Name: Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a utilizar matrices de LED asequibles para la fotoestimulación de neuronas en preparaciones de electrofisiología. Este método permite controlar con precisión la actividad de neuronas adultas recién nacidas.

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Este trabajo fue apoyado por la compañía de seguros de vida &quot;, AG2R-La Mondiale-&quot;, Escuela de Neurociencias de París (PEV), la Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-neur-004&quot; en el marco de la &quot;ERA-NET NEURON &quot;del 7 º PM programa por la Comisión Europea y la Fundación Pasteur. Sebastien Wagner fue apoyada por la Fundación Letten.

1. Calibración óptica: LED de medición <ol><li> Adjunte una matriz de LED a un disipador activo refrigerado por un ventilador y poner este mismo aparato LED / disipador de calor a una lente de colimación. </li><li> Cambiar la lámpara utilizada en campo claro de iluminación con LED / disipador / ventilador / aparato de la lente. Este aparato debe ser cuidadosamente colocado de modo que el haz colimado LED viaja en línea recta hacia la óptica de la lente condensadora. Asegúrese de que el disipador / ventilador está correctamente conectado a tierra a un terreno común del sistema. </li><li> Unidad de la matriz de LED con una fuente de alimentación que puede dar pulsos rápidos y de la plaza de la corriente. Esta fuente de alimentación puede ser controlada por un pulso de 5V TTL procedente de un generador de impulsos. </li><li> Centro del haz colimado a lo largo de la trayectoria de la luz se define entre el diafragma de campo y la lente del condensador. Lo ideal sería que el haz LED ligeramente llene excesivamente el diafragma de campo abierto por completo. Por lo general, un haz de luz más bien colimada llenará esta apertura menor, y se produce mortalidade el poder a costa de la uniformidad. En nuestra configuración hemos aumentado uniformidad de la luz por la elección de una lente de colimación que proyecta una imagen un poco más amplia de la matriz de LED en su plano conjugado en el diafragma consenser. </li><li> Alcanzar la iluminación Kohler, centrándose en el condensador para que la imagen del diafragma de campo (el diafragma más cercano a la fuente de luz) se centra en la cámara de corte (fig. 1). Un tejido fino de papel de la lente puede actuar como una pantalla de proyección para visualizar la imagen enfocada del diafragma de campo en otras profundidades. </li><li> Perforar una serie de agujeros de diámetro conocido en un material opaco. Coloque uno de estos pequeños agujeros sobre el sensor de potencia óptica metros. Coloque el medidor de potencia en el escenario de muestras y el centro del medidor de potencia sobre la imagen, centrado en el diafragma de campo con sólo mover el medidor de potencia hasta que se le da una lectura máxima. Colocar el medidor de potencia en esta posición. </li><li> Abra completamente todas las aberturas (diafragma y aperaturecampo de diafragma). Sistemáticamente mover la cámara de corte adjunto / medidor de potencia en relación con el paso de luz óptica y cálculo de la uniformidad de la potencia óptica en el área iluminada. Construcción de la trama la uniformidad de su sistema. Si el microscopio está bien configurada con iluminación Kohler centrado en el foco del objetivo, la potencia máxima debe estar directamente debajo del objetivo, y regiones fuera de este enfoque ahora debe recibir una cantidad conocida de energía de acuerdo con el argumento de uniformidad. </li><li> Para cada tamaño de agujero de alfiler, construir una curva de nivel de potencia óptica frente a la superficie del agujero de alfiler. Mediante el ajuste de la corriente de entrada a la matriz de LED, produce esta curva en varios niveles de potencia y de cada curva de calcular la potencia por mm2. Si el conjunto de LEDs se va a utilizar para la óptica de parches, asegúrese de introducir elementos ópticos necesarios para parchear (condensadores, perforaciones y filtros) para saber la cantidad de luz se transmite bajo la iluminación de parches. </li><li> Dar la vuelta al medidor de potencia parafrente a los objetivos, calcular la intensidad de la iluminación a 470 nm cuando la lámpara de mercurio está encendido. </li><li> Añadir un trozo vivo de la cámara, y la reconstrucción de las curvas de calibración para determinar la potencia de la luz transmitida a través del tejido cerebral de dispersión. </li></ol> 2. Procedimiento de corte y Electrofisiología Parte A: Preparación Cortar <ol><li> Anestesiar (60 mg / kg de ketamina y xilazina 2mg/kg) y decapitar el ratón. Diseccionar el cerebro artificial en el líquido cefalorraquídeo (ACSF, en mM: NaCl 124, KCl 3, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glucosa, 2 CaCl2; ~ 310mOsm, pH 7,4, cuando se burbujea con una mezcla de O2 95% y el 5% de CO 2 5,1), teniendo cuidado de no dañar los bulbos olfatorios. Separar los dos hemisferios y el lugar en agar con la superficie ventral, incluso con una ventaja (para las secciones horizontales). </li><li> Pegue el agar y la superficie dorsal de cada hemisferio cortical a la vibrAtome mandril, y poco a poco llenar la bañera con helado de ACSF. Rebanada de la superficie ventral en 300 secciones micras, la transferencia de cada sección para calentar (34-36 ° C) y oxigenada ACSF, que les permita recuperar durante 30-45 minutos. </li></ol> Parte B: Medición parche suelto del Umbral a Spike <ol start="3"><li> Después de llevar los cortes a la temperatura ambiente durante 30 minutos, con cuidado coloque una rebanada en la cámara de grabación de la cámara del microscopio en la perfusión constante de ACSF oxigenada. Corren el riesgo de excesiva estimulación ChR2 neuronas infectadas, la presencia de EYFP-ChR2 se puede confirmar en epifluorescencia (fig. 2a) </li><li> Tire de los electrodos de vidrio en un extractor de pipeta (Sutter P-97). Rellene este electrodo con ACSF. Cuando se coloca en el baño de la resistencia ACSF punta debe estar entre 7.10 MOhms. </li><li> Bajo iluminación fluorescente, localizar en el corte una sana ChR2-EYFP neuronas con morfología madura. También localizar soma esta neurona bajo la óptica de parches. </li><li> Con una ligera presión positiva pasa a través de la punta del electrodo, el electrodo inferior parche hacia la neurona identificado fluorescentes. Contacto con la membrana se hace, de forma rápida liberación de presión positiva y aplique una pequeña cantidad y breve de succión a través de la punta. Un sello de giga-ohm debe hacerse entre la membrana plasmática y las paredes de los electrodos de parche. </li><li> Incluso si un giga-sello no se forma, si el electrodo está suficientemente cerca de una actividad de las neuronas fluorescentes adición debe producir un potencial medible de campo local. Activar ChR2 en esta neurona mediante el parpadeo de las diferentes dosis de la luz. Porque la luz de dosis es una función tanto de LED y la duración, calcular cuánta luz es necesaria para provocar un potencial de acción en múltiples poderes y duración (figura 2b). También se observa la cantidad de adición se produce en el mercurio de iluminación de la lámpara. </li></ol> 3. Los resultados representativos: En nuestro microscopio (Olympus BX51WI), nuestro LED i esn línea con dos aberturas y una lente de condensador, manteniendo así el paso de luz original de la fábrica instalada lámpara de arco. Al cerrar tanto el diafragma de campo y el diafragma aperature, podemos lograr el contraste suficiente para grabaciones de campo claro de patch clamp (fig. 1b). Con todos los diafragmas completamente abierto que exponga el sector a la luz de encendido máximo para canalrodopsina activación (fig. 1a). En nuestro microscopio, esta configuración de parches produce la luz-la densidad que es aproximadamente tres órdenes de magnitud menor que la densidad máxima de campo completo (4,1 mW / mm 2 frente a 6,88 mW / mm 2). Vemos etiquetado robusto de adultos nacidos en gránulos bulbo olfatorio y semanas después de la infección neuronas periglomerular lentiviral de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral (fig. 2a) Una grabación sueltas parche de un solo adulto de origen ChR2-EYFP expresión de células granulares indica que un 5 ms de estimulación en Maximum poder (6,88 mW / mm 2) es suficiente para provocar picos (figura 2b). Dado que el nivel de expresión varía entre las células, la cantidad de luz que pasa el umbral de la punta puede variar y deben ser descritos estadísticamente para cada tipo de célula de interés. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. LED de matriz para la configuración de campo completo de la fotoestimulación y patch-clamp electrofisiología rebanada. Para activar canalrodopsina (ChR2) que proyectan un haz colimado a través de aberturas de atrás abierta y la óptica del condensador (a). Esta configuración se puede cambiar en la óptica de parches de alto contraste por completo cerrar el diafragma de campo y la modulación de la anchura del diafragma de campo (b). Abreviaturas: a. ventilador, disipador de calor b., c. serie LED, d. colimador lentes, espejos e., f. diafragma de campo, el diafragma g. de apertura, la lente del condensador h., i. SAetapa MPLE, j. objetivo. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagen de una sección horizontal de 300μm bulbo olfatorio de patch clamp y fotoestimulación todo el campo (a). Lentivirally adultos infectados nacidos en las células granulares expresar ChR2-EYFP se puede ver irradiando desde el centro del bulbo olfatorio. La luz de dosis necesarias para provocar picos se puede encontrar mediante el aumento de la duración del flash LED (b). El umbral de esta era de células granulares de 5 ms a plena intensidad LED (2.43mW/mm 2). Escala en (a) = 500μm, la escala en (b) = 50 ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
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<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
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<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En los últimos años han visto una explosión en la popularidad de las herramientas para la investigación en neurociencias optogenetic 6. Como resultado de ello, es cada vez más importante para reducir la barrera de entrada para los laboratorios que deseen comenzar a utilizar estas nuevas herramientas. A continuación se describe cómo llevar a cabo una adaptación fácil y barato y la calibración de un sistema convencional de patch-clamp plataforma para que pueda hacer todo el campo de la estimulación óptica de ca...

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Estirador de pipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1.5 mm de diámetro externo/1.17 mm de diámetro interno</td></tr><tr><td>Matriz de LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Lente colimadora</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>Diámetro del haz de 40 mm</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2.8 amperios</td></tr><tr><td>Medidor de potencia óptica</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Disipador de calor</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Ventilador</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando asequible estructuras de led para fotos-estimulación de las neuronas

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Electrofisiología rebanada estándar ha permitido a los investigadores para probar los componentes individuales de los circuitos neuronales mediante el registro de las respuestas eléctricas de las células individuales en respuesta a las manipulaciones de 1,2 eléctrica o farmacológica. Con la invención de métodos para controlar ópticamente genéticamente las neuronas específicas (optogenética), los investigadores ahora tienen un nivel sin precedentes de control sobre grupos específicos de neuronas en la preparación rebanada estándar. En particular, fotosensibles canalrodopsina-2 (ChR2) permite a los investigadores para activar las neuronas con luz 3,4. Mediante la combinación de una cuidadosa calibración de LED basada en la fotoestimulación de ChR2 con electrofisiología rebanada estándar, se podrá analizar con mayor detalle el papel de los adultos nacidos en las interneuronas en el bulbo olfatorio, el primer relevo el centro del sistema olfativo. Utilizando la expresión viral de ChR2-YFP específicamente en los adultos nacidos en las neuronas, que pueden controlar de forma selectiva los adultos jóvenes nacidos en las neuronas en un entorno de mayores unad maduro neuronas. Nuestro control óptico utiliza un sistema sencillo y barato LED, y se muestra cómo este sistema puede ser calibrado para comprender cuánta luz se necesita para provocar picos de actividad de neuronas individuales. Por lo tanto, breves destellos de luz azul puede controlar a distancia el patrón de activación de las células transducidas ChR2-recién nacido.

Adultos nacidos en las neuronas que expresan ChR2 puede ser manipulado en los preparativos rebanada electrofisiológicos para examinar su contribución a la función olfativa de los circuitos neuronales.

Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas

La electrofisiología estándar en rebanadas ha permitido a los investigadores sondear componentes individuales de la circuitería neuronal mediante el registro de las respuestas eléctricas de neuronas individuales...

El objetivo de este procedimiento es preparar y operar remotamente matrices de LED para controlar la actividad neuronal en cortes cerebrales. Esto se logra utilizando cortes in vitro de animales con neuronas que expresan el canal REDSIN dos, y empleando una matriz de LED junto con un microscopio para activar dichas neuronas. Este video explica cómo calibrar un LED y un microscopio para entregar intensidades conocidas de luz a la cámara del corte.Con este montaje, se pueden medir con precisión los umbrales de activación de las neuronas que expresan el canal dos en respuesta a la estimulación luminosa mediante una estimulación amplia de las neuronas que expresan el opsin del canal dos. Esta técnica permite un control óptico temporalmente preciso de una gran población neuronal. La principal ventaja de este método frente a las técnicas optogenéticas existentes, incluidas aquellas que utilizan láseres o métodos basados en obturadores, es que es muy económica y puede adaptarse fácilmente a un microscopio existente para registro con parche.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, como por ejemplo cómo la actividad influye en la integración de nuevas neuronas en el cerebro adulto. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia terapias o diagnósticos basados en células madre neurales adultas, ya que ofrece un control temporal preciso sobre la actividad de las neuronas nacidas en la edad adulta que se integran en la circuitría neural existente. Aunque este método puede proporcionar información sobre las consecuencias funcionales de la neurogénesis adulta, también puede realizarse en cualquier preparación in vitro.Neuronas que expresan el canal que contiene. Comience por seleccionar una matriz de LED que produzca su potencia máxima en la longitud de onda deseada. Además, elija la matriz con una clasificación máxima de corriente. Integre la matriz de LED al microscopio.Comience por fijar la matriz de LED a un ventilador llamado disipador de calor utilizando pasta térmica para aumentar la eficacia del disipador. Luego, retire el LED estándar de baja potencia de su conjunto de lente y sujete el LED de mayor potencia a la lente. Ahora reemplace la lámpara de campo claro con el dispositivo de LED ensamblado y asegúrese de que el ventilador esté conectado a tierra de forma segura al terminal común del sistema.La colocación cuidadosa de las matrices de LED es necesaria para asegurar que la luz emitida coincida con el objetivo. Objetivo: lograr la iluminación de Köhler enfocando el condensador de manera que la imagen del diafragma de campo se enfoque sobre la cámara de la sección y quede centrada bajo la trayectoria óptica del objetivo. Un trozo delgado de papel de lente puede ayudar a enfocar la imagen de la abertura posterior a otras profundidades.Ahora, perfore agujeros de diámetros conocidos en un material opaco que pueda actuar como una abertura para el medidor de potencia. Coloque uno de estos pequeños orificios sobre el sensor del medidor de potencia óptica. Luego, fije el medidor de potencia al microscopio para enfocar el condensador sobre el orificio.Coloque manualmente el medidor de potencia hasta que dé una lectura máxima. Fije el medidor de potencia en esta posición. Si el máximo del medidor de potencia está por encima del plano del corte, restablezca la iluminación de Köhler en ese plano.A continuación, abra completamente todas las aberturas. Mueva sistemáticamente el medidor de potencia con respecto a la trayectoria óptica de la luz utilizando los manipuladores de la platina. Una vez finalizado, mida la uniformidad de la potencia óptica dentro del área iluminada tomando sistemáticamente mediciones de potencia en una cuadrícula alrededor de la potencia máxima, que debería estar situada bajo el foco del objetivo. El microscopio está configurado correctamente con la iluminación enfriada centrada en el foco del objetivo; la potencia máxima del arreglo debe estar en esta zona focal, y las regiones fuera del foco ahora deben recibir una cantidad conocida de potencia según el gráfico de uniformidad.Ahora, mida la potencia máxima para cada pinhole según el tamaño, conociendo el diámetro de la broca utilizado para fabricar cada uno, y represente gráficamente la potencia óptica en función del área del pinhole. Debido a que los pinholes perforados no son perfectos, promediar estos valores producirá una buena estimación de la densidad de potencia óptica. La matriz de LED se utilizará para la óptica de parcheo.Asegúrese de tener en cuenta todos los elementos ópticos necesarios para el registro cuando construya la gráfica de potencia y la gráfica de uniformidad. Por ejemplo, muchos microscopios cuentan con una pantalla difusora giratoria que puede utilizarse, sacrificando potencia a cambio de uniformidad. Prepare cortes de tejido cerebral utilizando métodos estándar y, mientras permite que los cortes se recuperen durante 30 a 45 minutos en un ACSF calentado, prepare los pipetas de registro.Una vez que los tejidos se hayan recuperado, coloque suavemente una sección en la cámara de registro del microscopio bajo perfusión constante de A CSF oxigenado. Confirme la presencia del canal EYFP red en dos canales mediante epifluorescencia bajo iluminación fluorescente. Localice en la sección una neurona EYFP del canal dos saludable con morfología madura.Luego, localice este soma neuronal bajo la óptica de registro y forme un sello de gigaohmio entre la membrana plasmática y las paredes del electrodo de registro. Si el electrodo está suficientemente cerca de una neurona que genera potenciales de acción, la actividad espontánea debería producir un potencial de campo local medible incluso sin un sello de gigaohmio. Ahora active el canal opsinas dos en esta neurona mediante pulsos de luz de diferentes dosis, ya que la dosis de luz depende tanto de la potencia como de la duración del LED; calcule cuánta luz es necesaria para evocar un potencial de acción a múltiples potencias y duraciones.Se configuró un microscopio Olympus BX 51 wi con un LED alineado con dos diafragmas y una lente condensadora. Se obtuvo un contraste suficiente en campo claro para la grabación mediante parche en modo ciego al cerrar tanto el diafragma de campo como el diafragma de apertura. Se construyó un gráfico de uniformidad de la intensidad de la luz LED en una región alrededor del campo de visión del objetivo indicado por el círculo punteado.Con todos los diafragmas completamente abiertos, los cortadores fueron expuestos a la potencia máxima de luz para la activación del canal adoptina. Esta configuración produce una luz tres órdenes de magnitud más potente que la configuración utilizada para la visualización en el registro por parche. Se observó una marcación generalizada de las neuronas granulares y periglomerulares del bulbo olfatorio nacidas en adultos cuatro semanas después de la infección lentiviral de neuroblastos migratorios en la corriente migratoria rostral.Los registros de parche suelto de un único canal nacido adoptando una célula granular que expresa EYFP indicaron que, para esta neurona, una estimulación de cinco milisegundos a potencia máxima fue suficiente para provocar descargas eléctricas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una tarde. Es importante recordar que, tras este procedimiento, siempre se debe monitorear el equipo y los ajustes para detectar deriva a lo largo del tiempo. Desde su desarrollo, tales técnicas optogenéticas han allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren la transmisión y la integración sinápticas en varios organismos modelo, como el gusano, la mosca, el ratón e incluso el primate.

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Neurociencia

Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Este video muestra un procedimiento para analizar la conectividad sináptica entre la corteza prefrontal medial (mPFC) y las neuronas de la amígdala utilizando cortes de cerebro de amígdala aguda de ratones. Las neuronas mPFC de estos ratones expresan canalrodopsina fusionada con una proteína fluorescente. Las canalrodopsinas facilitan la entrada de iones y la generación de potencial de acción en las neuronas mPFC tras la activación de la luz. En consecuencia, las neuronas mPFC liberan...

Visualización y mapeo de vías neuronales en un corte de cerebro de amígdala

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Aquí describimos nuestra estrategia para obtener registros estables y bien aislados de una sola unidad a partir de interneuronas inhibitorias identificadas en la corteza del ratón anestesiado. Las neuronas que expresan ChR2 se identifican por su respuesta a la luz azul. El método utiliza un equipo de registro extracelular estándar y sirve como una alternativa económica a las imágenes de calcio o a los parches guiados visualmente.

Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Se describe un método para la estimulación de la actividad eléctrica de cultivos celulares in vitro con luz visible, basado en el uso de polímeros semiconductores orgánicos.

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.

El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos

Este protocolo describe cómo realizar experimentos optogenéticos para controlar la expresión génica con luz roja y roja lejana utilizando PhyB y PIF3. Se incluyen instrucciones paso a paso para construir un sistema de iluminación simple y flexible, que permite el control de la expresión génica u otra optogenética con una computadora.

Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos

Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

Los avances recientes en la investigación del dolor destacan el potencial de la fotoneuromodulación utilizando diodos emisores de luz verde (GLED) como tratamiento no farmacológico. GLED modula las vías del dolor, ofreciendo un alivio eficaz del dolor. Este artículo tiene como objetivo estandarizar y refinar los protocolos de exposición a GLED, mejorando la consistencia entre estudios y avanzando en la aplicación clínica de esta terapia.

Optimización de las técnicas de fotoneuromodulación para evaluar el papel de los diodos emisores de luz verde en el tratamiento del dolor

Aprende a utilizar matrices de LED asequibles para la fotoestimulación de neuronas en preparaciones de electrofisiología. Este método permite controlar con precisión la actividad de neuronas adultas recién nacidas.

Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas

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