Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

El objetivo general de este protocolo es desarrollar un método de alta eficiencia y alto rendimiento para generar células dendríticas o DC, que reflejen fatídicamente su divergencia fenotípica y funcional in vivo. Las células dendríticas existen como grandes poblaciones en los órganos linfoides. Por lo tanto, utilizamos ligando filtro para aumentar la frecuencia de estas células esenciales en los tejidos del donante para facilitar ese aislamiento.

La principal ventaja de esta técnica es que elimina la generación de todos los subconjuntos de DC en números adecuados para el análisis utilizando solo los agentes disponibles comercialmente. Para recolectar el ligando flt-3 que expresa células de melanoma B16 de un cultivo confluente al 90%, primero lave las células con PBS e incube el cultivo con 05% de tripsina a 37 grados Celsius. Después de 5 minutos, apague la actividad de la proteasa con 20 mililitros de medio dima completo de 4 grados centígrados y separe la capa del modelo celular adherente con un ligero golpeteo y un pipeteo suave.

Recoja las células por centrifugación y cuéntelas. A continuación, vuelva a suspender la suspensión unicelular a una concentración de 1 veces a 8 células por mililitro en PBS para su inyección subcutánea en ratones receptores C57 black 6. Cuando el tumor alcance de dos a diez mililitros de diámetro, recoja los bazos de los animales portadores de tumores y colóquelos en una placa de Petri que contenga medio RPMI fresco.

Con un bisturí, corte los tejidos en trozos de 0,2 centímetros cuadrados y luego incube los fragmentos en diez mililitros de colagenasa y Dnasa a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos, vierta la suspensión de tejido parcialmente digerida en un colador de células de 70 micras y use un émbolo de jeringa de cinco mililitros para presionar los fragmentos de tejido restantes a través de la malla del colador. Enjuague el filtro con 10 mililitros de medio fresco, agrupando el lavado con el resto de la suspensión unicelular y pelice las celdas.

Suspendemos el pellet de células en 2 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, lave las células en 10 mililitros de medio RPMI fresco y vuelva a suspenderlas a 1 veces 10 hasta las 8 células por mililitro en el tampón de clasificación de células que contiene el bloque FC. Para aislar las CD del cítodo plasmático, mezcle bien 300 microlitros de cóctel de anticuerpos marcados con biotina de un kit de aislamiento de CC del cítodo plasmático con 200 microlitros de la suspensión unicelular esplénica.

Coloque las células en un baño de agua helada durante 15 minutos, con golpecitos suaves cada tres minutos. A continuación, lave las celdas con 12 mililitros de tampón de clasificación de células y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación fresco. A continuación, incube las células en 300 microlitros de perlas conjugadas con anti-biotina y anticuerpos durante otros 15 minutos en el agua helada con golpecitos regulares.

Después de lavar las celdas en tampón de clasificación nuevo, vuelva a suspender el palet en 2 mililitros de tampón de clasificación de celdas y cargue una columna magnética de tamaño adecuado en su imán correspondiente. Equilibre la columna con cinco mililitros de tampón de clasificación de celdas fresco de 4 grados Celsius. Cuando todo el tampón se haya drenado de la parte superior de la columna, agregue con cuidado las celdas al centro de la superficie de la cabeza de la columna y recoja el flujo.

A continuación, lave la columna con 10 mililitros de tampón de clasificación fresco a 4 grados centígrados y recoja el flujo en el mismo tubo. Después de pasar a través de una segunda columna magnética, se puede esperar una población de células dendríticas de cítodos de plasma con una pureza superior al 94%. Para aislar las CD8aplha+y CD8alpha-DCs, mezcle el resto de la suspensión de células esplénicas con 100 microlitros de cóctel de anticuerpos conjugados de bioción de un kit de aislamiento de células CD8alpha+dendríticas durante 15 minutos en hielo con un suave golpeteo, como se acaba de demostrar.

Al final de la incubación, lave las células en 12 mililitros de tampón de clasificación de células de 4 grados Celsius y vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de tampón de clasificación de células fresco de 4 grados Celsius. A continuación, mezcle las células con 100 microlitros del kit de aislamiento de células dendríticas CD8alpha + perlas anti-biotina. Después de 15 minutos en hielo con golpecitos suaves, lave las celdas en 10 mililitros de tampón de clasificación de celdas de 4 grados Celsius y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de clasificación fresco de 4 grados Celsius.

Al final de la incubación, clasifique las células por separación magnética de perlas, como se acaba de demostrar, recogiendo el flujo y el primer lavado. Luego, gire las celdas y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de clasificación de celdas fresco de 4 grados Celsius. Ahora etiquete las células con 200 microlitros de perlas magnéticas conjugadas anti-CD8aplha del kit y pase las células a través de una nueva columna, recogiendo el flujo de células CD8alfa-dendríticas.

Para recolectar los CD8alpha + DC, transfiera la columna a un tubo cónico de 15 mililitros y sumerja 5 mililitros de tampón de clasificación de células frescas de 4 grados Celsius a través de la columna. Después de pasar las células por una segunda columna, se puede esperar una población de células dendríticas CD8alfa + superior al 96%. Para aislar las células CD8alfa, haga girar la suspensión de células de flujo CD8alfa.

A continuación, etiquete las células con 100 microlitros de perlas c-magnéticas anti-CD11 y recoja la población de células positivas para perlas magnéticas, como se acaba de demostrar, para obtener una población de subconjuntos de células CD8alfa-dendríticas superior al 97%. Por último, determine el número de células vivas, por exclusión de azul de tripano. Una vez que el tumor se vuelve palpable, los ratones portadores de tumores con ligando B16 flt-3 exhiben consistentemente un aumento dramático en la celularidad esplénica que se correlaciona con la expansión de los subconjuntos de células dendríticas esplénicas.

Curiosamente, mientras que se observa un aumento de 15 a 20 veces en el número absoluto de células para las CD convencionales en estos animales, solo se observa un aumento de 4 veces para el subconjunto de DC del cítodo plasmático. Los diferentes subconjuntos de células dendríticas se caracterizan según su expresión de B220, CD11b, CD11c y CD8alpha. Sin embargo, las poblaciones celulares también exhiben otros marcadores de subconjuntos únicos, con mPDCA1 expresado exclusivamente en los CD del cítodo plasmático DEC205 altamente expresado en los CD8alpa + DC, y CD11b y 33D1 detectados de manera más prominente en los CD8alpha-DC.

Utilizando este método, hemos demostrado que CD8alpa+DC es el más eficiente en la presentación de antígenos por moléculas de unión CD a una población especializada de células T conocidas como células NKT invariantes. La característica más crítica del aislamiento de DC es mantener una esterilidad estricta y condiciones libres de antidoxantes. Durante los procedimientos, estas células T responden muy bien a los antidoxantes.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las células con cuidado, ya que la estimulación mecánica repetida puede alterar el estado de maduración de las células dendríticas. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para aislar un gran número de todos los principales subconjuntos de DC de un solo bazo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.