Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón
JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 2:57 min • April 30th, 2023
- Las células dendríticas o CD son células presentadoras de antígenos clave que activan las células T. En los pacientes leucémicos, estas células expresan mal el antígeno asociado al tumor y no logran provocar una respuesta inmunitaria específica del antígeno. Las células dendríticas son abundantes en la médula ósea. Y por lo tanto, la médula ósea es el sitio preferido para su aislamiento para ayudar a estudiar su papel en el cáncer.
Para obtener células dendríticas, extraiga la médula ósea del fémur o la tibia de un ratón sacrificado mediante el uso de una jeringa llena de medios para enjuagarla. Centrifugar y resuspender el pellet en tampón de cloruro-potasio o ACK para lisar eritrocitos. Ahora agregue medios de cultivo para detener la lisis y centrifugar. Vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo que contiene un antibiótico. Agregue el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos o GM-CSF, y transfiera la suspensión celular a una placa de Petri.
Incube la placa durante el tiempo deseado. El GM-CSF ayuda a las células progenitoras a diferenciarse en células dendríticas. Finalmente, activa las células con lipopolisacáridos o LPS, que se unen al receptor de superficie de las células dendríticas, lo que da como resultado células dendríticas de médula ósea completamente maduras e inmunogénicas. En este protocolo, demostraremos la generación de células dendríticas a partir de la médula ósea del ratón.
- Para generar células dendríticas derivadas de la médula ósea, se aísle la médula ósea de los fémures de ratones knockout de tipo salvaje o Factor B, como se ha demostrado, y lise los glóbulos rojos en 5 mililitros de tampón de lisis ACK, deteniendo la reacción con 10 mililitros de RPMI, suplementado con FBS al 1% después de cinco minutos.
Después de recolectar las células sanguíneas enteras por centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo a una concentración de 2 veces 10 a 6 células por mililitro y agregue 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a las células, antes de sembrar 10 mililitros de células en placas de Petri individuales de 100 por 15 milímetros a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante seis días. En el sexto día, active los cultivos de células dendríticas derivadas de la médula ósea con 25 microgramos por mililitro de LPS por placa.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón, las cuales son fundamentales para la activación de linfocitos T en la investigación del cáncer. El método implica el aislamiento de la médula ósea, la lisis de los glóbulos rojos y el cultivo de las células con factores de crecimiento específicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología del cáncer
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígenos esenciales.
- En pacientes con leucemia, las DC presentan una baja expresión de antígenos asociados a tumores.
- La médula ósea es una fuente rica para el aislamiento de células dendríticas.
- Comprender el papel de las células dendríticas en el cáncer puede ayudar en el desarrollo de inmunoterapias.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de células dendríticas a partir de médula ósea de ratón.
- Profundizar en la comprensión de las células dendríticas en el contexto del cáncer.
- Facilitar la investigación sobre las respuestas inmunitarias en pacientes con leucemia.
Métodos Utilizados
- Extracción de médula ósea de fémures o tibias de ratón.
- Lisis de eritrocitos utilizando tampón ACK.
- Centrifugación y resuspensión en medio de cultivo con antibióticos.
- Cultivo con GM-CSF y activación con LPS.
Resultados principales
- Aislamiento y cultivo exitosos de células dendríticas derivadas de médula ósea.
- Las células dendríticas maduraron y se volvieron inmunogénicas tras la activación con LPS.
- El protocolo demostró una diferenciación efectiva de células progenitoras en células dendríticas.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón.
- Estas células pueden utilizarse para estudiar las respuestas inmunitarias en el cáncer.
- Investigaciones futuras pueden explorar el potencial terapéutico de las CD en inmunoterapia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La generación de células dendríticas a partir de médula ósea de ratón proporciona un modelo fundamental para estudiar la presentación de antígenos y la activación de linfocitos T en la investigación de inmunoterapia contra el cáncer. Este método permite reducir los riesgos mecanicistas de estrategias terapéuticas basadas en células dendríticas al establecer sistemas reproducibles y relevantes para la enfermedad, útiles para la validación de dianas y el cribado funcional. El protocolo apoya los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al producir células dendríticas inmunogénicas que pueden utilizarse para investigar mecanismos de evasión inmunitaria y evaluar compuestos inmunomoduladores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las células dendríticas en la presentación de antígenos y la activación de linfocitos T para la validación de dianas en inmuno-oncología.
- Valor operativo: Proporciona un sistema estandarizado para evaluar cómo las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la maduración e inmunogenicidad de las células dendríticas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera células dendríticas capaces de maduración inducida por LPS, lo que permite el desarrollo de ensayos para la selección de compuestos que modulan la activación de células dendríticas o la secreción de citoquinas.
- Valor operativo: Produce salidas celulares consistentes adecuadas para imágenes de alto contenido o lecturas basadas en citometría de flujo en cascadas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización preclínica de la disfunción de las células dendríticas en contextos leucémicos, ayudando a comprender los mecanismos de evasión inmunitaria.
- Valor operativo: Facilita la producción de células dendríticas para ensayos de co-cultivo con linfocitos T o modelos tumorales, con el fin de evaluar candidatos inmunoterapéuticos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando células dendríticas como un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar mecanismos inmunomoduladores antes del avance preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la activación de linfocitos T dependiente de células dendríticas y la modulación de vías en la evasión inmune del cáncer.
- Selección: Permite la preparación de cultivos estandarizados de células dendríticas para la evaluación cuantitativa de los efectos de compuestos sobre marcadores de maduración o presentación de antígenos.
- Análisis: Genera resultados medibles, como la expresión de CD80/CD86 o perfiles de citoquinas, que aportan información sobre las relaciones estructura-actividad en la selección de inmunomoduladores.
- Investigación Traducional: Proporciona un sistema murino para modelar defectos en células dendríticas observados en leucemia humana, apoyando la alineación de biomarcadores traducionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reproducible para la generación de células dendríticas que puede compartirse entre equipos de inmunología y oncología para la validación iterativa de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en terapias dirigidas a células dendríticas al reducir la ambigüedad mecanicista en ensayos de presentación de antígenos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de diferenciación y activación inducidos por citoquinas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de inmunoterapias al permitir la evaluación temprana de la activación inmune mediada por células dendríticas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos inmunomoduladores basándose en lecturas funcionales de células dendríticas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de médula ósea murina y en técnicas de cultivo celular asépticas.
- Depende del acceso a reactivos de GM-CSF y LPS, así como a incubadoras de CO2 para condiciones de cultivo precisas.
- Necesita la estandarización de la densidad de siembra celular y del momento de activación entre laboratorios para obtener un rendimiento y madurez consistentes de células dendríticas.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar hallazgos de sistemas de células dendríticas murinas a humanas debido a la expresión de receptores específicos de especie.
- Se encuentra limitado por el estado de diferenciación terminal de las células dendríticas activadas con LPS, lo que restringe el cultivo prolongado o la criopreservación para estudios longitudinales.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico
Videos relacionados
0 Vistas
Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor
Videos relacionados
0 Vistas
Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia
Videos relacionados
0 Vistas
Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea
Videos relacionados
0 Vistas
Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes
Videos relacionados
0 Vistas
Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes
Videos relacionados
0 Vistas
En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6
Videos relacionados
0 Vistas
Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones
Videos relacionados
0 Vistas
Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera
Videos relacionados
0 Vistas
Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino
Videos relacionados
0 Vistas
Última actualización: 22 agosto 2026