El calcio de imágenes en Drosophila En la activación del huevo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el calcio durante la activación del huevo en Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cuál es la fuente, la dinámica y las funciones posteriores del calcio en la activación de los óvulos. Las principales ventajas de esta técnica son permitir una mayor resolución espacial, la manipulación física del óvulo maduro antes de la activación y probar el papel de la activación del óvulo sin fertilización.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para aislar los óvulos maduros sin dañarlos y aplicar un tampón de activación al óvulo maduro sin perder la muestra. Para comenzar este procedimiento, ajuste el aumento del microscopio de disección a 4X. En el primer cubreobjetos, separe los dos ovarios rasgando el oviducto con un par de pinzas cerradas y una sonda de disección, teniendo cuidado de no perforar ninguna cámara de huevos.

A continuación, inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario, junto a las pinzas cerradas. Arrastre suavemente la sonda de disección a través del ovario, hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros. Una vez que los óvulos maduros sean visibles en el cubreobjetos fuera del ovario, maniobre de tres a cinco de ellos en una línea en el centro.

A continuación, retira el resto del tejido ovárico arrastrándolo lejos de los óvulos alineados. Luego, elimine el exceso de aceite frotándolo con la esquina de una toallita médica. Dibuje una cruz en el cubreobjetos con un marcador para ubicar la muestra bajo el microscopio.

Después de eso, deje reposar las cámaras de huevos preparadas en el cubreobjetos durante cinco a 10 minutos para permitir que los huevos se asienten en el aceite. Lleve al centro de diagnóstico por imágenes los cubreobjetos preparados, el tampón de activación a temperatura ambiente y las pipetas de vidrio. Seleccione un objetivo adecuado para obtener imágenes de todo el óvulo maduro.

A continuación, monte el primer cubreobjetos preparado en la platina del microscopio. A continuación, seleccione un campo de visión de una cámara de óvulos maduros para su activación. Ajuste los parámetros de imagen para la excitación y emisión de GFP estándar.

Después de eso, configure una vista de campo brillante para visualizar y orientar el huevo maduro y el aceite desplazado. Ahora, seleccione el plano Z más bajo donde los huevos maduros son visibles. Y establezca una pila Z completa para que se tome durante 40 micrómetros a dos micrómetros por paso.

A continuación, configure la serie temporal para capturar las imágenes durante 30 minutos. En este procedimiento, inicie la captura de imágenes y adquiera una o dos pilas Z completas para mostrar el óvulo maduro antes de la activación. A continuación, extraiga aproximadamente 300 microlitros de tampón de activación en una pipeta de vidrio.

Coloque la punta de la pipeta de vidrio que contiene el tampón de activación en un ángulo de 45 grados por encima del cubreobjetos y mueva lentamente la pipeta hacia la trayectoria del haz, hasta que esté directamente encima del óvulo maduro del que se está tomando la imagen. Agregue una o dos gotas de tampón de activación en menos de cinco segundos, para desplazar el aceite. La adición de una o dos gotas de tampón de activación debe realizarse en el ángulo correcto, con suavidad y rapidez.

Al agregar el búfer de activación durante la adquisición de imágenes, verifique el canal de campo claro para asegurarse de que el aceite se haya desplazado. Una vez que el aceite se haya desplazado con éxito, deje que la serie temporal se ejecute hasta su finalización. Para crear una proyección de los datos adquiridos, seleccione un segmento Z inicial y un segmento Z final para toda la sección.

A continuación, seleccione un tipo de proyección, por ejemplo, la intensidad máxima. A continuación, marque la casilla de verificación Todos los marcos de tiempo para aplicar la configuración seleccionada a toda la serie. Para ajustar el brillo y el contraste de la imagen, seleccione Imagen, luego Ajustar, seguido de Brillo/Contraste.

Para exportar la serie temporal como una película, seleccione Archivo, Guardar como y, a continuación, AVI. A continuación, seleccione la velocidad de fotogramas. Aquí se muestra la serie temporal de un huevo maduro ex vivo de Drosophila que expresa un indicador de calcio codificado genéticamente tras la adición de tampón de activación.

El aumento del calcio citoplasmático se origina en el polo posterior y luego se propaga con una velocidad media de aproximadamente 1,5 micrómetros por segundo. El inicio de la onda se observa normalmente dentro de los tres minutos posteriores a la adición del tampón de activación. Después de la activación, los niveles de calcio intracelular del óvulo maduro se recuperan.

En Drosophila, la visualización conjunta de la onda de calcio y el citoesqueleto de actina se puede lograr utilizando este ensayo de activación ex vivo. La actina parece estar cambiando con el tiempo, como lo indican las puntas de flecha blancas. La falta de detección de la señal de calcio en el centro del óvulo maduro se debe al movimiento de la muestra durante la captura de la imagen.

Una vez dominada, toda esta técnica se puede hacer en menos de una hora, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo al maniobrar las cámaras de huevos y al configurar los parámetros para la adquisición. Este procedimiento se puede adaptar para visualizar otras proteínas, orgánulos o indicadores de calcio marcados fluorescentemente en la activación del huevo.

Esto puede ayudar a abordar las preguntas sobre la fuente de calcio y los efectos posteriores.