Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die Lokomotionskomponente des Verhaltens von Drosophila-Larven zu quantifizieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Verhaltensgenetik bezüglich genetischer und umweltbedingter Beiträge zu individuellen Unterschieden im Larvenverhalten zu beantworten. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Schnelligkeit, Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, große Stichprobenumfänge zu erfassen.

Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Erfolg des Assays von der Entwicklungszeit und der konsistenten, sorgfältigen Handhabung der Versuchstiere abhängt. Die Durchführung des Verfahrens demonstrieren Ina Anreiter und Oscar Vasquez, Doktorandinnen und Doktoranden in meinem Labor. Bereiten Sie die Halteflasche vor, indem Sie Löcher in eine Seite einer sechs Unzen fassenden, plastischen Fliegenkulturfalsche schneiden.

Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um die Deckel von Petrischalen mit dem zuvor hergestellten Traubensaftmedium zu füllen, bis die Oberfläche des Traubensaftmediums eine gewölbte Form über dem Rand des Deckels bildet. Lagern Sie die Traubenscheiben in einem feuchten und luftdichten Behälter bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen lang. Geben Sie 40 Milliliter des zuvor hergestellten Fliegenfutters in Petrischalen mit den Maßen 100 mal 15 Millimeter.

Beschaffen Sie drei schwarze Plexiglasplatten mit je zehn kreisförmigen Vertiefungen mit einem Durchmesser von zehn Zentimetern, die in einem zwei mal fünf-Design angeordnet sind, um die Larven zu testen, sowie einen schwarzen Plexiglas-Streicher, um die Hefepaste auf den Plexiglasplatten zu verteilen. Trennen Sie anschließend die Deckel von den Böden der Petrischalen. Sammeln Sie 100 bis 150 Weibchen und 50 bis 75 Männchen.

Lassen Sie Weibchen und Männchen über Nacht in einer sechs Unzen fassenden Fliegenkulturfalsche mit Standardfliegenfutter paaren. Überführen Sie die Fliegen in eine Aufbewahrungsfalsche und befestigen Sie mit Klebeband eine Weintraubentafel, auf der sich eine kleine Menge frischer Hefepaste befindet, an der Oberseite der Falsche. Stellen Sie die Falsche kopfüber, sodass sich die Weintraubentafel unten befindet, um den erwachsenen Fliegen das Ablegen der Eier auf der Weintraubentafel zu ermöglichen.

Entfernen Sie die erste Traubenplatte nach 24 Stunden und legen Sie eine neue Traubenplatte in die Halteflasche. Nach 22 Stunden nehmen Sie die Traubenplatten aus den Flaschen und legen sie in eine 60 mal 15 Millimeter große Petrischale. Danach legen Sie eine neue Traubenplatte mit frischem Hefepaste auf die Halteflasche.

Entfernen und verwerfen Sie alle Larven von der beimpften Traubenplatte mithilfe einer Präpariernadel. Inkubieren Sie die gereinigten Traubenplatten vier Stunden lang unter Standardbedingungen. Entnehmen Sie nach vier Stunden je Stamm 100 L1- oder Erstinstarlarven von den Traubenplatten und platzieren Sie sie auf den Nährböden.

Platzieren Sie die Larven vorsichtig auf dem Nährboden, ohne diesen zu durchbohren oder die Larven einzubetten. Jeweils Gruppen von zehn Larven können gleichzeitig aufgenommen und abgesetzt werden. Vermeiden Sie Überbelegung, indem Sie die Larven gleichmäßig über die Nährbodenplatte verteilen.

Die Nährböden inkubieren, bis die Testtiere zehn Stunden vor Beginn des Wanderverhaltens erreicht haben, bei dem die Larven die Nahrung verlassen, um einen Verpuppungsort zu suchen. Wenn die Larven bereits mit dem Wandern begonnen haben und sich, wie hier zu sehen, auf dem Deckel der Petrischale bewegen, sind die Tiere zu alt für den Test und ihre Entwicklungsdauer muss erneut bewertet werden. Hefe in Wasser im Verhältnis eins zu zwei auflösen.

Stellen Sie sicher, dass die fertige Paste tropft und Bänder auf der Oberfläche der Paste hinterlässt, die schnell verschwinden. Die Beurteilung der richtigen Konsistenz der Hefepaste ist wichtiger als die exakte Einhaltung des Verhältnisses, da Unterschiede zwischen Marken, Hefeproben und der Umgebung bestehen können. Mit einem Pinsel werden die Larven vorsichtig aus der Nahrungsplatte des ersten Stammes entnommen.

Sammeln Sie die Larven in einer Petrischale und spülen Sie sie vorsichtig mit Wasser ab, um die gesamte Nahrung zu entfernen. Spülen Sie die Larven anschließend schnell mit zwei Millilitern Wasser ab und tupfen Sie sie vorsichtig mit einem Laborabwischpapier trocken. Halten Sie die Larven in einer feuchten Umgebung, tauchen Sie sie jedoch nicht in Wasser ein, um Stress zu vermeiden.

Stellen Sie drei Testplatten nebeneinander auf und stellen Sie für jede Testplatte einen Timer auf fünf Minuten. Tragen Sie Hefepaste auf die Oberseite der Testplatten auf und verteilen Sie mithilfe des Spatels eine dünne Schicht Hefepaste auf jeder Testplatte, sodass alle Vertiefungen eine gleichmäßige Schicht Hefe aufweisen. Legen Sie vorsichtig jeweils eine Larve in die Mitte jeder Vertiefung.

Starten Sie den Fünf-Minuten-Timer unmittelbar, nachdem Sie die ersten Larven auf jede Platte gelegt haben. Danach platzieren Sie den Rest der Larven in den verbleibenden Vertiefungen. Legen Sie einen Petrischalen-Deckel auf jede Vertiefung.

Wenn der Timer abgelaufen ist, beginnen Sie damit, die im Hefe hinterlassenen Wegstrecken mit einem Permanentstift nachzuzeichnen, ohne die Larven von der Platte zu entfernen. Zeichnen Sie die Wegstrecken in der gleichen Reihenfolge und Geschwindigkeit nach, in der die Larven auf die Platten gebracht wurden. Wiederholen Sie schließlich die Schritte des Larven-Wegstreckentests für jeden Stamm.

Über drei aufeinanderfolgende Testtage gesammelte Daten zeigten einen signifikanten Stammeffekt, wobei Rover größere Distanzen zurücklegten als Sitter. Zusätzlich zu diesem Stammeffekt wiesen Larven, die vor dem Test vier Stunden lang nüchtern gehalten wurden, signifikant kürzere Wegstrecken auf als gefütterte Larven. Insgesamt waren die Wegstrecken länger, wenn beide Stämme auf nährstoffreicher statt auf nährstoffarmer Nahrung aufgezogen wurden.

Wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann eine einzelne Person innerhalb von vier Stunden problemlos bis zu 500 Larven testen, was es für die phänotypische Analyse im großen Maßstab wertvoll macht. Nach der hier gezeigten Vorgehensweise können weitere Variablen wie Geschlecht, Nahrungsentzug oder Nahrungsqualität untersucht werden, um deren Einfluss auf bewegungsbezogene Verhaltensmuster im Zusammenhang mit Nahrungsaufnahme zu zeigen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Nahrung bezogene Fortbewegung von Drosophila-Larven gemessen wird, um den Beitrag genetischer und umweltbedingter Faktoren auf individuelle Verhaltensunterschiede zu bewerten.