Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva
17 de mayo de 2020
Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.
Este protocolo utiliza un microscopio multifiltro para la toma de imágenes en vivo de toda la estructura de la superficie ocular del ratón en el modelo de ratón transgénico fluorescente dual. La combinación de una plataforma microscópica multifoto personalizada y ratones transgénicos fluorescentes duales permite la visualización en tiempo real de la estructura y la estructura de la superficie ocular. Para configurar el microscopio multifoto, seleccione el objetivo de inmersión de agua 20X, 1.00 NA y configure el láser Titanium Sapphire como fuente de excitación en un microscopio vertical.
Establezca la longitud de onda de salida láser en 880 nanómetros para EGFP y 940 nanómetros para tdTomato. Incluya dos espejos dicroicos para la separación de los filtros de paso de banda SHG EGFP y EGFP tdTomato y utilice filtros de paso de banda de 434-17, 510-84 y 585-40 nanómetros para separar espectralmente las señales EGFP y tdTomato. Para configurar el portacuchillas, después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesado de 8-12 semanas de edad, coloque el ratón en la etapa del microscopio calentado e inserte una sonda de monitoreo de temperatura.
Coloque el ratón en un soporte de ratón estereotaxico personalizado e inserte las barras de los oídos en el carnoso auditivo externo. Utilice una fijación de tres puntos para fijar el soporte de la cabeza y aplicar un clorhidrato de oxibuprocaína al 0,4%y solución salina a la superficie ocular. Cubra las puntas de un par de fórceps Dumont número cinco con el lazo de tubo PE.
Después de tres minutos realizar una retracción manual del párpado para confirmar la protrusión del globo ocular y colocar cuidadosamente un lazo de tubo del soporte de PE a lo largo del margen del párpado para exponer la superficie ocular. Y utilice la perilla del soporte para estabilizar el globo ocular con los fórceps. A continuación, cubra la superficie corneal con un gel para los ojos con un índice de refracción de 1.338.
Para la toma de imágenes en serie Z de la superficie corneal, utilice una fuente de luz de mercurio para tomar imágenes del campo de orientación y abrir el software del microscopio. Seleccione el multiplicador de fotos adecuado y las ganancias digitales para visualizar la estructura celular en la superficie ocular y establezca la primera y la última diapositiva para permitir la adquisición de una pila de imágenes. Establezca la resolución de la imagen en 512 por 512 píxeles y el paso Z en un micrómetro.
A continuación, haga clic en comenzar para recopilar imágenes serie Z que adquieran una imagen en vivo con una excitación de 880 nanómetros para la colección de señales SHG EGFP, y una imagen en vivo en una excitación de 940 nanómetros para la recopilación de señales EGFP tdTomato dentro de cada área. A lo largo de la imagen, utilice el soporte de etapa motorizado paso a paso para girar el globo ocular para permitir la toma de imágenes a través de toda la superficie corneal. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, cargue las imágenes serie Z en Fiji y seleccione el complemento de filtro Median 3D.
Después de eliminar el ruido de fondo, seleccione el paquete de filtro de máscara desenfocada Fiji para afilar las imágenes y haga clic en contraste de brillo automático para optimizar automáticamente la calidad de las imágenes. Después del procesamiento, guarde las imágenes como una secuencia de imágenes en serie y exporte la secuencia de imágenes en un programa de software de reconstrucción 3D adecuado. En todas las imágenes de microscopía multifoto, presente las señales EGFP tdTomato y SHG en pseudo verde, rojo y cian respectivamente antes de capturar las imágenes de estructura 3D por instantánea.
La microscopía multifotogénica permite la visualización de células superficiales Wing y Basal en el epitelio corneal de ratones transgénicos fluorescentes duales. Las células individuales de la capa basal se pueden asignar a la capa superficial, así como a células superficiales de forma hexagonal única. Como revela la expresión citoplasmática de la señal tdTomato, el sistema vesicular intracelular rico en proteínas de membrana, incluyendo el aparato golgi y el retículo endoplasmático está disperso dentro de las células del ala.
Dentro del estroma colágenoso, los corates en forma de estelar son esbozados por la membrana dirigida a los fluorescentes EGFP en estos ratones. Los corates incrustados en el estroma universitario están más sueltos espaciados que dentro de las células endoteliales. Además, los nervios ramificados delgados dentro del estroma corneal también se pueden visualizar mediante la membrana dirigida a las señales tdTomato y las monocapas de células endoteliales corneales demuestran una forma hexagonal relativamente homogénea conectada en un patrón de panal.
El epitelio limbal consta de una a dos capas de células epiteliales. La cepa transgénica de reportero fluorescente dual también permite la toma de imágenes de capilares dentro de la conjuntiva, facilitando la reconstrucción de la arquitectura 3D de los capilares que delinean el endotelio vascular. Estabilizar el globo ocular con presión moderada sin lesiones es fundamental para adquirir imágenes de buena calidad, ya que una presión insuficiente o excesiva puede comprometer la calidad de la imagen.
Esta plataforma de imágenes de imágenes NVivo se puede modificar para la visualización de estructuras debajo de la superficie ocular y se puede aplicar a estudios in situ de diversas enfermedades oftálmicas.
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Descripción general
Este artículo presenta una plataforma microscópica de multiphotones para la obtención de imágenes en vivo de la superficie ocular del ratón mediante un modelo de ratón transgénico fluorescente dual. El sistema permite la visualización en tiempo real de diversas estructuras celulares dentro de la superficie ocular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Microscopía
Antecedentes
- La microscopía de múltiples fotones es una técnica de imagen potente.
- Los ratones transgénicos fluorescentes permiten una visualización mejorada de los componentes celulares.
- Comprender la estructura de la superficie ocular es fundamental para diversas aplicaciones de investigación.
- Las técnicas de imagen sin marcado pueden complementar los métodos fluorescentes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la imagen en vivo de la superficie ocular del ratón.
- Utilizar un microscopio personalizado de multiphotones para mejorar la visualización.
- Mostrar las capacidades de los ratones transgénicos con doble fluorescencia en la imagenología.
Métodos Utilizados
- Configuración de un microscopio de múltiples fotones con objetivos y ajustes láser específicos.
- Uso de espejos dicróicos y filtros de paso de banda para la separación de señales.
- Imagen en vivo de ratones anestesiados sobre una platina de microscopio calentada.
- Visualización en tiempo real de estructuras de la superficie ocular.
Resultados principales
- Imagen satisfactoria de núcleos celulares, membranas y fibras nerviosas.
- Imagen sin marcadores de arquitecturas estromales mediante generación de segundo armónico.
- Demostración de la eficacia de la plataforma de multiphotones.
- Se validaron las capacidades de visualización en tiempo real.
Conclusiones
- La plataforma microscópica de múltiples fotones es efectiva para la imagenología ocular.
- Los ratones transgénicos con doble fluorescencia mejoran la visualización de las estructuras oculares.
- Este método puede avanzar la investigación en biología ocular y campos relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma de microscopía de múltiples fotones permite la obtención de imágenes en vivo y sin marcado de las estructuras de la superficie ocular del ratón, proporcionando información esencial sobre la biología corneal y conjuntival para el descubrimiento de fármacos oftálmicos. Al visualizar la dinámica celular, la arquitectura estromal y las redes vasculares in vivo, el método apoya la desvinculación mecanicista de los objetivos terapéuticos en modelos preclínicos de enfermedades oculares. La capacidad de la plataforma para obtener imágenes en toda la superficie ocular con posicionamiento preciso mejora la confianza predictiva en las vías de validación de objetivos y desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de núcleos celulares, membranas, fibras nerviosas y capilares en tejido ocular vivo.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante la observación en tiempo real de la arquitectura estromal mediante generación de segundo armónico y la dinámica celular en reporteros fluorescentes duales.
- Valor predictivo: Mejora la selección de carteras al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de cambios estructurales y celulares en modelos oculares relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para procesos posteriores al permitir la obtención de imágenes de alta resolución de los compartimentos epitelial, estromal, endotelial y vascular.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante la adquisición precisa de Z-stacks, la separación espectral de las señales de SHG y fluorescentes, y la posición estabilizada del globo ocular.
- Valor estratégico: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de plataformas al permitir la obtención de imágenes en toda la superficie corneal y conjuntival con mínima fototoxicidad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Aborda la relevancia de la enfermedad al permitir la reconstrucción de la arquitectura capilar tridimensional en la conjuntiva y la visualización de las capas epiteliales limbares.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar imágenes intravitales con posicionamiento preciso en diferentes regiones de la superficie ocular.
- Valor predictivo: Aborda decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar imágenes del estroma sin marcadores y mapeo celular que aportan una comprensión mecanicista de la patología ocular.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la obtención de imágenes preclínicas, apoyando la comprobación de hipótesis y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación oftálmica.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos al permitir la obtención de imágenes en vivo de la dinámica celular y estructural en la superficie ocular.
- Selección: Describe la preparación del ensayo, la reproducibilidad y las salidas cuantitativas mediante imágenes en serie Z, separación espectral de señales y condiciones de imagen estabilizadas.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o salidas estadísticas que ayudan a los equipos a comparar condiciones, incluyendo la generación de segundo armónico (SHG) para la arquitectura del colágeno y tdTomato/EGFP para la localización en membranas y núcleos.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores al permitir la reconstrucción tridimensional de capilares y el mapeo de la capa epitelial en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, adaptable a diversos modelos de enfermedades oftálmicas y puntos finales de imagen.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en la biología de la superficie ocular.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante un soporte ocular personalizado, posicionamiento estereotáxico y parámetros de imagen controlados.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías, al permitir la visualización temprana del acoplamiento al objetivo y la respuesta del tejido.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, mediante lecturas cuantitativas, libres de marcadores y fluorescentes en compartimentos corneales y conjuntivales.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en microscopía de múltiples fotones, anatomía ocular y manejo de modelos transgénicos.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo láser de titanio-safiro, espejos dicróicos, filtros de banda pasante, platina motorizada y software de reconstrucción 3D.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de adquisición, configuraciones de detección de señal y tuberías de procesamiento de imágenes (por ejemplo, complementos de Fiji para reducción de ruido y mejora del contraste).
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, incluyendo ajuste del estabilizador de párpado, gel acoplante de la superficie ocular y longitudes de onda de excitación para diferentes reporteros fluorescentes.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: estabilizar el globo ocular con presión moderada sin causar lesión es fundamental, ya que una presión insuficiente o excesiva compromete la calidad de la imagen.
