HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones

El objetivo general de este método es observar cómo la transferencia de genes mediada por virus afecta a los fenotipos de comportamiento que requieren heterodimerización de receptores acoplados a proteínas G en modelos de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurofarmacología y la psicofarmacología. Específicamente, cómo los receptores acoplados a proteínas g interactúan entre sí a nivel molecular.

Mediante el uso de este método podemos entender cómo esta interacción afecta el comportamiento en modelos de trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia y la depresión. Con este método vamos a analizar específicamente la serotonina 2a y el receptor metabotrópico de glutamato 2, que han demostrado estar implicados en el mecanismo de acción de los fármacos utilizados para tratar a los pacientes con esquizofrenia. Comience por anestesiar adecuadamente al ratón de acuerdo con los métodos aprobados.

Asegúrese de que se ha obtenido un plano quirúrgico de anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie y notando la ausencia de una respuesta. A continuación, aplique un gel oftálmico para proteger los ojos. Coloque el mouse en el marco estereotáctico, asegurándose de ajustar la inclinación de la cabeza para que el cráneo esté nivelado y plano.

Aplique povidona yodada en el cuero cabelludo expuesto. Con un bisturí, haga una incisión sagital a lo largo de la línea media del cráneo dentro del área afeitada expuesta. A continuación, coloque pinzas puré en la piel en el sitio de la incisión para asegurarse de que el cráneo permanezca expuesto.

Aplique peróxido de hidrógeno para disolver el periostio y exponer las suturas del cráneo. Ahora que el bregma y las suturas son visibles, asegúrese de ajustar el marco estereotáctico para asegurarse de que el cráneo esté nivelado. Alinee las puntas de las agujas de las jeringas con bregma y registre las coordenadas del bregma.

Para inyectar bilateralmente la corteza frontal, agregue 1,6 mm a la coordenada del bregma caudal rostral registrada y 2,6 mm a la coordenada del bregma lateral medial registrada. Marque los sitios de inyección en el cráneo y luego perfore pequeños orificios en los sitios de inyección. Con un aplicador de punta de algodón, limpie el exceso de sangre o fragmentos de hueso.

Lleve la aguja a la superficie del cerebro y baje hasta la profundidad de la coordenada ventral dorsal. A continuación, inyecte lentamente el contenido de la jeringa girando el émbolo de la aguja para administrar 0,1 microlitros por minuto durante cinco minutos, para una inyección de 0,5 microlitros. Deje que la jeringa permanezca en su lugar durante cinco minutos.

Después del tiempo asignado, retire al animal de la estereotaxis, cierre la incisión y colóquelo en una almohadilla térmica. Administre analgesia postoperatoria de acuerdo con el protocolo aprobado para animales. Realice pruebas de comportamiento dos o tres días después de la inyección estereotáctica de partículas virales.

Habitúa a los ratones a la habitación durante al menos cuatro horas antes del comienzo del experimento. Comience disolviendo el DOI en una solución salina al 0,9 por ciento a dos miligramos por kilogramo. Prepare una jaula casera sin ropa de cama y, con un trípode, ajuste una cámara para que quede directamente sobre la jaula doméstica.

Calibra la cámara para que toda la jaula de la casa esté en el campo de visión. Pesar el ratón e inyectar por vía intraperitoneal la dosis adecuada de solución salina al 0,9 por ciento o DOI. Vuelva a colocar al ratón en la jaula de inicio durante diez minutos.

Después de diez minutos, coloque el mouse en el centro de la jaula de inicio vacía y asegúrese de que no haya puntos ciegos en el campo de visión de la cámara. Pulse grabar en la videocámara y salga de la habitación. Después de 30 minutos, detenga la grabación y vuelva a colocar el mouse en la jaula original de la casa.

Repita la prueba de comportamiento en el siguiente mouse. Pídele al árbitro que revise los videos a ciegas a las condiciones experimentales. Graba manualmente cada movimiento de la cabeza a lo largo del video.

Un movimiento de la cabeza se define como un movimiento rápido y agitado de la cabeza realizado por un ratón. Procese los datos como se describe en la parte escrita del protocolo. Aquí se muestra una imagen representativa de la expresión de transgenes mediada por el VHS en la corteza frontal.

Se inyectó HSV mGlu2 GFP en la corteza frontal y la expresión de GFP se reveló mediante inmunocitoquímica. Esta barra de escala representa 200 micras. Esta imagen muestra un western blot de expresión transgénica mediada por HSV y reactividad anti-mGlu2 en la corteza frontal de ratones knockout de mGlu2.

Aquí medimos la inmunorreactividad de mGlu2 como monómero. Este histograma muestra que la expresión mediada por virus de mGlu2, pero no de mGlu2 quimérica en la corteza frontal de ratones knockout de mGlu2 rescata significativamente la respuesta de contracción de la cabeza inducida por el agonista del receptor alucinógeno de serotonina 2a DOI. Los pasos más críticos de este experimento son el tiempo entre las inyecciones virales, la respuesta de contracción de la cabeza y el momento en que se sacrifican los ratones.

Cualquier retraso puede alterar los resultados del experimento o introducir ambigüedad en los datos. Una vez dominada, la cirugía con ratones tardará aproximadamente 30 minutos en inyectar el virus. El experimento de la contracción de la cabeza también debería durar aproximadamente 35 minutos por ratón.

Se recomiendan cirugías escalonadas u operar con más de un mouse a la vez. De esta manera, se puede mantener una línea de tiempo que permita que los experimentos de contracción de la cabeza se realicen en los tres o cuatro días posteriores a la cirugía, que es el momento máximo de expresión de la construcción viral. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.