Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

El objetivo general de este método es purificar las células endodérmicas generadas a partir de células madre embrionarias humanas o células madre embrionarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre la diferenciación endodérmica. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener una población pura de células endodérmicas después de la eliminación de células indiferenciadas.

Antes de comenzar el procedimiento, cubra seis placas de cultivo celular de pocillos con un mililitro de matriz de membrana basal por pocillo. Durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, para recolectar las células madre embrionarias humanas, aspire el medio de un cultivo de células madre embrionarias humanas confluentes en un 80 a 90% con una pipeta de pasto de vidrio estéril.

Y lavar las células con dos mililitros de PBS por pocillo. Agitar la placa y aspirar la solución salina para eliminar las células muertas y los desechos. A continuación, disocie suavemente los grupos de células con un mililitro de reactivo de solución de paso sin enzimas, a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que las células muestren signos claros de disrupción en grupos más pequeños.

Después de unos siete minutos, agregue un mililitro de medio DMMF12 a los pocillos. Y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta de un mililitro para separar los agregados celulares restantes en una suspensión de una sola célula. Con la misma pipeta, transfiera las células a un tubo de centrifugación y enjuague los pocillos con un mililitro de medio DMMF12 fresco, agrupando los lavados en el tubo.

Después de girar las células, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de cultivo de células ES suplementado con un inhibidor de ROCK. Cuente las células y la semilla 1,5:4 veces 10 a la quinta célula por pocillo en las placas recubiertas de la matriz de la membrana basal en medio de cultivo suplementado con inhibidor de ROCK para prevenir la apoptosis. Incubar las células durante aproximadamente 24 horas.

Y luego use una pipeta Pasteur de vidrio estéril para reemplazar el medio en cada pocillo con 2 mililitros de medio de inducción de rayas primitivas. Después de 24 horas más de cultivo, reemplace el medio con medio de inducción endodermo para una incubación de 48 horas con cambios diarios de medio. El último día de cultivo y al menos una hora antes de recolectar las células, agregue un inhibidor de ROCK fresco al medio de cultivo.

A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio estéril para aspirar el medio de cada uno de los pocillos y disociar las células con un reactivo de solución de paso sin enzimas, como se acaba de demostrar. Cuando se haya logrado una suspensión de una sola célula, cuente las células y centrifuérrelas. Asegúrese de que, a partir de este momento, todos los medios y tampones contengan el inhibidor ROCK para evitar que las células mueran.

De lo contrario, no se colocarán correctamente después de retroceder. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón PEB, suplementado con inhibidor de ROCK por 1 veces 10 a la séptima celda. A continuación, añada el anticuerpo CXCR4 APC a las células.

Agite suavemente el tubo para mezclar. Después de 15 minutos a 4 grados centígrados, lave las células con uno o dos mililitros de tampón PEB y utilice una pipeta Pasteur de vidrio estéril para aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón PEB por 1 veces 10 a la séptima celda y agregue 20 microlitros de microperlas anti-APC a las celdas.

Mezcle la muestra con un suave golpeteo. A continuación, incubar las células a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Al final de la incubación, lavar las células con uno o dos mililitros de tampón PEB suplementado con inhibidor de ROCK.

Y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón PEB fresco más inhibidor. Para aislar las celdas CXCR4+ mediante la separación magnética de cordones, cargue una columna magnética de tamaño mediano en un imán de tamaño adecuado y enjuague previamente la columna con 500 microlitros de tampón PEB más inhibidor ROCK. Cuando todo el lavado se haya drenado de la parte superior de la columna, aplique todo el volumen de celda marcado con perlas magnéticas a la columna, recogiendo el flujo en un tubo cónico.

Lavar la columna con tres aplicaciones de 500 microlitros de tampón PEB más inhibidor de ROCK. A continuación, transfiera la columna del imán a un tubo de recogida adecuado. Y sumerja un mililitro de tampón PEB más inhibidor de ROCK a través de la columna para recoger las células CXCR4+.

Opcionalmente, todas las muestras de flujo se pueden recoger por separado y se pueden utilizar alícuotas de 20 microlitros de cada muestra para determinar el porcentaje de células CXCR4+ en cada alouette mediante citometría de flujo. Este procedimiento se puede repetir con el primer flujo para recoger las celdas que no se unieron a la columna. A continuación, agrupe ambas muestras CXCR4+ y centrifuérrelas.

Finalmente, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de inducción del endodermo suplementado con el inhibidor de ROCK y siembre las células a la densidad adecuada en un recipiente de cultivo celular recubierto de matriz de membrana basal. Antes de su diferenciación, las células madre embrionarias humanas expresan altos niveles del marcador de pluripotencia SOX2. Mientras que el marcador definitivo del endodermo, FOXA2, no se detecta.

Tras la diferenciación, las células madre embrionarias experimentan cambios drásticos en su expresión génica y proteica. De hecho, después de cuatro días en medio de diferenciación, SOX17 y FOXA2 se coexpresan uniformemente dentro de los núcleos de muchas de las antiguas células ES, un sello distintivo del compromiso definitivo del endodermo. Algunas células se resisten al proceso de diferenciación, no expresando ninguna de las dos proteínas marcadoras.

Y, de hecho, conservan su marcador de pluripotencia SOX2 expresión. En este experimento representativo, en el tercer día de diferenciación, casi el 60% de las células madre embrionarias recolectadas expresaron CXCR4, cuya pureza se enriqueció a más del 85% después de la clasificación magnética de las células pluripotentes y otras células de linaje no deseadas. Después de sembrar las células CXCR4+ purificadas, solo se detectan unas pocas células SOX2+, y la mayoría de las células sembradas expresan FOXA2.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas, si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros procedimientos como la histoquímica inmunitaria o la QPCR para responder preguntas adicionales sobre el proceso de diferenciación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar las células del endodermo mediante la clasificación magnética de perlas.