Name: El calcio de imágenes en Drosophila En la activación del huevo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a visualizar el calcio durante la activación del huevo en Drosophila melanogaster con este protocolo ex vivo. Esta técnica permite estudiar la dinámica del calcio y sus roles en la biología del desarrollo.

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Estamos muy agradecidos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya de asistencia durante la preparación de este manuscrito; Mariana Wolfner para los debates sobre la activación del huevo; Matt Wayland para el apoyo de imágenes; y Nan Hu para apoyo general en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Cambridge, ISSF a TTW [número de concesión 097814].

Nota: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Preparación para la disección Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton y Weil et al. al. 18. Realice los pasos siguientes dos días antes de la proyección de imagen. <ol><li> Tomar un vial mosca que contiene aproximadamente 10 ml de alimento sólido y añadir una pequeña cantidad de levadura seca a una esquina, a menos de 1 g es suficiente. Nota: Para obtener información acerca de los viales de moscas o comida ver &#39;Mantenimiento de Drosophila&#39; 19. </li><li> Añadir 1 - 3 gotas de agua para hidratar la levadura. </li><li> Dejar reposar el vial en un ángulo de 45 ° y permita 3 - 5 min para que la levadura para tomar el agua. </li><li> Mientras que la levadura está absorbiendo el agua, seleccionar una botella de moscas que expresan UASt- GCaMP5 myr 20 impulsado por bañera-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que han surgido recientemente (a myristoyRELAClONADAS forma de la GCaMP5 fue elegido para proporcionar una alta relación señal a ruido a través de la inmovilización del GECI a la membrana en el huevo). </li><li> Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2. Asegúrese de mantener la botella invertida a fin de no perder las moscas en la comida húmeda. </li><li> Inclinar las moscas anestesiadas sobre un bloque de CO 2 y tipo 10 - 15 hembras y 5 machos utilizando un pincel con un microscopio de disección. Nota: Es estándar para incluir los machos para proporcionar hembras saludables para la disección. </li><li> Cuando el vial de la etapa 1.3 está listo, añadir las moscas seleccionados al vial. Tenga cuidado de mantener la horizontal vial hasta que las moscas se vuelven activos. </li><li> Coloque el vial a 25 ° C durante aproximadamente 36 horas. </li><li> Devolver los restantes moscas de la plataforma de CO 2 a la botella o descarte. </li></ol> 2. Disección de Drosophila ovarios Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con Weil et al. Alabama. <shasta&gt; 18. <ol><li> Después de 36 horas, anestesiar las moscas del vial yeasted con CO2. </li><li> Una vez que las moscas dentro del vial se anestesian propina en la almohadilla de CO 2 que ser resuelto con un cepillo de pintura con un microscopio de disección. </li><li> Seleccione una hembra. </li><li> Aislar los dos ovarios de la hembra. Para el protocolo completo y detallado ver Weil et al. al. 18. En resumen: <ol><li> Coloque una pequeña gota de aceite de hidrocarburo halogenado oxigenada (serie 95) en un 1,5 N, 22 x 40 mm cubreobjetos. </li><li> Agarrar a la hembra con unas pinzas en la parte anterior del abdomen. </li><li> Celebración de las mujeres bajo el microscopio de disección, utilice el segundo conjunto de pinzas para eliminar suavemente la parte posterior de la hembra. </li><li> Limpie el tejido posterior de la segunda pinza. </li><li> Estrújalo la cavidad abdomen con las segundas pinzas de la anterior a la posterior del abdomen. Los dos ovarios opacos deben atenerse a las pinzas cuando se encuentre fuera de la FEMALe. </li><li> Tocar los ovarios en el aceite. </li><li> Eliminar cualquier tejido de los fórceps frotando las pinzas. </li><li> Repita estos pasos (2.4.1 - 2.4.7) para obtener tres cubreobjetos, cada uno de los ovarios que contienen de una mosca. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de óvulos maduros individual <ol><li> Bajo un microscopio de disección estándar con la ampliación fijado a 4X, en el primer cubreobjetos desde el paso 2.4, separar los dos ovarios rasgando el oviducto. </li><li> Introducir un par de pinzas cerradas en el centro de un solo ovario, teniendo cuidado de no perforar ningún cámaras de huevos. </li><li> Inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario al lado de las pinzas cerradas. </li><li> arrastrar suavemente la sonda de disección a través del ovario hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros (etapa 14 cámaras de huevos). </li><li> Repetir los pasos 3.1 - 3.4 2-5 veces dependiendo del tamaño del ovario y el número de huevos. Nota: La adición de CO 2 </sub&gt; típicamente causa la deposición de un solo huevo que aparecerá más grande con apéndices dorsales planteadas que los huevos depositados previamente. Este huevo debe ser desechada para la imagen, puesto que ya se ha activado dentro de la hembra. Nota: los huevos maduros son propensos a separarse fácilmente del tejido conectivo del ovario. </li><li> Si no hay óvulos maduros son visibles fuera del ovario, continuará burlas con la sonda de disección con suavidad. </li><li> Una vez que los huevos maduros son visibles en el cubreobjetos fuera del ovario, maniobrar 3-5 en una línea en el centro del cubreobjetos. Nota: Para obtener los mejores resultados, ejecute la sonda suavemente a lo largo del lado de los huevos. Nota: Evite tirar de los apéndices dorsales ya que esto puede dañar el huevo. Nota: Dependiendo de la imagen futura creación, alinear los huevos de aproximadamente 200 micras aparte perpendicular a la cubreobjetos de área máxima de imagen. </li><li> Una vez alineado, eliminar el resto del tejido ovárico arrastrándolo fuera de los huevos alineados utilizando el forceps. </li><li> Eliminar el exceso de aceite frotando con la esquina de una toallita médica. Tenga cuidado de no tocar los huevos maduros con el médico toallita huevos maduros que están en contacto se perderán. </li><li> Dibuje una cruz sobre el cubreobjetos con un marcador para simplificar la localización de la muestra bajo el microscopio. </li><li> Ajuste el cubreobjetos en un lugar seguro y dejar las cámaras de huevos preparados en el cubreobjetos para descansar durante 5 - 10 minutos a. Esto permite que el huevo se asiente en el aceite. Las muestras se pueden utilizar hasta 1 hora después de la disección. </li><li> Repetir los pasos 3.1 hasta 3.11 para el resto de los cubreobjetos con ovarios en ellos. </li></ol> 4. Preparación de la Imagen <ol><li> Llevar tampón de activación preparado 15 a temperatura ambiente. Nota: tampón de activación es un tampón hipotónico: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polietilenglicol 8000, 2 mM CaCl 2, se llevó a pH 6,4 con una 1: relación de 5 de NaOH: KOH.Para obtener más información, véase Mahowald de 1983 15. Alícuotas de tampón de activación se pueden almacenar a -20 ° C durante meses y a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li><li> transportar cuidadosamente preparados, cubreobjetos tampón de activación y pipetas de vidrio para la instalación de imágenes. Nota: Un campo amplio, confocal, disco giratorio o un microscopio de lámina de luz se pueden utilizar. Recomendamos el uso de un microscopio invertido. Nuestros resultados representativos se obtuvieron usando un microscopio confocal. </li><li> Un objetivo adecuado para obtener imágenes de todo el óvulo maduro debe ser elegido (en este caso: 20X 0,7 NA). </li><li> Montar la primera cubreobjetos preparado a la platina del microscopio. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos en el escenario. </li><li> Cualitativamente seleccionar un campo de visión con una cámara de huevos maduros para la activación. Imagen No pinchado cámaras de huevos o aquellos con formación de vesículas en la membrana. Nota: Para ver los pasos 4.6 - 4.7, los comandos de software variarán dependiendo de microscopio y el fabricante. </li><li> Conjunto de imágenes párrafometros para la excitación estándar GFP (488 nm) y emisión (500 - 580 nm). También configurar una vista de campo brillante con el fin de visualizar y orientar el óvulo maduro y aceite desplazado. </li><li> Seleccione el más bajo de Z-plano en el que los óvulos maduros son visibles y establecer un Z-pila completa que se aplicará a 40 micras, con aproximadamente 2 micras por paso. Establecer los parámetros de lo que no hay retraso entre la adquisición de Z-pila. Establecer las series de tiempo para capturar durante aproximadamente 30 min. </li></ol> La activación ex vivo de imágenes 5. Huevo <ol><li> Iniciar la captura de imágenes. </li><li> Espere a 1 - 2 completos Z-pilas para ser adquiridos. Esto muestra el óvulo maduro antes de la activación. </li><li> Retirar aproximadamente 300 l de tampón de activación en una pipeta de vidrio. </li><li> Colocación de la punta de la pipeta de vidrio que contiene tampón de activación en un ángulo de 45 ° por encima del cubreobjetos, mueva lentamente la pipeta en la trayectoria del haz hasta que está directamente encima del óvulo maduro está formando la imagen. La pipeta de vidrio debeser de 1 - 2 cm por encima del petróleo. </li><li> Añadir 1 - 2 gotas de tampón de activación en menos de 5 segundos desde la pipeta de vidrio. Esto debería desplazar el aceite. Evitar la adición de exceso de tampón de activación o tocar el huevo con la pipeta de vidrio, ya que puede causar el desplazamiento del óvulo maduro. Tenga cuidado de no tocar el cubreobjetos con la pipeta ya que esto puede causar un cambio en el plano focal o burbujas de aire para formar en el aceite de inmersión entre el objetivo y el cubreobjetos. </li><li> Mientras que la adición de tampón de activación durante la adquisición de imagen, compruebe el canal de campo brillante para asegurar que el aceite ha sido desplazado por el tampón de activación. Nota: Esto primera aparecer como una sombra debido a la pipeta romper la trayectoria del haz, pero también dará lugar a la aparición de pequeñas gotitas de aceite. Algunas gotas de aceite pueden permanecer asociado con el óvulo maduro que afectará a los resultados experimentales y calidad de imagen. </li><li> Si el aceite no se desplaza de la adición inicial de repetición de tampón de activación pasos 5,4-50.6. </li><li> Una vez que el aceite se desplaza con éxito, permitirá a las series de tiempo hasta su finalización. Nota: Debido a la hinchazón de los ovocitos en la activación, algunas cámaras de huevos se moverán de manera espectacular fuera del plano focal o campo de visión después de la adición de tampón de activación. En esta situación, detener la adquisición y montar la siguiente cubreobjetos. </li><li> Después de la secuencia de imágenes se ha completado la adquisición, guardar los datos. </li></ol> 6. posteriores a la adquisición de Procesamiento de Imágenes <ol><li> Abra el conjunto de datos utilizando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o el software de procesamiento de imágenes equivalentes, y seleccione los archivos relevantes para el análisis. </li><li> Para construir una proyección de los datos adquiridos seleccionar: Imagen&gt; Pilas&gt; Z-proyecto. </li><li> Seleccionar un comienzo Z-rebanada y una parada de Z-rebanada, por lo general toda la sección. Seleccione un tipo de proyección, usualmente la &#39;Max Intensidad&#39;. Compruebe casilla &#39;Todo Marcos de tiempo&#39; para aplicar los ajustes seleccionados para toda la serie. </li><li> Simás de un canal de fluorescencia ha sido fotografiado, utilice la herramienta de canales para permitir el movimiento entre los colores, hacer un compuesto, o hacer que la escala de grises de la imagen. Seleccionar Imagen&gt; Colores&gt; herramienta de Canales. </li><li> Para ajustar el brillo de la imagen y contraste seleccione Imagen&gt; Ajustar&gt; Brillo / Contraste. </li><li> Para exportar una sola imagen, mover cursor escala de tiempo de fotograma correspondiente y seleccione Archivo&gt; Guardar como&gt; JPEG, o cualquier formato preferido. </li><li> Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. Nota La velocidad de fotogramas del software de imágenes será requerido para dar una indicación de la hora en la imagen. </li><li> Para exportar la serie de tiempo como una película, seleccione: Archivo&gt; Guardar como&gt; AVI, a continuación, seleccione la velocidad de fotogramas (~ 7 fotogramas por segundo). </li><li> Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. </li><li> Para guardar el archivo en formato ajustado Fiji, seleccione Archivo&gt; Guardar. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El primer paso crítico en este protocolo es aislar los óvulos maduros sin dañarlos. Esto se puede lograr mediante maniobras gentiles de los huevos con la sonda de disección. La práctica permitirá que esta manipulación se ejecute sin dañar los huevos. Un segundo paso crucial es evitar la pérdida de la muestra cuando se aplica tampón de activación al huevo maduro en aceite. La aplicación del tampón de activación debe realizarse lentamente y sin contacto con el cubreobjetos. Este paso puede ser un desafío si la configuración del microscopio no permite un fácil acceso a la muestra. Es aconsejable mover partes axilares del microscopio, como una incubadora de temperatura. 
Se pueden realizar modificaciones a este protocolo para visualizar otros factores marcados con fluorescencia, en lugar de Ca2+ en la activación del huevo. De manera más general, las diferentes etapas del desarrollo de Drosophila o los resultados de agregar un tampón diferente podrían analizarse utilizando este protocolo. 
Es posible que sea necesario solucionar problemas si la configuración del microscopio no es óptima para visualizar la señal de la muestra. Esto se puede lograr aumentando o disminuyendo la potencia del láser, alterando el rango de captura y ajustando los parámetros de la pila Z. Otro problema podría ser que los huevos se muevan constantemente fuera del campo de visión al agregar el búfer de activación. Si esto sucede regularmente, deje que los huevos maduros se asienten en los cubreobjetos durante un período de tiempo más largo, de 15 a 20 minutos. Tenga en cuenta que el uso de un aceite de mayor viscosidad alterará el desplazamiento del aceite por tampón de activación. 
Esta técnica presentada aquí está limitada por la distancia de trabajo del objetivo, la deshidratación de los óvulos maduros y la capacidad de diseccionar los óvulos maduros sin dañarlos. Sin embargo, en comparación con los métodos de imagen in vivo en los que el ovocito maduro pasa a través de la hembra adulta y se deposita 13, nuestro método permite una mayor resolución espacial, la opción de manipular físicamente el óvulo maduro antes de la activación y la capacidad de probar el papel de la activación del óvulo sin fertilización. 
Hay muchas aplicaciones futuras potenciales de esta técnica, incluida la prueba de construcciones reporteras para componentes celulares en la activación del huevo y la visualización de la onda Ca2+ en fondos mutantes 14,24. Junto con herramientas experimentales y genéticas, el ensayo de activación de huevos ex vivo que se presenta aquí permite el estudio de los efectos desencadenantes, de propagación y posteriores de la onda de Ca2+ universalmente conservada.

Un cambio en el Ca intracelular 2 + concentración en la activación del huevo (ovocito) es un componente conservado de todos los organismos estudiados 1,2. Este evento inicia una amplia gama de procesos dependientes de Ca2 +, incluyendo la reanudación del ciclo celular y la traducción de mRNAs almacenados. Debido a esta necesidad de Ca2 +, la visualización de los cambios transitorios en las concentraciones intracelulares de Ca2 + ha sido de gran interés. Históricamente, se seleccionaron los organismos modelo para los estudios sobre la activación del huevo en función del tamaño y la disponibilidad de sus huevos. Diversos enfoques de visualización se han utilizado para seguir y cuantificar los cambios en intracelular de Ca 2 + concentraciones en estos sistemas, entre ellos: la aequorina fotoproteína en peces medaka 3; Ca 2+ tintes fluorescentes sensibles como la Fura-2 en el erizo de mar y el hámster 4,5; y calcio verde-1-dextrano en Xenopus 6. La generación y mejora de los indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) ha transformado la capacidad de visualizar Ca 2+ dinámica in vivo 7. Estas construcciones genéticas se expresan en tejidos específicos y limitan la necesidad de preparaciones de tejidos invasivos 8. GCaMPs son una proteína fluorescente (GFP) con base en la clase verde de Gecis que han sido muy eficaces debido a su alta afinidad de Ca2 +, y la capacidad de relación señal-ruido para ser personalizadas 9-11. En presencia de Ca2 +, el complejo GCaMP sufre una serie de cambios de conformación, a partir de la unión de Ca2 + a la calmodulina, que resulta en un aumento de la intensidad de fluorescencia del componente GFP 9. GCaMPs se han utilizado ampliamente en la investigación sobre las neuronas de Drosophila para visualizar cambios en el calcio intracelular 12. Los últimos applicatien GCaMP de la tecnología para la visualización de Ca2 + en los huevos maduros de Drosophila ha revelado un solo transitoria 2+ onda de CA en la activación del huevo 13,14. La ola de Ca2 + puede ser visualizado a bajo aumento durante la ovulación in vivo 13 o con mayor ampliación usando un ensayo de activación ex vivo 13,14. En el ensayo ex vivo, los oocitos maduros individuales están aisladas de los ovarios y se activan utilizando una solución hipotónica, referidos como tampón de activación, que se ha demostrado para recapitular los acontecimientos de la activación in vivo 15-17. Este ensayo ex vivo permite la fácil alta resolución de visualización de la onda 2 + Ca bajo diferentes condiciones experimentales incluyendo la interrupción farmacológica, manipulaciones físicas y mutantes genéticos. Este artículo demuestra la preparación de huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo e ªe microscopía posterior se utiliza para visualizar la onda de Ca 2+ usando GCaMP. Este enfoque puede ser utilizado para probar la iniciación y el control de la onda de Ca2 + y de sondear los resultados de aguas abajo.

<table><tbody><tr><td>Levadura activa seca</td><td>Fleischman' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Varios funcionarán</td></tr><tr><td>Lámpara</td><td>Mircotec Fibra óptica</td><td>MF0-90</td><td>Varios funcionarán</td></tr><tr><td>Toallitas médicas</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rotulador</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, negro - disponible en la mayoría de las papelerías. Anchura superfina 0,4 mm</td></tr><tr><td>CO2 almohadilla</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos n.º 1,5, 22 x 50 mm</td><td>International- Nº1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono, serie 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distribuidor en Europa:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Se puede utilizar en lugar de aceite de halocarbono, serie 95</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Si bien estas herramientas deben estar limpias, no es necesario el uso de un autoclave, el etanol sería suficiente.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>Pasteur Pipetas, vidrio, desenchufada, 150 mm de longitud&nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

el calcio de imágenes en<em&gt; drosophila</em&gt; en la activación del huevo

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

La activación del óvulo es un proceso universal que incluye una serie de eventos para permitir que el óvulo fertilizado complete la meiosis e inicie el desarrollo embrionario. Un aspecto de la activación del óvulo, conservado en todos los organismos examinados, es un cambio en la concentración intracelular de calcio (Ca2+), a menudo denominado "onda de Ca2+". Si bien la velocidad y el número de oscilaciones de la onda Ca2+ varía entre especies, el cambio en el Ca2+ intracelular es clave para provocar eventos esenciales para el desarrollo embrionario. Estos cambios incluyen la reanudación del ciclo celular, la regulación del ARNm, la exocitosis de los gránulos corticales y el reordenamiento del citoesqueleto.
En el huevo maduro de Drosophila, la activación ocurre en el oviducto femenino antes de la fertilización, iniciando una serie de eventos dependientes de Ca2+. Aquí presentamos un protocolo para obtener imágenes de la onda Ca2+ en Drosophila. Este enfoque proporciona un sistema de modelo manipulable para interrogar el mecanismo de la onda Ca2+ y los cambios posteriores asociados con ella.

Aquí hemos demostrado cómo preparar los huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo. Los huevos que expresan un GECI permitir imágenes de Ca 2+ en la dinámica de la activación del huevo y el inicio del desarrollo embrionario (Figura 1). Debe tenerse en cuenta que dependiendo de la GCaMP utilizado, específicamente la presencia de un grupo miristoilo, los resultados pueden tener ligeras diferencias cualitativas 13 14. También hemos demostrado un papel para la actina funcional durante la activación del huevo por la adición de un inhibidor de la polimerización de actina, citocalasina D, al tampón de activación (figura 2) 14. Un requisito para el citoesqueleto a la activación del huevo se conserva. En C. elegans, después de la fertilización, los componentes del citoesqueleto se reorganiza para preparar el embrión de una célula de la primera división asimétrica 21,22. En el erizo de mar, la alteración de cytoskeleTal re-organización después de la activación se ha demostrado que afecta el ciclo celular mediante la prevención de la formación del anillo contráctil 23. El papel de la actina en la mediación de una ola de Ca2 + y su función en la activación del huevo aguas abajo en Drosophila aún no se ha aclarado completamente. En Drosophila, co-visualización del Ca 2+ onda y del citoesqueleto de actina se puede conseguir utilizando este ensayo de activación ex vivo. Series de tiempo de múltiples canales puede ser adquirida y la dinámica del Ca2 + intracelular se puede emparejar con cambios en la organización de la actina en el ovocito (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ onda en serie Drosophila huevo Tiempo de activación de la ex vivo maduro Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 después de la unaddition de tampón de activación (AH). El aumento de Ca 2+ citoplasmático se origina en el polo posterior (B) y se propaga (BF) con una velocidad media de aproximadamente 1,5 micras / seg. Iniciación de la onda se observa típicamente dentro de 3 min de la adición de tampón de activación. Después de la activación, los niveles de calcio intracelulares del óvulo maduro vuelve a los niveles (G, H) de activación pre. Ver película suplementario 1 (tiempo total de 33 min). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: La adición de citocalasina D para la activación del búfer perturba Ca2+ propagación de las ondas. Series de tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 tras la adición de tampón de activación que contiene 10 mg / ml de citocalasina D concentración final (AH). Mientras que la onda de Ca2 + se inicia en el polo posterior (A), se ve comprometida y no llega a la parte anterior del huevo (F) (puntas de flecha en blanco denotan la parte delantera de la ola). No se observaron más cambios Ca 2+ durante 30 min). Ver película suplementario 2 (tiempo total de 30 minutos). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualización de actina y Ca 2+ en ELa activación gg en serie de Drosophila. Tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 (Cian) y UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) tras la adición de tampón de activación (AH). La 2+ onda Ca inicia desde el polo posterior y se recupera como en la Figura 1. Actina parece estar cambiando con el tiempo, las puntas de flecha blanca (A vs H). La falta de detección de la señal de Ca2 + en el centro del huevo maduro es debido al movimiento de la muestra durante la captura de imagen. Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila.

El calcio de imágenes en<em&gt; Drosophila</em&gt; En la activación del huevo

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el calcio durante la activación del óvulo en Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como cuál es el origen, la dinámica y los roles posteriores del calcio en la activación del óvulo. Las principales ventajas de esta técnica son permitir una mayor resolución espacial, la manipulación física del óvulo maduro antes de la activación y la posibilidad de evaluar el papel de la activación del óvulo sin fertilización. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para aislar los óvulos maduros sin dañarlos, y para aplicar el tampón de activación al óvulo maduro sin perder la muestra. Para comenzar este procedimiento, ajuste el aumento del microscopio estereoscópico a 4X. Sobre el primer cubreobjetos, separe los dos ovarios rasgando el oviducto con un par de pinzas cerradas y una sonda de disección, teniendo cuidado de no perforar ninguna cámara de huevo.A continuación, inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario, junto a la pinza cerrada. Arrastre suavemente la sonda de disección a través del ovario, hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros. Una vez que los óvulos maduros sean visibles sobre el cubreobjetos fuera del ovario, coloque tres a cinco de ellos en línea en el centro.A continuación, retire el resto del tejido ovárico arrastrándolo lejos de los óvulos alineados. Luego, elimine el exceso de aceite presionando con la esquina de una toallita médica. Dibuje una cruz en la lámina de cubierta con un marcador para localizar la muestra bajo el microscopio.Después de eso, deje las cámaras ovulares preparadas sobre la laminilla durante cinco a 10 minutos para permitir que los huevos se asienten en el aceite. Lleve las laminillas preparadas, el tampón de activación a temperatura ambiente y las pipetas de vidrio hasta el equipo de adquisición de imágenes. Seleccione un objetivo adecuado para obtener imágenes del huevo maduro completo.Luego, monte el primer cubreobjetos preparado sobre la platina del microscopio. A continuación, seleccione un campo de visión de una cámara de huevo madura para su activación. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes para la excitación y emisión estándar de GFP.A continuación, configure una vista de campo brillante para visualizar y orientar el huevo maduro y el aceite desplazado. Ahora, seleccione el plano Z más bajo en el que sean visibles los huevos maduros y establezca una Z-stack completa que se tomará durante 40 micrómetros con pasos de dos micrómetros.A continuación, configure la serie temporal para capturar las imágenes durante 30 minutos. En este procedimiento, inicie la captura de imágenes y adquiera de una a dos Z-series completas para mostrar el óvulo maduro antes de la activación. A continuación, aspire aproximadamente 300 microlitros de tampón de activación en una pipeta de vidrio.Coloque la punta de la pipeta de vidrio que contiene el tampón de activación en un ángulo de 45 grados sobre la cubreobjetos y mueva lentamente la pipeta hacia el trayecto del haz, hasta que esté directamente sobre el óvulo maduro que se está observando. Añada una o dos gotas del tampón de activación en menos de cinco segundos, para desplazar el aceite. La adición de una o dos gotas del tampón de activación debe hacerse con el ángulo correcto, suavemente y rápidamente.Mientras se agrega el tampón de activación durante la adquisición de imágenes, revise el canal de campo claro para asegurarse de que el aceite haya sido desplazado. Una vez que el aceite haya sido desplazado con éxito, permita que la serie temporal se ejecute hasta su finalización. Para crear una proyección de los datos adquiridos, seleccione una rebanada Z inicial y una rebanada Z final para toda la sección.A continuación, seleccione un tipo de proyección, por ejemplo, intensidad máxima. Luego, marque la casilla Todos los fotogramas para aplicar la configuración seleccionada a toda la serie. Para ajustar el brillo y el contraste de la imagen, seleccione Imagen, luego Ajustar y a continuación Brillo/Contraste.Para exportar la serie temporal como una película, seleccione Archivo, luego Guardar como y a continuación AVI. Después, seleccione la velocidad de fotogramas. Aquí se muestra la serie temporal de un óvulo de Drosophila maduro ex vivo que expresa un indicador genéticamente codificado de calcio tras la adición del tampón de activación.El aumento en el calcio citoplasmático se origina en el polo posterior y luego se propaga con una velocidad promedio de aproximadamente 1,5 micrómetros por segundo. La iniciación de la onda generalmente se observa dentro de los tres minutos posteriores a la adición del tampón de activación. Tras la activación, los niveles intracelulares de calcio del óvulo maduro se recuperan.En Drosophila, se puede lograr la covisualización de la onda de calcio y el citoesqueleto de actina mediante este ensayo de activación ex vivo. La actina parece cambiar con el tiempo, como lo indican las flechas blancas. La falta de detección de la señal de calcio en el centro del huevo maduro se debe al movimiento de la muestra durante la captura de la imagen.Una vez dominada, esta técnica completa puede realizarse en menos de una hora, si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomarse el tiempo necesario al manipular las cámaras ovulares y al configurar los parámetros para la adquisición. Este procedimiento puede adaptarse para visualizar otras proteínas marcadas con fluorescencia, orgánulos o indicadores de calcio durante la activación del óvulo.Esto puede ayudar a abordar preguntas relacionadas con la fuente de calcio y los efectos downstream.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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