Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas

El objetivo de este procedimiento es preparar y operar de forma remota matrices de LED para controlar la actividad neuronal en cortes de cerebro. Esto se logra utilizando cortes in vitro de animales con el canal REDSIN dos neuronas expresivas, y usando una matriz de LED junto con un microscopio para activar esas neuronas. Este video cubre cómo calibrar un LED y un microscopio para entregar intensidades conocidas de luz a la cámara de corte.

Con esta configuración, los umbrales de activación de las neuronas que expresan el canal dos se pueden medir con precisión en respuesta a la estimulación de la luz a través de la estimulación de campo amplio de las neuronas que expresan opsina dos del canal. Esta técnica permite un control óptico temporalmente preciso de una gran población neuronal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos optogenéticos existentes, incluidos los que utilizan láseres o métodos basados en obturadores, es que es muy económica y se puede ajustar fácilmente a un visor de pinza de parche existente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis adulta, incluyendo cómo la actividad da forma a la integración de nuevas neuronas en el cerebro adulto. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia terapias o diagnósticos basados en células madre neurales adultas, ya que ofrece un control temporal preciso sobre la actividad de las neuronas nacidas adultas que se integran en los circuitos neuronales existentes. Aunque este método puede proporcionar información sobre las consecuencias funcionales de la neurogénesis adulta, también se puede realizar en cualquier preparación in vitro.

Contiene neuronas que expresan la adopción de canales Comience seleccionando una matriz de LED que produzca su potencia máxima en la longitud de onda deseada. Además, elija la matriz con una clasificación de corriente máxima. Integre la matriz de LED en el microscopio.

Comience conectando la matriz de LED a un ventilador llamado disipador de calor usando pasta térmica para aumentar la efectividad del disipador de calor. A continuación, retire el LED de baja potencia de su conjunto de lente y fije el LED de mayor potencia a la lente. Ahora reemplace la lámpara de campo claro con el aparato LED ensamblado y asegúrese de que el ventilador esté conectado a tierra de forma segura a la tierra común del sistema.

Es necesario colocar cuidadosamente las matrices de LED para garantizar que la luz realizada por la llamada esté en línea con el objetivo. Objetivo. Logre la iluminación Kohler enfocando el condensador de modo que la imagen del diafragma de campo se enfoque en la cámara de corte y se centre debajo de la trayectoria óptica del objetivo. Un pañuelo fino de papel para lentes puede ayudar a enfocar la imagen de la apertura trasera a otras profundidades.

Ahora, perfore agujeros de diámetros conocidos en un material opaco que pueda actuar como una apertura para el medidor de potencia. Coloque uno de estos pequeños orificios sobre el sensor del medidor de potencia óptica. A continuación, fije el medidor de potencia al microscopio para enfocar el condensador en el agujero de alfiler.

Coloque manualmente el medidor de potencia hasta que dé una lectura máxima. Coloque el medidor de potencia en esta posición. Si el máximo del medidor de potencia está por encima del plano de la rebanada, restablezca la iluminación Kohler en ese plano.

A continuación, abra completamente todas las aberturas. Mueva sistemáticamente el medidor de potencia en relación con la trayectoria de la luz óptica utilizando los manipuladores de etapa. Una vez terminado, mida la uniformidad de la potencia óptica dentro del área iluminada tomando sistemáticamente lecturas de potencia en una cuadrícula alrededor de la potencia máxima, que debe estar bajo el foco del objetivo, el microscopio está configurado correctamente con una iluminación más fría centrada en el foco de los objetivos, la potencia máxima de la matriz debe estar en este enfoque las regiones fuera del foco ahora deben recibir una cantidad conocida de potencia de acuerdo con la uniformidad conspirar.

Ahora, mida la potencia máxima para cada tamaño de agujero de alfiler con conocimiento del diámetro de la broca utilizada para hacer que cada orificio trace la potencia óptica en función del área del orificio. Debido a que los orificios perforados no son perfectos, el promedio de estos valores producirá una buena estimación de la densidad de potencia óptica. La matriz de LED se utilizará para parchear la óptica.

Asegúrese de tener en cuenta todos los elementos ópticos necesarios para el parcheo cuando construya el gráfico de potencia y el gráfico de uniformidad. Por ejemplo, muchos microscopios tienen una pantalla difusora abatible que puede usar y que sacrificará la potencia en aras de la uniformidad. Prepare los cortes de tejido cerebral usando métodos estándar, y mientras deja que los cortes se recuperen durante 30 a 45 minutos en un líquido cefalorraquídeo A caliente, vaya y haga las pipetas de parche.

Una vez que los tejidos se hayan recuperado, coloque suavemente un corte en la cámara de registro del microscopio bajo perfusión constante de LCR A oxigenado. Confirmar la presencia de rojos de canal EYFP en dos canales por epifluorescencia bajo iluminación fluorescente. Localiza en el corte una neurona EYFP de canal dos sana con morfología madura.

A continuación, localice este soma neuronal bajo la óptica de parche y produzca un sello de giga ohmios entre la membrana plasmática y las paredes del electrodo de parche. Si el electrodo está lo suficientemente cerca de una neurona en punta, la actividad espontánea debería producir un potencial de campo local medible incluso sin un sello de giga ohmios. Ahora activar el canal adopta dos en esta neurona al parpadear diferentes dosis de luz porque las dosis de luz en función de la potencia y la duración del LED calculan cuánta luz es necesaria para evocar un potencial de acción a múltiples potencias y duraciones.

Un microscopio Olympus BX 51 wi se configuró con un LED en línea con dos aperturas y una lente de condensador. Se obtuvo suficiente contraste de campo claro para la grabación de la pinza de parche cerrando tanto el diafragma de campo como el diafragma de apertura. Se construyó un gráfico de uniformidad de la intensidad de la luz LED en una región alrededor del campo de visión del objetivo indicado por el círculo punteado.

Con todos los diafragmas completamente abiertos, los cortadores se expusieron a la máxima potencia de luz para la activación del canal. Esta configuración produce una luz tres órdenes de magnitud más potente que la configuración utilizada para la visualización de la fijación de parches. Se observó un marcaje generalizado del gránulo del bulbo olfativo nacido en adultos y de las neuronas glomerulares cuatro semanas después de la infección lentiviral del neuroblasto migratorio en la corriente migratoria rostral.

Las grabaciones de parches sueltos de un solo canal nacido Adoptin dos células granulosas que expresan EYFP indicaron que para esta neurona, una estimulación de cinco milisegundos a máxima potencia era suficiente para evocar picos. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en una tarde. Es importante recordar después de este procedimiento que siempre debe monitorear su equipo y su configuración para detectar la deriva con el tiempo Desde su desarrollo, estas técnicas optogenéticas han allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploren la transmisión sináptica y la integración en una serie de organismos modelo como gusanos, moscas, ratones e incluso primates.