cinco minutos. Luego use agua corriente del grifo para enjuagar los portaobjetos. Sumerja las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante una hora cada una antes de una incubación de una hora en xileno.

Finalmente, aplique un medio de montaje base a las muestras antes de agregar un cubreobjetos. A continuación, observe bajo un microscopio óptico con un aumento de 100x. Utilizando un dermatoma, se tomarán muestras papilares, muertas o de dermis de 0,6 milímetros, 1 milímetro o 0,2 milímetros de grosor, respectivamente, de las zonas del tronco de cuatro donantes de tejidos múltiples de 40 a 55 años de edad, siguiendo las normas nacionales sobre la recolección.

Coloque las muestras en NaCl al 0,9% y colóquelas en un agitador orbital durante cinco minutos para enjuagar suavemente el tejido. Con un punzón de biopsia de 5 milímetros, cree muestras de diámetro uniforme del tejido de la piel, los muertos y la dermis, y pese todas las muestras de tejido. A continuación, inserte ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido cutáneo, muerto o dermis, respectivamente, en el disruptor tisular, y añada 1,5 mililitros de solución salina para la desagregación.

Lleve a cabo la desagregación de todas las muestras de tejido como se indica en esta tabla. Utilice un número correspondiente de biopsias con sacabocados derivadas de muestras de tejido intactas como controles. Después de la desagregación mecánica, aspire la solución salina que contiene microinjertos y coloque cada muestra por separado en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos.

Añadir 1 mililitro de medio RPMI-1640 suplementado con 10%FBS y antibióticos a cada muestra. Para evaluar la viabilidad de la célula, agregue a cada pocillo 1 mililitro de medio que contenga 0,5 miligramos por mililitro de solución de MTT, e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Después de la incubación, retire el medio MTT y reemplácelo con 1 mililitro de DMSO.

Después de incubar durante 10 minutos, transfiera cada muestra en DMSO a una cubeta y use un espectrofotómetro para leer la densidad óptica a 570 nanómetros. Calcule la viabilidad celular como la relación entre la absorbancia a 570 nanómetros y el peso y los gramos de tejido utilizados antes de la disgregación. A continuación, una vez que se ha aspirado la solución salina del tejido de la piel, las muestras muertas y de dermis de un solo donante, se coloca cada muestra por separado en un pocillo de una placa de 12 pocillos para una prueba de viabilidad celular o en un matraz de cultivo para el análisis morfológico.

Agregue 1 mililitro de RPMI-1640 con 10% de FBS y antibióticos a la placa de 12 pocillos o 5 mililitros al matraz de cultivo y al cultivo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas o siete días, respectivamente. A las 24 horas, utilice microscopía óptica para realizar análisis morfológicos evaluando la presencia de suspensión celular. Repita el día siete.

Con el análisis FACS, se analizan las muestras de dermis de marcadores de células mesenquimales y hematopoyéticas, como CD146, CD34 y CD45. Agregue medio a las células desegregadas, luego incube a 37 grados Celsius durante tres días. Y evaluar la esterilidad del tejido mediante la realización de análisis microbiológicos como se ha descrito anteriormente.

Como se muestra aquí, se implantaron microinjertos autólogos humanos cargados inmediatamente sobre el soporte de colágeno en una lesión en la pierna. Y se observó una reepitelización completa asociada con la reparación del tejido después de 30 días. Además, el seguimiento clínico mostró una buena textura y suavidad de la zona dañada después de cinco meses.

Como se indica en esta tabla, se establecieron los umbrales de ocho, cuatro y tres biopsias que se pueden procesar en un solo paso, y los tejidos se desagregaron en cuatro momentos diferentes con el fin de identificar las condiciones óptimas de desagregación para mantener una buena viabilidad celular. La desagregación mecánica demostrada en este vídeo mantiene un valor medio del 30% de viabilidad celular en todas las muestras de piel, muertas y dermis, cuando se evalúan en diferentes momentos con respecto al tejido intacto. Este injerto muestra que después de 24 horas, o siete días en cultivo, no se observó ninguna variación sustancial de la viabilidad celular en las muestras de tejido cutáneo en el momento de la homogeneización en cultivo en comparación con el momento de inicio.

Sin embargo, se observó una menor viabilidad de las muestras muertas después de 24 horas en cultivo en comparación con el tiempo de inicio. Pero la viabilidad celular se restableció después de siete días en cultivo. Se observaron resultados similares para la dermis.

Cuando se domina, esta técnica se puede hacer en cinco minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar eliminar la capa epitelial de la piel. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la desagregación del tejido óseo, para responder a otras preguntas, como el mecanismo de curación ósea.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos exploraran la cicatrización de tejidos en pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar este procedimiento de microinjerto. No olvide que trabajar con el tejido puede ser extremadamente peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones, como las gafas de seguridad, al realizar este procedimiento.