HSV mediada por la expresión transgénica de constructos quiméricos para estudiar la función del comportamiento de los GPCR heterómeros en ratones
9 de julio de 2016
En este artículo se describe cómo inyectar vectores virales en la corteza frontal del ratón para probar los ensayos de comportamiento que requieren la formación heteromérica GPCR.
El objetivo general de este método es observar cómo la transferencia génica mediada por virus afecta los fenotipos conductuales que requieren la heterodimerización de receptores acoplados a proteínas G en modelos de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurofarmacología y psicofarmacología, específicamente cómo los receptores acoplados a proteínas G interactúan entre sí a nivel molecular.
Mediante el uso de este método, podemos comprender cómo esta interacción afecta el comportamiento en modelos de trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia y la depresión. Utilizando este método, vamos a analizar específicamente el receptor de serotonina 2a y el receptor metabotrópico del glutamato 2, ambos implicados en el mecanismo de acción de los fármacos utilizados para tratar a pacientes con esquizofrenia. Comience por anestesiar adecuadamente al ratón según métodos aprobados.
Asegúrese de que se ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia realizando una compresión del dedo del pie y observando la ausencia de respuesta. A continuación, aplique gel oftálmico para proteger los ojos. Sujete el ratón al marco estereotáctico, asegurándose de ajustar la inclinación de la cabeza de modo que el cráneo quede nivelado y plano.
Aplique yodo-povidona en el cuero cabelludo expuesto. Con un bisturí, realice una incisión sagital a lo largo de la línea media del cráneo dentro del área afeitada expuesta. A continuación, sujete pinzas Pureit a la piel en el sitio de la incisión para asegurarse de que el cráneo permanezca expuesto.
Aplique peróxido de hidrógeno para disolver el periostio y exponer las suturas del cráneo. Ahora que el bregma y las suturas son visibles, asegúrese de ajustar el marco estereotáctico para verificar que el cráneo esté nivelado. Alinee las puntas de las agujas de las jeringas con el bregma y registre las coordenadas del bregma.
Para inyectar bilateralmente la corteza frontal, añada 1,6 mm a la coordenada registrada de bregma rostrocaudal y 2,6 mm a la coordenada registrada de bregma mediolateral. Marque los sitios de inyección sobre el cráneo y luego taladre pequeños orificios en los sitios de inyección. Con un aplicador de punta de algodón, retire cualquier exceso de sangre o fragmentos óseos.
Lleve la aguja hasta la superficie del cerebro y bájela hasta la profundidad de la coordenada dorsal-ventral. Luego, inyecte lentamente el contenido de la jeringa girando el émbolo de la aguja para administrar 0,1 microlitros por minuto durante cinco minutos, para una inyección total de 0,5 microlitros. Deje la jeringa en su lugar durante cinco minutos.
Después del tiempo asignado, retire el animal de la estereotaxia, cierre la incisión y colóquelo sobre una almohadilla calefactora. Administre analgesia postoperatoria de acuerdo con el protocolo aprobado para el manejo del animal. Realice pruebas de comportamiento entre dos y tres días después de la inyección estereotáxica de partículas virales.
Habitúe a los ratones en la habitación durante al menos cuatro horas antes del inicio del experimento. Comience disolviendo DOI en una solución salina al 0,9 por ciento hasta una concentración de dos miligramos por kilogramo. Prepare una jaula de alojamiento sin ningún tipo de cama y, utilizando un trípode, ajuste una cámara para que quede directamente encima de la jaula de alojamiento.
Calibre la cámara para que toda la jaula de alojamiento esté dentro del campo de visión. Pese al ratón e inyecte por vía intraperitoneal la dosis adecuada de solución salina al 0,9 por ciento o DOI. Devuelva al ratón a la jaula de alojamiento durante diez minutos.
Después de diez minutos, coloque el ratón en el centro de la jaula hogar vacía y asegúrese de que no haya puntos ciegos en el campo de visión de la cámara. Presione grabar en la videocámara y salga del cuarto. Después de 30 minutos, detenga la grabación y devuelva al ratón a la jaula hogar original.
Repita la prueba conductual en el siguiente ratón. Haga que el evaluador revise los videos sin conocer las condiciones experimentales. Registre manualmente cada sacudida de cabeza a lo largo del video.
Un sacudimiento de cabeza se define como un movimiento rápido de sacudida de la cabeza realizado por un ratón. Procese los datos según se describe en la parte escrita del protocolo. Aquí se muestra una imagen representativa de la expresión del transgén mediada por HSV en la corteza frontal.
Se inyectó HSV mGlu2 GFP en la corteza frontal y la expresión de GFP se reveló mediante inmunocitoquímica. Esta barra de escala representa 200 micrones. Esta imagen muestra un inmunotransferencia de Western de la expresión del transgén mediada por HSV y la reactividad anti-mGlu2 en la corteza frontal de ratones knockout para mGlu2.
Aquí medimos la inmunorreactividad de mGlu2 como monómero. Este histograma muestra que la expresión mediada por virus de mGlu2, pero no la de mGlu2 quimérico en la corteza frontal de ratones knockout para mGlu2, rescata significativamente la respuesta de sacudida de cabeza inducida por el agonista del receptor de serotonina 2a alucinógeno DOI. Los pasos más críticos en este experimento son el momento entre las inyecciones virales, la respuesta de sacudida de cabeza y el momento en que se sacrifican los ratones.
Cualquier demora puede alterar los resultados del experimento o introducir ambigüedad en los datos. Una vez dominada, la cirugía en ratón tomará aproximadamente 30 minutos para inyectar el virus. El experimento del temblor de cabeza también debería tomar aproximadamente 35 minutos por ratón.
Se recomienda realizar cirugías escalonadas, o intervenir más de un ratón al mismo tiempo. De este modo, se puede mantener una cronología que permita llevar a cabo los experimentos de movimientos bruscos de la cabeza entre los tres y cuatro días posteriores a la cirugía, que es el momento de máxima expresión del constructo viral. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para investigar las consecuencias conductuales de la transferencia génica mediada por virus que dirige la heterodimerización del receptor acoplado a proteína G (GPCR) en modelos de ratón. Específicamente, examina la interacción entre el receptor de serotonina 2A (5-HT2A) y el receptor metabotrópico de glutamato 2 (mGlu2) en el contexto de comportamientos relacionados con la psicosis, utilizando la respuesta de sacudida de cabeza (HTR) como indicador conductual tras la administración de fármacos alucinógenos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurofarmacología
- Neurociencia del comportamiento
- Neurociencia molecular
Antecedentes
- Se ha implicado a complejos heteroméricos de RCPG, como el 5-HT2A-mGlu2, en trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia.
- La respuesta de sacudida de cabeza (HTR) en ratones es un ensayo conductual bien establecido para la acción de fármacos alucinógenos y depende de la función del receptor 5-HT2A.
- Estudios previos muestran que ratones knockout para mGlu2 presentan una HTR reducida frente a alucinógenos, lo que sugiere un papel del mGlu2 en conductas mediadas por el 5-HT2A.
- No se había probado directamente la necesidad del complejo de receptores 5-HT2A-mGlu2 para estas conductas.
Objetivo del estudio
- Determinar si el complejo heteromérico de receptores 5-HT2A-mGlu2 es necesario para las respuestas conductuales inducidas por alucinógenos en ratones.
- Evaluar la capacidad de la expresión mediada por virus de mGlu2 o de un constructo quimérico de mGlu2 (incapaz de formar el complejo heteromérico) para restaurar la respuesta de parada en mGlu2 en ratones knockout de mGlu2.
- Proporcionar un marco metodológico para estudiar las interacciones de los receptores acoplados a proteínas G en vivo.
Métodos Utilizados
- Cirugía estereotáxica para la inyección bilateral de constructos del virus del herpes simple (HSV) en la corteza frontal de ratones anestesiados.
- Expresión de mGlu2 de tipo silvestre o de un constructo quimérico mGlu2/mGlu3 (mGlu2ΔTM4N) mediante vectores virales.
- Pruebas conductuales mediante la respuesta de sacudida de cabeza (HTR) tras la administración del alucinógeno DOI.
- Inmunocitoquímica y transferencia western para confirmar la expresión del transgén en la corteza frontal.
Resultados principales
- La expresión mediada por HSV del mGlu2 en la corteza frontal de ratones knock-out para mGlu2 rescata significativamente la respuesta de sacudida de cabeza inducida por DOI.
- La expresión del constructo quimérico de mGlu2, que no puede formar el complejo 5-HT2A-mGlu2, no rescata la respuesta de sacudida de cabeza.
- La inmunocitoquímica y el inmunotransferencia (western blotting) confirman una expresión transgénica exitosa y específica en la región cerebral diana.
- El momento de la inyección viral, las pruebas conductuales y la recolección de tejidos es fundamental para el éxito del experimento.
Conclusiones
- El complejo heteromérico de receptores 5-HT2A-mGlu2 es necesario para la respuesta conductual completa a las drogas alucinógenas en ratones.
- La transferencia génica mediada por virus es un enfoque eficaz para desentrañar los requisitos moleculares de las interacciones de los receptores acoplados a proteínas G in vivo.
- Este método proporciona una herramienta valiosa para estudiar la base molecular de las conductas relacionadas con trastornos psiquiátricos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis de la función conductual de los heterómeros de RCPG mediante la expresión de transgenes mediada por HSV en ratones aborda un desafío crítico en el descubrimiento de fármacos neuropsiquiátricos: establecer vínculos mecanicistas entre complejos de receptores y fenotipos relevantes para la enfermedad. Este enfoque permite una confianza predictiva en la validación de dianas para trastornos psiquiátricos al aislar la necesidad funcional de interacciones específicas entre receptores. El método respalda decisiones de cartera ajustadas al riesgo en la intersección entre el descubrimiento temprano y la investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función de heterómeros de RCPG in vivo para la reducción de riesgos mecanicistas.
- Clarifica la necesidad de complejos receptoriales específicos para fenotipos conductuales relevantes para la enfermedad.
- Apoya la confianza predictiva en la selección de dianas para indicaciones neuropsiquiátricas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece ensayos conductuales validados vinculados a intervenciones moleculares para cribado posterior.
- Proporciona salidas conductuales cuantitativas (respuesta de sacudida de cabeza) para la estandarización del ensayo.
- Facilita la evaluación reproducible de manipulaciones genéticas y farmacológicas in vivo.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relaciona modelos conductuales preclínicos con mecanismos de enfermedades humanas mediante el análisis de complejos de receptores.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento molecular hasta la validación conductual en modelos animales.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al vincular intervenciones moleculares con fenotipos cuantificables.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial y la validación preclínica al permitir pruebas basadas en hipótesis de la función del complejo receptor en sistemas conductuales relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nula sobre la participación de heterómeros de RCPG en fenotipos psiquiátricos.
- Tamizaje: Proporciona una plataforma para obtener lecturas conductuales cuantitativas tras perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Análisis: Ofrece puntos finales medibles (recuentos de movimientos bruscos de la cabeza) para comparaciones estadísticas entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta intervenciones moleculares con resultados conductuales relevantes para trastornos psiquiátricos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo reutilizable para investigar otros complejos de receptores in vivo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y reduce la ambigüedad mecanicista en los programas de fármacos neuropsiquiátricos.
- Valor operativo: Estandariza la fenotipificación conductual vinculada a intervenciones moleculares para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al aclarar la necesidad de complejos receptores para conductas relevantes a la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y mecanismos para su avance en las líneas de desarrollo del SNC.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica y fenotipificación conductual en roedores.
- Exige acceso a infraestructura para la producción de vectores virales y validación molecular (inmunocitoquímica, inmunotransferencia).
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos en cuanto al momento de las inyecciones, las pruebas conductuales y el análisis de datos.
- La adaptación a otros complejos receptores o ensayos conductuales podría requerir optimización del protocolo.
- El momento preciso entre la administración viral, la evaluación conductual y la recolección de tejidos es fundamental para la integridad de los datos.
