Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways

El objetivo general del Ensayo de Complementación Funcional es dilucidar la actividad de una enzima mediante la introducción de una copia funcional del gen correspondiente en una célula mutante para ver si restaura un fenotipo de tipo salvaje en el fondo mutante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en una variedad de campos, como la bioquímica, la microbiología, la genética, la biología vegetal, la evolución y otros. La principal ventaja de esta técnica es que evalúa la función, actividad y/o papel de una enzima, en condiciones in vivo, que normalmente son de naturaleza fisiológica, a diferencia de las condiciones in vitro, que normalmente son de naturaleza artificial.

Las implicaciones de esta técnica, se extienden hacia la identificación y/o elucidación de la función de enzimas no caracterizadas, y aquellas que aún tienen funciones putativas o predichas. Quien demuestra este procedimiento de complementación funcional es Taylor Harkness, estudiante de biotecnología y biociencias moleculares en mi laboratorio. Después de la clonación de los genes DapL, TarB, MurE y RSH de acuerdo con el protocolo de texto, inocular 50 mililitros de medio líquido con una sola colonia de células bacterianas mutantes para ser transformadas con un gen de interés y crecer durante la noche.

En el segundo día, use el cultivo nocturno de 50 mililitros para inocular 1 litro del medio apropiado y crezca a 30 grados Celsius a la fase de bloqueo, o a un OD600 de 0.4 a 0.6. Recolectar las células por centrifugación a 5.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, decantar el sobrenadante y utilizar 500 mililitros de agua destilada estéril y helada para resuspender el pellet.

Vuelva a centrifugar las células y, después de decantar el sobrenadante, use 250 mililitros de glicerol estéril al 10% helado para resuspender el pellet. Después de girar las células por última vez, use dos mililitros de glicerol al 10% para resuspender las células. Transfiera 50 alícuotas de microlitros a tubos de microcentrífuga y congele inmediatamente colocando los tubos en un baño de etanol con hielo seco.

Almacene las celdas a menos 80 grados centígrados para la electroporación. Para llevar a cabo la electroporación, agregue 1 microlitro de plásmido recombinante a una alícuota de 50 microlitros de células competentes y colóquelo en hielo durante cinco minutos. Transfiera las celdas a una cubeta de electroporación y configure el aparato de electroporación en los siguientes ajustes: capacitancia de 25 grados Fahrenheit, 2,5 kilovoltios y resistencia de 200 ohmios.

Luego, con la cubeta en el dispositivo, administre un pulso. Agregue 1 mililitro de medio de recuperación a la cubeta y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Permita que las células se recuperen incubando el cultivo en una incubadora agitadora con rotación suave durante 60 minutos a la temperatura adecuada requerida por el mutante.

Para seleccionar los transformantes, pipetee 100 microlitros del cultivo en medio con placas de agar y use un esparcidor estéril para esparcir la solución. Luego, incube durante la noche a la temperatura adecuada. Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles.

Para realizar el análisis de complementación, transforme AOH1 con el vector vacío pBAD33 o con vectores de expresión dapL utilizando electroporación, como se acaba de demostrar. Coloque la mezcla de transformación en medio de agar LB, complementada con 50 microgramos por mililitro de Dap, 34 microgramos por mililitro de cloranfenicol y 50 microgramos por mililitro de kanamicina. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 24 horas antes de observar los resultados.

Con el vector vacío pBAD33 o con el vector que expresa murE, transforme el mutante TKL-11 mediante electroporación como se demostró anteriormente en este vídeo. Coloque los transformantes en agar LB, suplementado con 50 microgramos por mililitro de tiamina y 34 microgramos por mililitro de cloranfenicol, e incube las placas a 30 grados centígrados durante 24 horas antes de verificar si hay transformantes. Pruebe la complementación mediante el rayado o la siembra de colonias de las transformaciones de control y experimentales en dos placas de medio LB, más 0,2% de arabinosa y 50 microgramos por mililitro de tiamina.

Incubar una placa a 30 grados centígrados y la otra a 42 grados centígrados durante 24 horas antes de evaluar el fenotipo de crecimiento. Transforme la cepa mutante Hx699 y la cepa Rr217 de tipo salvaje de las especies de novoesfingobio con el vector vacío pRK290, o un vector que contenga el gen rshNsp nativo en dos eventos de transformación separados cada uno, como se demostró anteriormente en este vídeo. Coloque los transformantes en papa dextrosa o agar PD suplementado con 10 microgramos por mililitro de tetraciclina e incube durante al menos 72 horas, o hasta que aparezcan los transformantes.

A continuación, raye los transformantes en un patrón de X en placas de agar PD frescas con tetraciclina. Después de incubar a 30 grados centígrados durante al menos cuatro días, examine visualmente el fenotipo de crecimiento de ambas placas. El doble mutante AOH1 de E. coli alberga una mutación en el gen DapE y una deleción del gen DapD, y no crecerá a menos que se proporcione Dap.

Como se ve aquí, el mutante AOH1 que expresa DapLs es capaz de crecer en un medio libre de LLDap mediante la conversión de THDP en LLDap en la vía de lisis de Dap. La enzima MurE facilita la adición de m-DAP en el peptidoglicano de las bacterias gramnegativas. El mutante E. coli MurE, TKL-11, no puede crecer a 42 grados centígrados.

En este experimento, solo las células TKL-11 transformadas con MurE crecen a 42 grados centígrados. Una mutación en el gen TyrB impide la síntesis de tirosina y fenilalanina. Sin embargo, como se muestra aquí, cuando la cepa DL39 mutante TyrB expresa el gen A. thaliana At5g36160, crece en medio M9, sin tirosina y fenilalanina, lo que demuestra que la enzima puede sintetizar tirosina.

El mutante Hx699 en las especies de novosphingobium alberga una proteína RSH no funcional y produce un fenotipo hipomucoidal. Sin embargo, la transformación con el gen nativo RSH produce polisacáridos extracelulares más solubles en la raya X multicelular que es hipermucoidal. Por el contrario, cuando el mutante Hx699 se transforma con un vector vacío, produce un fenotipo hipomucoidal.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 24 a 48 horas. Si se realiza correctamente, en función del crecimiento del organismo modelo utilizado, excluida la clonación, la competencia de las etapas de preparación y transformación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los requisitos de las condiciones de crecimiento de los mutantes utilizados en el análisis de complementación funcional.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las caracterizaciones axiomáticas in vitro tradicionales, para responder a preguntas adicionales como la especificidad del sustrato, la temperatura y los óptimos de pH, las tasas de velocidad somática, etc. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología y muchos campos de subdivisión, como la microbiología, diluciden la función, o papel, in vivo de las enzimas de una variedad de organismos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer células bacterianas electrocompetentes, cómo transformar bacterias usando electroporación y cómo evaluar la función de los genes/enzimas usando la complementación funcional.

No olvide que trabajar con organismos patógenos puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar las precauciones necesarias.