Caracterización del tejido después de un nuevo método de desagregación para la piel micro-injertos Generación

El objetivo general de esta invención quirúrgica es producir microinjertos de piel autólogos listos para ser utilizados inmediatamente en la misma cirugía con fines de cicatrización de heridas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos cutáneos sobre aspectos como la cicatrización de heridas crónicas, quemaduras y úlceras postraumáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es muy fácil de usar por parte del médico sin necesidad de habilidades técnicas especializadas, y es rápida y asequible.

Para comenzar, utilice un punzón de biopsia para obtener muestras de piel de un paciente. Luego retire y deseche la capa epitelial. Combine cada muestra de tejido con 1 mililitro de solución salina para generar microinjertos autólogos.

Para preparar biocomplejos para aplicación clínica, transfiera 1 mililitro de la solución de microinjerto sobre esponjas de colágeno. Aplique inmediatamente el biocomplejo sobre la zona lesionada del paciente. Para pruebas in vitro, evalúe la viabilidad del biocomplejo.

Después de tres días de cultivo, vierta formalina al 0,3 % directamente sobre los biocomplejos y fije durante 10 minutos a temperatura ambiente. Utilice un microtomo para cortar secciones de 5 micrómetros de grosor y monte directamente sobre un portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque las secciones en 15 a 20 mililitros de xileno durante tres minutos.

A continuación, sumerja los cortes en etanol de concentraciones decrecientes durante una hora cada uno antes de colocarlos en agua desionizada para desparafinar e hidratar las secciones. Luego, use de 1 a 2 mililitros de hematoxilina al 1 gramo por litro durante uno a dos minutos para teñir las secciones. Y transfiéralas al agua para enjuagar el tinte.

Ahora, con 1 a 2 mililitros de Eosina Y al 1 % y etanol al 70 % diluidos en agua, tiña las secciones durante cuatro a cinco minutos. Luego, use agua corriente del grifo para enjuagar los portaobjetos. Sumerja las secciones en concentraciones crecientes de etanol durante una hora cada una antes de una incubación de una hora en xileno.

Finalmente, aplique un medio de montaje acuoso a las muestras antes de colocar una laminilla. Luego, observe al microscopio óptico con un aumento de 100x. Utilizando un dermatomo, tome muestras de 0,6 milímetros, 1 milímetro o 0,2 milímetros de grosor de la dermis papilar, muerta o reticular, respectivamente, de las áreas del tronco de cuatro donantes de múltiples tejidos de entre 40 y 55 años, siguiendo las normas nacionales sobre la obtención de tejidos.

Coloque las muestras en NaCl al 0,9 % y colóquelas en un agitador orbital durante cinco minutos para enjuagar suavemente el tejido. Con un punzón de biopsia de 5 milímetros, obtenga muestras uniformes en diámetro a partir del tejido cutáneo, epidermis y dermis, y pese todos los especímenes de tejido. A continuación, introduzca ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido cutáneo, epidermis o dermis, respectivamente, en el disruptor de tejidos, y agregue 1,5 mililitros de solución salina para la desagregación.

Realice la desagregación para todas las muestras de tejido según se indica en esta tabla. Utilice un número correspondiente de biopsias por punzón obtenidas de muestras de tejido íntegras como controles. Después de la desagregación mecánica, aspire la solución salina que contiene microinjertos y coloque cada muestra por separado en un pocillo individual de una placa de 12 pocillos.

Añada 1 mililitro de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y antibióticos a cada muestra. Para evaluar la viabilidad celular, añada a cada pocillo 1 mililitro de medio que contenga 0,5 miligramos por mililitro de solución de MTT, e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante tres horas. Tras la incubación, retire el medio de MTT y sustitúyalo por 1 mililitro de DMSO.

Después de incubar durante 10 minutos, transfiera cada muestra en DMSO a una cubeta y utilice un espectrofotómetro para leer la densidad óptica a 570 nanómetros. Calcule la viabilidad celular como la relación entre la absorbancia a 570 nanómetros y el peso en gramos del tejido utilizado antes de la disgregación. A continuación, una vez que la solución salina haya sido aspirada del tejido cutáneo, coloque por separado cada muestra de epidermis y dermis procedente de un mismo donante en un pocillo de una placa de 12 pocillos para una prueba de viabilidad celular o en un frasco de cultivo para análisis morfológico.

Añada 1 mililitro de RPMI-1640 con 10% de FBS y antibióticos a la placa de 12 pocillos o 5 mililitros al frasco de cultivo, y cultive a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas o siete días, respectivamente. A las 24 horas, utilice microscopía de luz para realizar el análisis morfológico evaluando la presencia de suspensión celular. Repita el procedimiento el día siete.

Mediante análisis de FACS, analice las muestras de dermis para detectar marcadores de células mesenquimales y hematopoyéticas, como CD146, CD34 y CD45. Añada medio a las células desagregadas y luego incube a 37 grados Celsius durante tres días. Evalúe la esterilidad del tejido realizando un análisis microbiológico como se describió previamente.

Como se muestra aquí, microinjertos autólogos humanos cargados inmediatamente sobre un soporte de colágeno fueron implantados en una lesión en la pierna. Y se observó una reepitelización completa asociada con la reparación del tejido después de 30 días. Además, el seguimiento clínico mostró una buena textura y suavidad del área dañada después de cinco meses.

Como se indica en esta tabla, se establecieron los umbrales de ocho, cuatro y tres biopsias que pueden procesarse en una sola etapa, y los tejidos se desagregaron en cuatro momentos diferentes con el fin de identificar las condiciones óptimas de desagregación para mantener una buena viabilidad celular. La desagregación mecánica mostrada en este video mantiene un valor medio del 30 % de viabilidad celular en todas las muestras de piel, epidermis y dermis, cuando se evalúa en diferentes momentos respecto al tejido intacto. Este gráfico muestra que tras 24 horas, o siete días en cultivo, no se observó una variación sustancial de la viabilidad celular en las muestras de tejido cutáneo al momento de la homogenización en cultivo en comparación con el tiempo inicial.

Sin embargo, se observó una viabilidad reducida de las muestras muertas después de 24 horas en cultivo en comparación con el tiempo inicial. Pero la viabilidad celular se recuperó después de siete días en cultivo. Se observaron resultados similares para el dermis.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar eliminar la capa epitelial de la piel. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la desagregación del tejido óseo, con el fin de responder otras preguntas, como el mecanismo de curación ósea.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos exploraran la cicatrización de tejidos en pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar este procedimiento de microinjerto. No olvide que trabajar con el tejido puede ser extremadamente peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad al realizar este procedimiento.