Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos sanos a largo plazo de neuronas primarias del hipocampo de ratón a ultra baja densidad, con el fin de facilitar el marcaje inmunocitoquímico y el estudio de los mecanismos autónomos de las células neuronales. Este estudio puede ayudar a comprender algunas cuestiones clave en el campo de la investigación en neurociencia, como los estudios sobre la especificidad de las proteínas en la neuromorfología de la función del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que permite que las neuronas crezcan a una densidad ultra baja en un cubreobjetos sin el apoyo de una capa alimentadora glial.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Mariel Piechowicz, una alumna de mi laboratorio. Prepare dos placas de 24 pocillos de alta densidad y dos de baja densidad. Con una aguja de calibre 28, grabe el fondo de las placas de 24 pocillos, de modo que los plásticos desplazados actúen como soporte para los cubreobjetos con neuronas de baja densidad que crecen en ellos.

Transfiera los cubreobjetos de vidrio estéril a las dos placas de 24 pocillos designadas para cultivos de baja densidad. Cubra las cuatro placas con 300 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro de poli-D-lisina diluida en tampón de borato y devuélvalas a la incubadora para el recubrimiento de incubación durante la noche. Antes de la recolección de tejidos, prepare dos placas de Petri de 10 centímetros llenas de HBSS estéril helado.

Bajo el microscopio, sostenga el embrión por el cuello con las pinzas y haga el primer corte justo en la línea media, por debajo del nivel del cerebelo. Posteriormente, haz un corte en el lado izquierdo de la base del cráneo. A continuación, haz otro corte en el lado derecho de la base del cráneo.

Deje una pequeña parte del cráneo, el hueso y el tejido de la piel en el extremo rostral sin cortar, de modo que todo el cerebro pueda voltearse a un lado para extraerlo fácilmente. Ahora transfiera el cerebro a la solución HBSS. Inspeccione el cerebro para asegurarse de que esté intacto, sin regiones cortadas macroscópicas.

Luego, repita los procedimientos para recolectar el resto de los cerebros del embrión en una nueva placa de Petri que contenga 20 mililitros de tampón HBSS frío. Coloque cada cerebro con el lado ventral hacia arriba. Mientras sujeta el cerebro con pinzas en el extremo caudal, haga un corte diagonal entre el punto rostral medio y la región temporal caudal con una pinza afilada.

Repite esto para el otro hemisferio. Después, separa los dos hemisferios con el hipocampo intacto del resto de los tejidos troncales del cerebro. Repita los procedimientos para todos los cerebros y junte todos los hemisferios disecados.

A continuación, retira las meninges con dos pares de pinzas. Identificar el hipocampo en desarrollo como una estructura curva que se pliega dentro del lóbulo temporal y sepáralo de los tejidos corticales adyacentes. Recoge y agrupa todos los tejidos del hipocampo.

En este procedimiento, transfiera todos los hipocampos disecados a la solución de digestión enzimática en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, coloque el tubo dentro de un baño de agua e incube a 37 grados centígrados durante 25 minutos. Después de 25 minutos, retire con cuidado la solución enzimática.

Luego, agregue cinco mililitros de medio de lavado tibio para llevar el volumen total a 10 mililitros. Lave suavemente el pañuelo invirtiendo lentamente el tubo cinco veces. Retire el medio de lavado y agregue 10 mililitros de medio de lavado nuevamente, para un lavado adicional.

Después de eso, retire el medio de lavado y agregue tres mililitros de medio de lavado fresco y tibio nuevamente. Agite el tubo con la mano rigurosamente 15 veces para desalojar las neuronas digeridas del tejido. El medio debe volverse turbio una vez que las células se separan del tejido en el medio de lavado.

Luego, recoja la suspensión celular en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros, mientras deja el tejido restante en el tubo. Después de eso, agregue otros dos mililitros de medio de lavado al pañuelo y separe suavemente el tejido restante triturando con una pipeta de plástico 15 veces. Deje reposar la suspensión celular durante cinco minutos antes de agruparla en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros que contiene las células de agitación recolectadas.

Luego, cuenta la densidad de neuronas con un hemocitómetro. Calcule el volumen de suspensión celular necesario para producir una densidad de 250.000 neuronas por mililitro, y agréguelo a uno de los dos tubos cónicos que contienen 30 mililitros de medio de cultivo completo, para producir un medio de recubrimiento de neuronas de alta densidad. Transfiera 1,2 mililitros de esta solución de neuronas de alta densidad a otros 30 mililitros de medio de cultivo completo, para producir una concentración de 10.000 neuronas por mililitro, y utilice esta solución para sembrar los cubreobjetos de baja densidad.

En este procedimiento, coloque placas de 24 pocillos con fondos grabados para neuronas de alta densidad en la campana de cultivo. Retire 300 microlitros del medio preacondicionado al vacío, luego coloque 0,6 mililitros de suspensión celular de alta densidad a 250.000 neuronas por mililitro. Coloque las otras dos placas de 24 pocillos con cubreobjetos en la campana de cultivo.

Retire 300 microlitros del medio preacondicionado al vacío, antes de colocar 0,6 mililitros de suspensión celular de baja densidad a 10.000 neuronas por mililitro en los cubreobjetos. Luego, regrese las cuatro placas de 24 pocillos a la incubadora e incube durante dos horas. Después de eso, voltee los cubreobjetos de baja densidad con las neuronas adheridas al cultivo de alta densidad y asegúrese de que las neuronas estén una frente a la otra.

Posteriormente, devuelva las dos placas con cocultivo a la incubadora. Alimente los cocultivos añadiendo 300 microlitros de medio de alimentación fresco en DIV cinco. Después de esta alimentación inicial, agregue 300 microlitros de medio de alimentación fresco sin arabinósido de citosina a cada pocillo cada semana.

En caso de que el cultivo se mantenga durante más de un mes, reemplace la mitad del medio con medio de alimentación fresco cada semana después de un mes. Morfológicamente, tanto las neuronas de alta densidad como las de baja densidad deberían tener un aspecto saludable hasta tres meses. En este caso, el marcaje inmunocitoquímico se utiliza para revelar las sinapsis glutamatérgicas funcionales en las que la subunidad NR1 del receptor NMDA y la subunidad GluR1 del receptor ApoE se marcan con doble tinción.

Y las sinapsis funcionales se pueden identificar y cuantificar fácilmente utilizando la imagen J.Las neuronas de baja densidad también se marcan con anticuerpos contra el marcador de proteína dendrítica MAP2 en combinación con el marcador de proteína axonal p-Tau. Este doble marcaje permite una clara distinción de dendritas y axones. Los cultivos de baja densidad también se pueden transfectar con éxito con plásmidos de ADN utilizando métodos de fosfato de calcio, aunque la tasa de transfección suele ser muy baja en etapas posteriores.

Esta figura ilustra que la transfección de EGFP puede revelar la morfología neuronal y hacer visibles las estructuras finas de la espina dendrítica. Por último, como prueba de concepto, las neuronas de ultra baja densidad pueden cultivarse en condiciones que promuevan la formación de autamasa. Estas neuronas autápticas de ultra baja densidad cultivadas en microislas recubiertas de poli-D-lisina, pueden ser sostenidas por las neuronas alimentadoras de alta densidad más allá de los dos meses con este protocolo de cocultivo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas el día del cultivo celular si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es fundamental recubrir los resbalones de la cubierta de vidrio y los fondos de las placas de 24 pocillos con Poly-D-lisina. Un simple grabado de los fondos de las placas es adecuado para proporcionar apoyo mecánico y nutricional a las neuronas del hipocampo de baja densidad para que crezcan en los cubreobjetos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar neuronas embrionarias primarias del hipocampo de ratón de densidad ultrabaja, en ausencia de una capa alimentadora glial. Con suerte, puede utilizar este método para su propio propósito experimental.