Name: Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a purificar células del endodermo diferenciadas a partir de células madre embrionarias humanas mediante separación con microesferas magnéticas. Este método elimina células no diferenciadas para obtener poblaciones puras.

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La habilidad de asistencia técnica de Jasmin Kresse se agradece.

1. La diferenciación de ESC humana hacia el endodermo definitivo <ol><li> Cultivar células madre embrionarias humanas (CES) en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Escudo una nueva placa de cultivo celular de 6 pocillos con 1 ml de una matriz de membrana basal e incubar la cultura-ware durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Para obtener detalles específicos, por favor dirigirse a las instrucciones del fabricante respectivo. </li><li> Confirman que las CME humanas cultivadas han alcanzado el 80% -90% de confluencia en el microscopio utilizando una magnificación baja (por ejemplo, 4X). Aspirar el medio de las cavidades chupando el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril. Lavar las células una vez con solución salina (PBS) tamponada con fosfato. Para ello, agregar 2 ml de PBS a cada pocillo suavemente sacudir la placa y chupar la solución para eliminar las células muertas y restos celulares. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de solución pases libre de enzimas para la disociación suave de grupos de células. Se incuban las células a 37 ° C unad CO2 al 5% hasta que las células muestran claros signos de perturbación en pequeños racimos. NOTA: El tiempo de incubación depende del reactivo utilizado. Para la solución pases libre de enzima se menciona en la sección de materiales, el tiempo de incubación es de aproximadamente 7 min. </li><li> Añadir 1 ml de medio DMEM / F-12 e interrumpir los agregados de células restantes en células individuales mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta de pipeta de 1 ml. Utilice esta para eliminar las células de la superficie y transferir las células a un tubo de centrifugación. Para recuperar todas las células, lavar cada pocillo con 1 ml de medio DMEM / F-12 y añadir el medio al tubo de centrifugación. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo de células ES que contienen Rho-quinasa inhibidor 10 mM (ROCK). </li><li> Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro y sembrar 150.000 - 400.000 células por 6 pocillos o en otra disposición de la placa, dependiendo de la línea de células ES utilizado. uso cultura medio que contiene inhibidor de Rock 10 mM para evitar la apoptosis y cultivar las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Aproximadamente 24 horas después de la siembra aspirado el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y añadir 2 ml de medio de inducción línea primitiva. NOTA: Este medio contiene concentraciones finales de 1% de glutamina, 0,2% de FCS, 5 mM CHIR-99021 y 50 ng / ml de activina A en Avanzada medio RPMI-1640. Comúnmente, utilizar 2 ml de medio para el cultivo en placas de 6 pocillos. </li><li> 48 horas después de la siembra, vuelva a colocar el medio de endodermo medio de inducción. Cultivar las células en este medio durante otras 48 horas con cambio de medio día. NOTA: Este medio contiene 1% de glutamina, 0,2% de FCS y 50 ng / ml de activina A en Avanzada medio RPMI-1640. Las células que se han comprometido hacia el endodermo definitivo expresan el marcador de superficie CXCR4. La tinción de CXCR4 se puede usar para cuantificar el número de células comprometidas-DE. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. La tinción de células CXCR4 + endodermo definitivo para el análisis de citometría de flujo <ol><li> Para el final de 24 hr, pero al menos 1 hora antes de recoger las células añaden inhibidor Rock 10 mM al medio de cultivo. </li><li> Escudo del cultivo de células-ware que será utilizado para la re-siembra con una matriz de membrana basal, es decir, placas de 12 pocillos para análisis qPCR o cámara de diapositivas para la tinción de inmunofluorescencia. Incubar las placas o los portaobjetos durante al menos 30 min a TA. </li><li> Aspirar el medio con una pipeta Pasteur de vidrio estéril de los pocillos de las células diferenciadas usadas para la coloración y / o de clasificación. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de solución pases libre de enzimas para la disociación suave de grupos de células. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 hasta que las células muestran claros signos de perturbación en pequeños racimos. NOTA: El tiempo de incubación depende del reactivo utilizado. Para la solución pases libre de enzimas mencionado en la materisección del als, tiempo de incubación es de aproximadamente 7 min. </li><li> Añadir 1 ml de medio DMEM / F-12 e interrumpir restante agregados de células en células individuales mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo usando una punta de 1 ml. Utilice esta para eliminar las células de la superficie y transferir las células a un tubo de centrifugación. Para recuperar todas las células, lavar cada pocillo con 1 ml de DMEM / F-12 medio w / o FCS y añadir el medio al tubo de centrifugación. </li><li> Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Las células de tres pocillos de una placa de 6 pocillos deben dar lugar a 10-15 x 10 6 células después de tres días de diferenciación. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. NOTA: El número exacto de células obtenidas dependerá de la línea de células pluripotentes utilizado para la diferenciación. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tampón PEB que contiene inhibidor de Rock 10 mM. Utilice 100 l de este tampón durante hasta 10 7 células. Añadir el inhibidor Rock 10 M en el día de staining. Usar este tampón para todas las aplicaciones aguas abajo (que se refiere como tampón PEB + RI). NOTA: tampón PEB contiene BSA al 0,5% y EDTA 2 mM en PBS. Si más células deben ser de colores, ajustar el volumen de compensación en consecuencia. </li><li> Añadir 10 l de un anticuerpo CXCR4-APC por 10 7 células en 100 l, esto representa más o menos una dilución de 1:10. NOTA: El uso de un anticuerpo ligado a APC no es obligatorio. En su lugar, puede ser sustituido en función de las microperlas utilizados. Si más células han de ser manchada ajustar el volumen del anticuerpo en consecuencia. </li><li> Mezclar por voltear suavemente el tubo con los dedos y se incuba a 4 ° C en un refrigerador durante 15 min. Resuspender las células con 1-2 ml de tampón PEB. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y resuspender el sedimento celular en 80 l PEB por 10 7 células y añadir 20 l microperlas anti-APC. NOTA: </strong&gt; Si más células deben ser de colores, ajustar el volumen de microperlas en consecuencia. </li><li> Mezclar por voltear suavemente el tubo con los dedos y se incuba a 4 ° C en un refrigerador durante 15 min. Resuspender las células con 1-2 ml de tampón PEB + RI. Centrifugar las células durante 5 min a 300 x g. Aspirar el buffer. Volver a suspender en 500 l de tampón PEB + RI. </li></ol> 3. Separación Magnética de CXCR4 + células <ol><li> Colocar una columna magnética de tamaño medio en un campo magnético como por las instrucciones del fabricante. Pre-enjuagar la columna con tampón PEB 500 l + RI. Aplicar toda la suspensión de células a la columna. Recoger el flujo a través de las células ya que no todos se unirá a la columna. Asegúrese de no molestar a las columnas para la recuperación óptima de células CXCR4 +. </li><li> Lavar la columna tres veces con 500 l de tampón PEB + RI. Recoger el primer flujo a través y combinarlo con las células recogidas del Paso 3.1. Retire la columna magnética del campo magnético y colocarlo en unatubo de recogida adecuado. Añadir tampón PEB 1 ml + RI en la columna. Para eluir las células que presiona hacia abajo el émbolo en la columna. </li><li> Opcional: Recoger todo el flujo a través de muestras por separado y el uso de 20 l cada uno para analizar el número de células CXCR4 + mediante citometría de flujo. Su número debería disminuir con cada etapa de lavado. NOTA: Al menos 2 x 10 4 viables, células cerradas deben contarse para obtener resultados fiables. </li><li> Repita los pasos 3.1-3.3 con el flujo de recogida a través de la muestra a partir del paso 3.1 y la primera muestra de flujo a través del paso 3.2 utilizando una nueva columna. No vuelva a utilizar la columna anterior. Al utilizar el aire del émbolo se presiona en la columna, que lo bloquea. </li><li> Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Dependiendo de la eficiencia de la diferenciación hasta 6 x 10 6 células se pueden clasificar inicialmente y otro 1 x 10 6 células mediante el uso de una segunda columna utilizando 10 7 células para el procedimiento. </li&gt; <li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y resuspender las células en medio de inducción de endodermo 1 ml de la Etapa 1.9 con inhibidor adicional Rock 10 mM. </li><li> Contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. Sembrar las células a una densidad apropiada, es decir, ~ 4 x 10 5 células por pocillo de una placa de 12 pocillos (aprox. 3,6 cm2 de superficie) o ~ 1,5 x 10 5 células por pocillo de 8 plantas, así cámara de diapositivas. </li></ol> 4. Opcional: Análisis de la Población purificada endodermo definitivo <ol><li> Para la tinción de inmunofluorescencia fijar las células purificada de la etapa 3.7 más o menos 24 horas después de la siembra con 4% de paraformaldehído y manchas para endodermo definitivo (DE) y / o proteínas marcadoras pluripotencia. NOTA: se suele utilizar DE marcadores incluyen FOXA2 y SOX17, marcadores de pluripotencia de uso general incluyen OCT3 / 4, Sox2 y NANOG 6, 8. </li><li> for análisis RT-qPCR, cosechar las células purificadas directa o 24 horas después de la siembra, extracto total-ARN y la transcripción reversa cDNA a partir de las muestras de ARN total extraído. Utilice 10 ng de cDNA como plantilla por reacción de RT-qPCR (por triplicado) para analizar la expresión de genes marcadores de DE y pluripotencia 6, 8. NOTA: Los genes marcadores usados ​​comúnmente se mencionan en el paso 4.1. Las condiciones del ciclo son 5 min a 95 ° C y 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C, seguido por la fusión de análisis de la curva. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

protocolos de diferenciación Actualmente se utilizan rara vez resultan en células diferenciadas 100%. Por razones que aún no se han abordado algunas células resisten el proceso de diferenciación. Dependiendo de la eficiencia del protocolo de diferenciación usado y de la propensión de la ESC línea A cierto número de células pluripotentes residuales se observa con frecuencia, incluso después de la diferenciación en el endodermo definitivo. Estas células residuales pueden poner en peligro diferenciaciones aguas abajo o un ...

Las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) tienen la capacidad de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo humano. Por lo tanto, los protocolos de diferenciación in vitro se pueden utilizar para generar numerosos tipos de células de adultos, tales como cardiomiocitos, hepatocitos 1 2, las células beta 3, epitelial de pulmón 4 o células neuronales 5. Esto hace que los CES una herramienta valiosa para el tratamiento potencial de diversas enfermedades degenerativas 3. La diferenciación in vitro de los CES hacia tejidos adultos del pulmón, hígado y páncreas requiere un pseudo-gastrulación en células que recuerdan el endodermo definitivo (DE) 6. Puesto que la diferenciación de aguas abajo hacia los tipos de células somáticas antes mencionados es significativamente menos eficiente, una diferenciación endodermo óptima se considera como limitante de la velocidad 7. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo se someten chacaracterísti- cambios en su perfil de expresión génica. Regulador de los genes maestros pluripotencia están regulados hacia abajo, mientras que la expresión de otros factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA y el receptor de la superficie CXCR4 está altamente regulada positivamente 6, 8, 9. CXCR4 es conocido por estar transactivated por SMAD2 / 3, aguas abajo de la señalización nodal / TGF-β y SOX17 debido a los sitios de unión específicos en su región promotora 10. Por lo tanto es un marcador muy adecuado usado en una serie de informes 6, 8, 11-13. Estos cambios en la expresión refleja un evento pseudo-gastrulación, en el que los CES primera adquieren características de una población de células racha similar primitiva y, posteriormente, se comprometen en la capa de germen de endodermo 6. Sin embargo, los protocolos de diferenciación rara vez son 100% de eficiencia como algunas células pueden resistir el proceso de diferenciación o diferenciar hacia otros linajes no deseados 14. Estas células pueden INFLUE negativamentena vez mayor diferenciación. Además, las células indiferenciadas residuales albergan grandes riesgos para posteriores experimentos de trasplante y pueden dar lugar a teratomas 15-17. Para eliminar estas células no deseadas se pueden utilizar para la purificación de las células que se han comprometido hacia la DE 18 temprano en el CXCR4 marcador de superficie. A continuación, describimos un método para la selección positiva de células CXCR4 + a partir de cultivos de diferenciación DE. Para ello, el CXCR4 marcador de superficie se une por un anticuerpo que luego a su vez se une a las microperlas magnéticas. A diferencia de las duras condiciones durante FACS clasificación, las células marcadas magnéticamente DE-como pueden ser fácilmente purificados en un formato de sobremesa usando un método de purificación suave. Este protocolo proporciona un método sencillo para la eliminación de poblaciones de células que resistió el proceso de diferenciación DE.

<table><tbody><tr><td>Línea de células madre embrionarias humanas Hues8</td><td>Departamento de células madre y biología regenerativa de Harvard Línea</td><td>celular adecuada para la generación de endodermos</td>Línea de células madre embrionarias humanas Hes3 ES Cell International Línea celular adecuada y robusta para la generación de endodermos mTeSR1 Stemcell Technologies 5850 ESC medio de cultivo FCS Biowest <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separador OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>campo magnético</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>inhibidor</td></tr><tr><td>de rocas CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular suave</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Sin enzimas solución de paso, alternativa: Tripsina/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matriz de membrana basal * resuelva y almacene en alícuotas a -80 &deg; C como se describe en el manual del proveedor. Tras su uso, descongelar en hielo, diluir en 25 ml de knockout helado DMEM/F-12. Añadir 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar durante 45 min a temperatura ambiente. Retirar la matrigel y utilizar inmediatamente. </td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separador MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Humano FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Humano FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtgtggtt</td><td>Vida Tecnologías</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humano GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan ensayo</td><td>Biosystems Aplicado</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>humano SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humano SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 FW cttgctgcaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 REV ctgcagtgggtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW ccgagggcagacatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Sistemas</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Las capacidades de diferenciación de las células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias (CES) permiten que una aplicación terapéutica potencial para las terapias de reemplazo celular. Terminal tipos de células diferenciadas se podrían utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas. Diferenciación in vitro de estas células hacia los tejidos del pulmón, hígado y páncreas requiere como primera etapa de la generación de células endodérmicas definitivas. Este paso es limitante de la velocidad para su posterior diferenciación hacia tipos de células maduras terminal tales como las células beta productoras de insulina, hepatocitos u otros tipos celulares derivados del endodermo. Las células que se han comprometido hacia el linaje endodermo altamente expresan una multitud de factores de transcripción como FOXA2, SOX17, HNF1B, los miembros de la familia GATA, y el receptor CXCR4 superficie. Sin embargo, rara vez son protocolos de diferenciación 100% de eficiencia. A continuación, describimos un método para la purificación de una población de células CXCR4 + después de la diferenciaciónen la DE mediante el uso de microperlas magnéticas. Esta purificación elimina, además, las células de los linajes no deseados. El método de purificación suave es rápido y fiable, y puede ser utilizado para mejorar las aplicaciones posteriores y diferenciaciones.

la diferenciación CES se someten a cambios drásticos en la expresión de genes y proteínas. La Figura 1 representa los genes marcadores típicos que se pueden utilizar para verificar el éxito de la diferenciación del endodermo. Los principales objetivos de un análisis de la expresión génica son GSC, FOXA2, y SOX17. En un análisis de la expresión génica relativa en especial FOXA2 y SOX17 se incrementan en&gt; 2...

A continuación, se describe un método para la purificación de células madre embrionarias humanas diferenciadas que están comprometidas hacia el endodermo definitivo para la mejora de las aplicaciones posteriores y otras diferenciaciones.

Un método rápido y eficiente para la purificación de células del endodermo generada a partir de células madre embrionarias humanas

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

El objetivo general de este método es purificar células endodérmicas generadas a partir de células madre embrionarias humanas o células ES. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre la diferenciación endodérmica. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener una población pura de células endodérmicas tras la eliminación de las células indiferenciadas.Antes de comenzar el procedimiento, recubra placas de cultivo celular de seis pocillos con un mililitro de matriz de membrana basal por pocillo. Incube durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, para cosechar las células ES humanas, aspire el medio de un cultivo de células madre embrionarias humanas con una confluencia del 80 al 90 % utilizando una pipeta de Pasteur estéril de vidrio.Y lave las células con dos mililitros de PBS por pocillo. Agite la placa y aspire la solución salina para eliminar las células muertas y los restos celulares. A continuación, disocie suavemente los agregados celulares con un mililitro de reactivo de solución de paso sin enzimas, a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, hasta que las células muestren signos evidentes de desintegración en agregados más pequeños.Después de aproximadamente siete minutos, agregue un mililitro de medio DMMF12 a los pocillos. Y aspire y expulse varias veces con una punta de pipeta de un mililitro para disociar los agregados celulares restantes en una suspensión de células individuales. Utilizando la misma pipeta, transfiera las células a un tubo de centrifugación y enjuague los pocillos con un mililitro de medio DMMF12 fresco, recogiendo los lavados en el tubo.Después de centrifugar las células, re-suspender el sedimento en cinco mililitros de medio de cultivo para células ES suplementado con inhibidor de ROCK. Contar las células y sembrar 1,5:4 veces 10 a la quinta células por pocillo en placas recubiertas con matriz de membrana basal, utilizando medio de cultivo suplementado con inhibidor de ROCK para prevenir la apoptosis. Incubar las células durante aproximadamente 24 horas.Luego, utilice una pipeta Pasteur estéril de vidrio para reemplazar el medio en cada pocillo con 2 mililitros de medio de inducción de la línea primitiva. Después de 24 horas adicionales de cultivo, sustituya el medio por medio de inducción de endodermo para una incubación de 48 horas con cambios diarios del medio. En el último día de cultivo y al menos una hora antes de recolectar las células, agregue inhibidor de ROCK fresco al medio de cultivo.Luego, utilice una pipeta de Pasteur estéril de vidrio para aspirar el medio de cada uno de los pocillos y disociar las células con la solución enzimática para pase, tal como se acaba de demostrar. Una vez obtenida una suspensión de células individuales, cuente las células y céntrifugelas. Asegúrese de que, a partir de este momento, todos los medios y tampones contengan el inhibidor de ROCK para evitar que las células mueran.De lo contrario, no se adherirán adecuadamente tras el retroceso. Re-suspenda el precipitado en 100 microlitros de tampón PEB, suplementado con inhibidor de ROCK por cada 1 × 10⁷ células. Luego agregue el anticuerpo CXCR4 APC a las células.Golpee suavemente el tubo para mezclar. Después de 15 minutos a 4 grados Celsius, lave las células con uno a dos mililitros de tampón PEB y use una pipeta Pasteur de vidrio estéril para aspirar el sobrenadante. Re-suspenda el precipitado en 80 microlitros de tampón PEB por 1 × 10⁷ células y agregue 20 microlitros de microperlas anti-APC a las células.Mezcle la muestra con golpecitos suaves. A continuación, incube las células a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Al final de la incubación, lave las células con uno a dos mililitros de tampón PEB suplementado con inhibidor de ROCK.Y resuspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón PEB fresco más inhibidor. Para aislar las células CXCR4+ mediante separación con microperlas magnéticas, coloque una columna magnética de tamaño medio en un imán del tamaño adecuado y preenjuague la columna con 500 microlitros de tampón PEB más inhibidor de ROCK. Cuando todo el lavado haya drenado desde la parte superior de la columna, aplique todo el volumen de células marcadas con microperlas magnéticas sobre la columna, recolectando el flujo que pasa en un tubo cónico.Lave la columna con tres aplicaciones de 500 microlitros de tampón PEB más inhibidor de ROCK. A continuación, transfiera la columna desde el imán a un tubo de recolección adecuado. Y pase a través de la columna un mililitro de tampón PEB más inhibidor de ROCK para recolectar las células CXCR4+.Opcionalmente, se pueden recolectar por separado todas las muestras del flujo atravesante y se pueden usar alícuotas de 20 microlitros de cada muestra para determinar el porcentaje de células CXCR4+ en cada alícuota mediante citometría de flujo. Este procedimiento se puede repetir con el primer flujo atravesante para recolectar las células que no se unieron a la columna. Luego, reúna todas las muestras de CXCR4+ y centrifúgelas.Finalmente, re-suspenda el sedimento en un mililitro de medio de inducción de endodermo suplementado con inhibidor de ROCK y siembre las células a la densidad adecuada en un recipiente para cultivo celular recubierto con matriz de membrana basal. Antes de su diferenciación, las células ES humanas expresan altos niveles del marcador de pluripotencia SOX2. Por otro lado, el marcador de endodermo definitivo, FOXA2, no se detecta.Tras la diferenciación, las células ES experimentan cambios drásticos en su expresión génica y proteica. De hecho, después de cuatro días en medio de diferenciación, SOX17 y FOXA2 se expresan uniformemente de forma conjunta dentro de los núcleos de muchas de las células ES anteriores, un indicativo característico del compromiso con el endodermo definitivo. Algunas células resisten el proceso de diferenciación, no expresando ninguna de las dos proteínas marcadoras.Y de hecho, mantienen la expresión del marcador de pluripotencia SOX2. En este experimento representativo, al tercer día de diferenciación, casi el 60 % de las células ES recolectadas expresaban CXCR4, cuya pureza se enriqueció a más del 85 % tras la clasificación con microperlas magnéticas para eliminar las células pluripotentes y otras células de linajes no deseados. Después de sembrar las células CXCR4+ purificadas, solo se detectan unas pocas células SOX2+, mientras que la mayoría de las células sembradas expresan FOXA2.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de dos horas, si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas similares, como inmunohistoquímica o QPCR, para responder preguntas adicionales sobre el proceso de diferenciación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar células de endodermo mediante clasificación magnética con microesferas.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

Se describe el uso de los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 para la detección combinada de antígenos de la superficie celular a través de la fluorescencia activada por la clasificación celular (FACS) para la identificación y enriquecimiento de células madre embrionarias humanas vivas (hESC) utilizando la selección positiva y también el uso de la selección negativa para purgar hESCs de una población de células mixtas.

Enriquecimiento Y Purga De Células Madre Embrionarias Humanas Por La Detección De Antígenos De Superficie Celular Utilizando Los Anticuerpos Monoclonales TG30 Y GCTM-2

Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.

Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Aprende a purificar células del endodermo diferenciadas a partir de células madre embrionarias humanas mediante separación con microesferas magnéticas. Este método elimina células no diferenciadas para obtener poblaciones puras.

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