Name: Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende a crear un sistema de co-cultivo celular con membranas permeables para estudiar señalización paracrina sin contacto directo entre células. Este método permite evaluar efectos de factores solubles secretados.

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Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) Canadá a MGM. JR es un becario estudiantil de NSERC-Vanier.

Nota: Cada uno de los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar como se requiere para el cultivo de células de mamíferos. Además, las directrices generales para el cultivo celular estéril óptima se aplican, por ejemplo., Descartando consejos en cualquier momento que pueden dar lugar a la contaminación cruzada, lo que reduce la cantidad de células momento en que se expone al aire cuando se realizan cambios en los medios enteros, adecuadamente, pero con cuidado sin dejar de remover Las suspensiones de células para asegurar su pipeteo homogénea, etc. Por otra parte, las inserciones son un tipo de material de plástico que requieren un manejo especial. En primer lugar, cada vez que se manipulan inserciones, evite tocar la membrana frágil, que desgarra con facilidad y por lo tanto podría poner en peligro el experimento. Además, no es adecuado para llevar a cabo la aspiración por vacío del medio de cultivo celular, ya que hay un riesgo de perforar la membrana o disociar células adherentes. A continuación, los insertos cuelgan libremente en la placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos y, así, se debe tener precaución cuando moving el material de plástico o al pipetear para evitar disociar células adherentes. Además, al usar insertos con grandes tamaños de poro, hay una posibilidad de que el medio de cultivo celular se filtra a través de la membrana y, por lo tanto, es importante controlar frecuentemente el nivel de líquido. Por último, tenga en cuenta que el siguiente protocolo está diseñado para las células adherentes y no requiere modificaciones menores con el fin de ser adecuado para las células en suspensión. 1. Las pautas generales para la realización de inserción experimentos de co-cultivo <ol><li> Siembra tipo de célula # 1 en insertos <ol><li> Desenvolver los insertos de sus envases. </li><li> Coloque los insertos en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos vacíos de la dimensión adecuada. Para ello, agarre el borde superior de la pieza de inserción con unas pinzas. </li><li> Para mejorar la unión y propagación de las células adherentes, acondicionar los insertos con medio de cultivo celular antes de la siembra. Para ello, cubrir toda la superficie de la membrana con mediu cultivo celularM utilizando una micropipeta. NOTA: Haga esto por el mayor número de inserciones según sea necesario. </li><li> Vuelva a colocar la tapa sobre la placa y se incuba durante al menos 1 hora u O / N en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5-10% de CO2). </li><li> Cuando están condicionados los insertos, eliminar todo el medio de cultivo celular utilizando una micropipeta. Descartar el medio utilizado. </li><li> tipo de células semilla # 1 en fresco medio de cultivo celular de la misma manera como en una placa de múltiples pocillos. Para ello, extraer un volumen apropiado de la suspensión celular con una micropipeta y dispensar el líquido en el inserto. NOTA: Preparar el mayor número de inserciones según sea necesario. </li><li> Después de sembrar todas las inserciones, mueva suavemente la placa de la izquierda y la derecha, luego hacia atrás y adelante con el fin de distribuir uniformemente las células. Evitar hacer movimientos circulares, ya que esto hará que las células se acumulan en el centro de los insertos. </li><li> Coloque la tapa en la placa e incubar según lo especificado por según los requisitos celulares (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Siembra tipo de célula # 2 en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos <ol><li> tipo de célula semilla # 2 en el medio de cultivo de células frescas de acuerdo con la Sección 1. </li><li> Preparar como muchos pozos como se requiere para el número de inserciones. Roca la placa como en el paso 1.1.7) para asegurar que las células se distribuyen uniformemente en los pocillos. </li><li> Coloque la tapa en la placa e incubar en las mismas condiciones (por lo general 37 ° C, 5 a 10% de CO 2). </li></ol></li><li> refrescante en medio de inserciones <ol><li> Usando una micropipeta, retirar parte o todo el medio de cultivo celular, en los insertos que contienen el tipo de célula # 1. Descartar el medio utilizado. </li><li> Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. descansar suavemente la punta en la pared interior del inserto y lentamente dispensar el medio de cultivo celular. </li><li> Coloque la tapa en la placa y se incuba como en la etapa 1.1.4. </li></ol></li><li> medio refrescante en placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos <ol><li> El uso de un MICROPIpette, extraer parte o todo el medio de cultivo celular en los pocillos que contienen el tipo de célula # 2. Descartar el medio utilizado. </li><li> Dibuje un volumen apropiado de medio de cultivo celular fresco. Resto de la punta en la pared interior del pozo y lentamente dispensar el medio de cultivo celular. </li><li> Coloque la tapa en la placa e incubar según los protocolos de cultivo de células previamente establecidos. </li></ol></li><li> La transferencia de insertos que contienen tipo de célula # 1 a las placas de cultivo de tejidos de múltiples pocillos que contienen el tipo de célula # 2. NOTA: Realice este paso cuando ambos tipos de células han alcanzado la etapa de crecimiento apropiado. <ol><li> Antes de transferir los insertos en los pozos, hacer los cambios necesarios medianas, como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.3) y 1.4). NOTA: En este punto, es importante para dispensar los volúmenes apropiados de medios de comunicación en ambos compartimentos como se especifica en las instrucciones del fabricante de inserción. </li><li> Con unas pinzas, agarre el borde superior de un inserto que contiene células Type # 1 y suavemente lo coloca en el pocillo apropiado que contiene el tipo de célula # 2. </li><li> Después de transferir todas las inserciones, comprobar la presencia de burbujas de aire debajo de la membrana de las inserciones. NOTA: Las burbujas de aire previenen cualquier intercambio a través de la membrana de la inserción y pueden poner en peligro todo el experimento. </li><li> Si hay burbujas de aire, levante suavemente el inserto del pozo utilizando pinzas y sumergirse de nuevo en el medio de cultivo celular. Las burbujas desaparecerán. Si todavía están presentes, trate con suavidad sumergir insertos de nuevo en el medio de cultivo celular en un ángulo. NOTA: No golpee o revolver insertos no disociar las células adherentes. </li><li> Después de la eliminación de todas las burbujas de aire y comprobar que los volúmenes de los medios de comunicación en ambos compartimentos, coloque la tapa en la placa e incubar. </li></ol></li><li> medios refrescantes en un sistema de co-cultivo NOTA: A pesar de que la membrana permite fácilmente el intercambio de medios entre el inserto y bien y es descanso del medio se realiza enambos compartimentos desde el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio en los compartimentos superior e inferior por difusión por sí solo puede ser bastante largo. <ol><li> medio refrescante en insertos que contienen el tipo de célula # 1 se realiza de la misma manera que en el paso 1.3). </li><li> Para refrescar en los pozos que contienen el tipo de célula # 2 medianas, deslice suavemente el inserto hacia un lado para crear un espacio lo suficientemente amplia como para dar cabida a una punta de pipeta. Refrescar el medio como en el paso 1.4). </li><li> Verificar la presencia de burbujas de aire y verificar los volúmenes como por pasos 1.5.3) a través 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Ejemplo: la medición de los efectos de las citoquinas secretadas por microglia N9 activados por LPS en las células PC12 neuronales NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para matraz específica, bien y platos de distintos tamaños. Sin embargo, el protocolo se puede personalizar para cualquier dimensión plasticware. Para los medios de comunicación y la composición ver Tabla de Materiales. <ol><li> Siembra y diferenciación de las células PC12 en múltiplesy placas de cultivo de tejidos <ol><li> medio de cultivo celular PC12 rutina de calentamiento, PC12 medio de diferenciación y tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Usar las células PC12 a 60-80% de confluencia de un 75 cm 2 matraz. </li><li> Con un 15 mm pipeta Pasteur, lleve a cabo la aspiración por vacío de la totalidad del medio de cultivo celular en el matraz. </li><li> Enjuague suavemente la monocapa de células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril y eliminar el líquido con una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de no disociar las células en este paso. </li><li> Cubrir la monocapa de células con 3 ml de tripsina-EDTA y se incuba durante 2 a 3 min a 37 ° C. </li><li> Asegúrese de que todas las células se separan con un microscopio. Si muy pocas células están flotando, se incuba durante un período más largo para un máximo de 5 minutos. </li><li> Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 de rutina con el fin de inactivar la tripsina-EDTA. </li><li> Con una pipeta de 10 ml, se tritura suavemente mientras se asegura de que la mayoría de las células se disocian de la parte inferior of matraz. Evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular. </li><li> Con la misma pipeta de 10 ml, la transferencia de la suspensión celular en un tubo de centrifugación de 50 ml. </li><li> Centrifugar durante 1 min a 3.200 xg </li><li> Descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 10 ml de medio de cultivo celular PC12 rutina con una pipeta de 10 ml. NOTA: Este volumen se puede ajustar si la pastilla es inusualmente grande o pequeña. </li><li> Se tritura con la misma pipeta de 10 ml para homogeneizar el sedimento. Las células PC12 a menudo se agrupan por lo que al menos el 20 pipeteando arriba y downare necesario. NOTA: Mientras trituración vigorosa es necesario, evitar la creación de burbujas de aire en la suspensión celular. </li><li> En un tubo de 1,5 ml, preparar una dilución apropiada de la suspensión de células en azul de tripano. Contar las células utilizando un hemocitómetro de acuerdo a protocolos previamente establecidos 74. </li><li> En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión celularcon medio de diferenciación PC12 para obtener una adecuada suspensión celular diluida para la siembra de los pozos de una placa de 24 pocillos (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml por pocillo de acuerdo con el protocolo del fabricante). NOTA: La placa de 24 pocillos debe ser recubierto previamente con colágeno tal como se especifica por los protocolos previamente establecidos 75. </li><li> Distribuir 0,6 ml de la suspensión celular por pocillo usando una micropipeta. </li><li> Cuando todos los pozos son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7). </li><li> Para permitir la adecuada diferenciación de las células PC12, incubar las placas de 24 pocillos durante 7-9 días a 37 ° C en una atmósfera húmeda al 5% de CO 2 en la PC12 medio de diferenciación 15,16 antes de realizar experimentos de co-cultivo. </li><li> Realizar cambios de medio cada dos días mediante la eliminación de la mitad del líquido y su sustitución por un volumen igual de medio de diferenciación PC12 fresco. </li></ol></li><li> Siembra microglia N9 en los insertos y el tratamiento con LPS <ol><li> Un día antes de realizar los experimentos de co-cultivo, pre-tratamiento de PTFE de 0,4 micras de poro insertos con medio de cultivo celular N9 rutina para optimizar la adherencia de las células, siguiendo los pasos 1.1.1) a través de 1.1.4) </li><li> medio caliente rutina N9 cultivo celular y la tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Mientras tanto, un peso aproximado de 10 mg de LPS en un tubo de 1.5 ml para su uso posterior. NOTA: Dado que la endotoxina LPS es un pro-inflamatoria potente y exigen especiales precauciones de seguridad, gafas, guantes y un respirador de partículas se recomienda encarecidamente. </li><li> Utilice células N9 a 80-90% de confluencia de un 75 cm 2 matraz. </li><li> Siga los pasos 2.1.3) a 2.1.14). Siempre use medio de cultivo celular N9 rutina en lugar de medio de cultivo celular PC12 de rutina. También tenga en cuenta que la microglia N9 no se aglutinan tanto como lo hacen las células PC12, por lo menos la pipeta hacia arriba y hacia abajo pueden ser necesarios en el paso 2.1.13). </li><li> En un tubo separado 50 ml, dividir la suspensión de células con medio de cultivo celular N9 a obtain una suspensión celular diluida adecuada para la siembra de insertos diseñados para sostener en placas de 24 pocillos (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml por inserción de acuerdo con el protocolo del fabricante, para el área de superficie de la membrana ver información del fabricante). NOTA: Estos insertos ya están recubiertas con colágeno por el fabricante y están optimizados para la adhesión celular. </li><li> Distribuir 0,05 ml de la suspensión celular por inserción utilizando una micropipeta. </li><li> Cuando todas las inserciones son cabeza de serie, el rock de la placa como en el paso 1.1.7). </li><li> Realizar diluciones en serie de LPS utilizando medio de tratamiento N9 para obtener 4 g / ml, 2 mg / ml y las soluciones de trabajo 1 g / ml. </li><li> Pipetear 0,05 ml de la solución de 4 mg / ml de trabajo en un conjunto de insertos a fin de producir una dilución final de 2 mg / ml. </li><li> Repita el paso 2.2.10) para las otras dos soluciones de trabajo en diferentes conjuntos de inserciones, produciendo una dilución final de 1 mg / ml y 0,5 mg / ml, respectivamente. </li><li> EnCubate las placas que contienen los insertos de 24 horas a 37 ° C en una atmósfera húmeda de CO 2 al 5% para permitir la activación de microglia N9 con LPS antes de realizar los experimentos de co-cultivo. </li></ol></li><li> Co-cultivo de células PC12 neuronales con microglia N9 <ol><li> En 7-9 días de diferenciación de las células PC12, activar la microglia N9 después de 24 horas de incubación con LPS por medio de tratamiento caliente N9 y medio de tratamiento PC12 en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Realizar un cambio de medio total de la microglia N9 como en el paso 1.3), la sustitución de todo el medio utilizado por 0,1 ml de medio de tratamiento N9. Haga esto para cada insert.This es necesario eliminar todos los rastros de LPS, dejando solamente la microglia N9 activados en los insertos. </li><li> Realizar un cambio de medio total de células PC12 neuronales como en el paso 1.4). La transferencia de las inserciones en las placas de 24 pocillos como en el paso 1.5) .Incubate los N9-PC12 co-cultivos durante 24 horas o de 48 horas a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% húmedo. </li><li> después de 24hr o 48 hr, recoger el sobrenadante y / o las células de la citotoxicidad, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western blot, u otros ensayos. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico de cualquier sistema de inserción experimento de co-cultivo realidad habita en la elección de la inserción correcta de usar. El tamaño de poro y material de la membrana se deben tener en cuenta a fondo, sin olvidar a considerar el tipo de células que se sembraron y el propósito del experimento. Por ejemplo, los ensayos de quimiotácticas pueden utilizar el mismo tipo de membrana de células que co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles s...

El estudio de los tejidos, órganos o sistemas in vitro es un intento de simplificar las muy complejas relaciones existentes entre los varios subtipos celulares que comprenden organismos multicelulares. De hecho, los estudios in vitro hacen posible adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Hay dos ventajas principales de la realización de los experimentos in vitro: 1) la reducción de las interacciones celulares, y 2) la capacidad de manipular fácilmente el entorno celular. Científicos Por lo tanto, estas dos ventajas han permitido a predecir el comportamiento de determinados tipos de células in vivo, dando lugar a la capacidad de regular los resultados de las influencias extrínsecas en organismos completos. En ese sentido, el cultivo in vitro de células de frecuencia funciona como un puente que conecta las ciencias básicas y aplicadas de vida. No obstante, hay también varias desventajas de trabajar in vitro, el más importante siendo que una determinada reserva habite en el fisiológicaal pertinencia de fenotipos observados. De hecho, cuando un solo tipo de células se cultiva en un recipiente, la cultura pierde, en diversa medida, sus conexiones célula-célula con otros tipos de células, su contribución al medio ambiente humoral del tejido y el organismo de origen, y las anclas dentro el tejido que le permitió mantener una estructura tridimensional determinada veces crucial para la función celular. La cuestión de relaciones célula-célula ha sido abordado por el desarrollo de técnicas de cultivo mixto. En este método, dos o más poblaciones de células se cultivan conjuntamente en el mismo recipiente de cultivo. Sin embargo, estos cultivos mixtos tienen inconvenientes importantes. Por un lado, algunos subtipos de células no interactúan físicamente con otros en el tejido de origen y se basan únicamente en las comunicaciones paracrinos sufridas por factores solubles secretadas y los receptores cercanos. Este es el caso para varios procesos inflamatorios que dependen de la señalización de citoquinas proximal. En c mixtaultures, interacciones físicas son inevitables y hacen imposible el estudio de las comunicaciones paracrinos en la ausencia de contactos célula-célula que puede producir resultados alterados. Por otra parte, la consecución de las interpretaciones de células específicas dentro de una población mixta se vuelve inviable sin el uso de técnicas de separación duras que podrían afectar significativamente los resultados. Para resolver estos problemas importantes, el uso de medios acondicionados se ha desarrollado como una técnica que permite a las culturas compartimentados y el estudio de señalización paracrina. Este método requiere la transferencia del sobrenadante de un tipo de célula, media llamada así acondicionado, a los pocillos que contienen otra población de células. Sin embargo, una desventaja importante es que las moléculas de vida corta no sobreviven el tiempo suficiente en el medio condicionado para ser transferidos a los pocillos de la segunda población de células. Incluso moléculas de larga vida se diluirán en gran medida con el tiempo debido a la difusión. Además, tanto celularpoblaciones sólo participan en la comunicación paracrina unidireccional en lugar de en la comunicación bidireccional activo. Esto conduce a la ausencia de señalización de realimentación que es de vital importancia en la recreación de las relaciones multicelulares precisos tal como existen en vivo. Como consecuencia de ello y conducido por la necesidad de simular mejor el original en condiciones in vivo en el entorno celular in vitro, varios avances en técnicas de cultivo celular se han alcanzado en los últimos años. Uno de los avances más importantes ha sido el uso de soportes permeables con membranas microporosas para compartimentar cultivos de células, que se utilizan por primera vez por Grobstein en 1953 1. Tales soportes permeables se han adaptado durante los años para dar cabida a numerosos tipos de células y para ser utilizado en varias aplicaciones diferentes. Hoy en día, estos soportes existen insertos como huecos que están diseñados para descansar en los pozos de una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos o en circuplatos lar. En un sistema de co-cultivo, el inserto contiene un tipo de célula, mientras que el pozo o plato contiene la otra población celular, lo que permite el estudio de la contribución de las dos poblaciones diferentes de células en su entorno humoral (Figura 1). Como resultado, la polaridad celular (basolateral vs secreción apical o recepción de la señal) se conserva, lo que confiere sistemas de inserción de co-cultivo una ventaja importante sobre cultivos mixtos y técnicas de medio acondicionado. Existen varios tipos de materiales de membrana están disponibles, los más comunes son de poliéster (PET), policarbonato (PC) o colágeno recubierto de politetrafluoroetileno (PTFE), y existen en diferentes tamaños de poro que van de 0,4 micras a 12,0 micras. Estas variedades de materiales y tamaños de poro ofrecen un espectro de insertos que ejercen funciones variables relevantes a las propiedades ópticas, espesor de la membrana celular y la adhesión que los hacen práctica a diferentes niveles para los siguientes usos no se limitan a: -estudiandola diferenciación celular, el desarrollo embrionario, la metástasis tumoral y la reparación de heridas mediante ensayos quimiotácticas a través de membranas permeables; -Evaluar la penetración del fármaco mediante la evaluación de su transporte a través de monocapas epiteliales o endoteliales cultivadas en soportes permeables, y; -Realizar de células co-cultivos para analizar las modulaciones de comportamiento de las células inducidas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula. El propósito de este artículo es describir las pautas metodológicas generales para cumplir con la tercera función se ha indicado anteriormente, que consiste en evaluar los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas en ausencia de contacto célula-célula utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. Varios campos diferentes de investigación hacen uso de los sistemas de inserción de co-cultivo con el fin de responder a las preguntas relacionadas con el efecto de factores solubles secretadas en las poblaciones de células. De hecho, la señalización paracrina que modula el comportamiento celular en varios niveles es pertinente en todos los tejidosy sistemas, lo que hace que los sistemas de co-cultivo de inserción indispensable para garantizar los avances en estos campos. Por el contrario, el uso de insertos puede confirmar que la transducción de señales es por contacto directo célula-célula y no por factores secretados. Uno de los usos más importantes de inserciones en los estudios es la inflamación 2-14, donde se evalúa el efecto de las citoquinas secretadas en varios jugadores celulares de la inmunidad. En particular, el estudio de la inflamación en el sistema nervioso central (SNC) se ha beneficiado enormemente de los estudios de inserción de co-cultivo, que han permitido a definir mejor las funciones paracrinas distintos de neuronas y la microglia en la conducción de la neuroinflamación 15-21. Estos sistemas también se diseñaron para estudiar el potencial anti-inflamatorio de moléculas que se basa en su capacidad para reducir o inhibir la secreción de factores pro-inflamatorias 22-26. Investigaciones relacionadas con el cáncer de 27 a 31, en ​​particular, los mecanismos de la angiogénesis 32-34 y inflammati subyacenteen 35-42 en la tumorigénesis, también se beneficia de los sistemas de inserción de co-cultivo. Por otra parte, los factores solubles son de gran importancia en los procesos que conducen a la diferenciación y varios estudios han utilizado inserciones para responder preguntas en ese campo en particular 43-50. En el SNC, ya que el tejido neural tiene un potencial de renovación muy limitado, el estudio de neurotrophism y neuroprotección es fundamental y ha sido ampliamente asegurada por el uso de células madre en los sistemas de co-cultivo de 51-56. Además, las inserciones también se utilizan en campos tan diversos como la nefrología 57,58, interacciones endoteliales y la angiogénesis 59-62, 63-65 apoptosis de señalización, la inflamación en la obesidad y el síndrome metabólico 22,23,66-67, oído interno de protección de las células ciliadas 68,69, e incluso en la virulencia de hongos 70,71 y 72,73 parasitología. En este artículo se ofrece pautas metodológicas generales con el fin de establecer un experiment a la vista de la evaluación de los cambios celulares mediadas por factores solubles secretadas utilizando un sistema de inserción de co-cultivo. En particular, nos centraremos nuestra atención en las células nerviosas co-cultivos y sus usos en el estudio de procesos neuroinflammatory. Dado el amplio espectro de los experimentos que se inserta hacer posible proyectos piloto, es insoportable para cubrir todos los aspectos de esta técnica de cultivo celular. A modo de ejemplo, un protocolo específico para medir los efectos de las citoquinas secretadas por lipopolisacárido (LPS), activado microglia N9 en las células PC12 neuronales se detallará, que ofrece una comprensión concreta de la metodología de inserción de co-cultivo.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Cálido en 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Dulbecco' s Águila Modificada' s Mezcla Medio/Nutriente F-12 Jamón</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de su uso, debe complementarse con 0,365 gm/L L-glutamina</td></tr><tr><td>Suero para caballos</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar Factor de crecimiento nervioso-7S de la glándula submaxilar murina</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstituya el polvo liofilizado en una solución salina tamponada o medio de cultivo de tejidos que contenga 0.1&ndash; 1,0% albúmina sérica bovina o 1-10% solución sérica</td></tr><tr><td>de tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes</td></tr><tr><td>de usar lipopolisacáridos de&nbsp; Escherichia coli&nbsp; 055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Insertos</td></tr><tr><td>tóxicos de cultivo celular para uso con placas de 24 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &mu; m poros placas</td></tr><tr><td>de 24 pocillos</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Recubrimiento con colágeno antes de usar</td></tr><tr>Medio <td></td><td></td> de<td>cultivo celular PC12</td><td>de rutina Medio de cultivo celular N9 de rutina</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 85% RPMI medio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 90% DMEM-F12 medio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% de suero</td><td></td><td></td> de caballo inactivado por calor<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% de suero de caballo inactivado por calor</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Suero fetal bovino inactivado por calor al 5%</td> Medio de diferenciación PC12 Medio de tratamiento N9-&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI medio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% DMEM-F12 medio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Suero fetal bovino inactivado por calor al 1</td>%-&nbsp;<td></td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Suero fetal bovino inactivado por calor</td></tr> <tr><td>al 1%-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 ng/mL</td> factor de crecimiento <td></td><td></td><td></td>nervioso</tr><tr><td>PC12 medio</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de tratamiento-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% de suero</td><td></td><td></td><td></td> fetal bovino inactivado por calor</tr></tbody></table>

desarrollo de un sistema de inserción co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula contacto

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

El papel de los factores solubles secretados en la modificación de las respuestas celulares es un tema recurrente en el estudio de todos los tejidos y sistemas. En un intento de hacer sencillas las relaciones muy complejas entre los diversos subtipos celulares que componen los organismos multicelulares, se han desarrollado técnicas in vitro para ayudar a los investigadores a adquirir una comprensión detallada de las poblaciones de células individuales. Una de estas técnicas utiliza insertos con una membrana permeable que permite que los factores solubles secretados se difundan. Por lo tanto, una población de células cultivadas en insertos puede ser co-cultivada en un pocillo o placa que contenga un tipo de célula diferente para evaluar los cambios celulares después de la señalización paracrina en ausencia de contacto célula-célula. Estos sistemas de cocultivo con insertos ofrecen varias ventajas sobre otras técnicas de cocultivo, a saber, la señalización bidireccional, la polaridad celular conservada y la detección de cambios celulares específicos de la población. Además de ser utilizados en el campo de la inflamación, el cáncer, la angiogénesis y la diferenciación, estos sistemas de cocultivo son de primordial importancia en el estudio de las intrincadas relaciones que existen entre los diferentes subtipos celulares presentes en el sistema nervioso central, particularmente en el contexto de la neuroinflamación. En este artículo se ofrecen pautas metodológicas generales para la realización de un experimento con el fin de evaluar los cambios celulares mediados por factores solubles secretados utilizando un sistema de cocultivo de insertos. Además, se detallará un protocolo específico para medir los efectos neuroinflamatorios de las citocinas secretadas por la microglía N9 activada por lipopolisacáridos en las células neuronales PC12, ofreciendo una comprensión concreta de la metodología de cocultivo de insertos.

El uso de sistemas de co-cultivo de inserción es particularmente pertinente en el estudio de los procesos neuroinflammatory que muestran las relaciones entre los diferentes actores paracrinos celulares del sistema nervioso central. Inmunidad en el SNC se logra principalmente por células residentes microgliales, que supervisan su entorno en su estado de reposo ramificada (Figura 2A) y son capaces de alteraciones de percepción que pudiera molestar al homeostasis muy valios...

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de co-cultivo celular de dos tipos celulares utilizando insertos con una membrana permeable, lo que permite la difusión de factores solubles secretados. Esto se logra mediante una serie de pasos que colocan con precisión insertos que contienen un tipo celular en una placa de cultivo de tejidos con múltiples pocillos que contiene un segundo tipo celular. Comenzamos sembrando el tipo celular número uno en los insertos y el tipo celular número dos en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos.El segundo paso consiste en transferir los insertos a los pocillos de la placa que contiene el tipo de célula número dos. En última instancia, esto permite cosechar los dos tipos celulares así como sus respectivos sobrenadantes. Por lo tanto, es posible evaluar el efecto de los factores solubles secretados sobre el tipo de célula de interés. En organismos pluricelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas en diferentes tipos celulares como resultado de la señalización paracrina. Por tanto, el valor de un sistema de co-cultivo con inserto radica en su capacidad para ofrecer una forma original de evaluar los cambios en los parámetros celulares mediados por factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula. Los sistemas de co-cultivo con inserto ofrecen varias ventajas frente a otras técnicas de co-cultivo, tales como: uno señalización direccional; dos polaridad celular conservada; y tres detección específica por poblaciones de los cambios celulares.Se detallará a continuación un protocolo específico para medir los efectos tóxicos de la citocina secretada por microglía N9 activada con lipopolisacárido sobre células neuronales PC12, proporcionando así una comprensión concreta del método de cultivo inserto en co-cultivo. Para comenzar, retire el envoltorio de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y de los insertos de politetrafluoroetileno poroso de 0,4 micrones. Luego, coloque los insertos en los pocillos vacíos de la placa de cultivo de tejidos sujetando el borde superior del inserto con pinzas estériles.A continuación, llene los insertos con medio N9 de rutina hasta que la membrana esté completamente cubierta. Incube los insertos durante al menos una hora, o durante la noche, para mejorar la capacidad de las células para adherirse. Una vez que los insertos estén listos, divida las microglías N9 al 80-90 % de confluencia utilizando medio N9 de rutina para obtener una suspensión celular que se usará para sembrar los insertos.A continuación, retire el medio de rutina de los insertos teniendo cuidado de no perforar la membrana con la punta de la micropipeta. Luego, siembre cada inserto a 60.000 células por centímetro cuadrado con 50 microlitros de la suspensión celular, o según el protocolo del fabricante del inserto. Al distribuir la suspensión celular, asegúrese de que permanezca homogénea invirtiendo ocasionalmente el tubo.Una vez sembrados todos los insertos, agite suavemente la placa de adelante hacia atrás y luego de izquierda a derecha para distribuir las células de manera uniforme. Evite realizar movimientos circulares, ya que esto hará que las células se acumulen en el centro del inserto. Posteriormente, incube la placa que contiene los insertos durante 24 horas antes de proceder con la activación de microglía N9.Comience pesando 10 miligramos de lipopolisacárido y guárdelos en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros para su uso posterior. Dado que el lipopolisacárido es un endotoxina proinflamatoria potente y requiere precauciones especiales de seguridad, se recomienda encarecidamente el uso de gafas, guantes y un respirador contra partículas. Posteriormente, prepare una serie de diluciones sucesivas de lipopolisacárido utilizando medio de tratamiento N9 tibio para obtener soluciones de trabajo de cuatro, dos y un microgramo por mililitro.Finalmente, retire la mitad del medio de cultivo de los insertos, teniendo cuidado de no perturbar las células. Luego, agregue suavemente 25 microlitros de las soluciones de trabajo de lipopolisacárido a los insertos para obtener diluciones finales de 2, 1 o 0,5 microgramos por mililitro. Incube la placa durante otras 24 horas antes de proceder con los experimentos de co-cultivo.Este paso requiere células PC12 sembradas a 30.000 células por centímetro cuadrado, interneuronas diferenciadas y microglía N9 activada con lipopolisacárido durante 24 horas, como se describió en la sección anterior. Comience retirando suavemente todo el medio de los insertos y reemplazándolo con 50 microlitros de medio de tratamiento N9 fresco y tibio. Esto es necesario para eliminar todos los rastros de lipopolisacárido, dejando únicamente microglía N9 activada.Tenga en cuenta que los insertos están sueltos en los pocillos de la placa de cultivo celular y pueden moverse si se presiona demasiado la punta contra la pared. Este paso debe realizarse un inserto a la vez para evitar que las células se sequen debido al contacto prolongado con el aire. Posteriormente, retire completamente el medio de las células neuronales PC12 y sustitúyalo con 0,6 mililitros de medio de tratamiento PC12 fresco y tibio.Hágalo uno a la vez, asegurándose de que las células no se sequen. Usando pinzas, sujete el borde superior de un inserto y colóquelo suavemente en el pocillo que contiene las células neuronales PC12. Una vez que todos los insertos hayan sido transferidos, verifique la presencia de burbujas de aire debajo de las membranas de los insertos.Las burbujas de aire impedirán cualquier intercambio a través de la membrana del inserto y pueden comprometer todo el experimento. Elimine las burbujas de aire levantando muy suavemente el inserto del pocillo con pinzas y colocándolo nuevamente en el medio de cultivo celular; esta acción debería eliminar la mayoría de las burbujas. Sin embargo, para las burbujas persistentes, intente sumergir suavemente el inserto de nuevo en el medio de cultivo celular en un ángulo.No golpee ni agite los insertos, ya que esto tiende a provocar la disociación de las células adherentes. Posteriormente, verifique los volúmenes de medio en los insertos y en los pocillos; el líquido en ambos compartimentos debe estar aproximadamente al mismo nivel. Una vez eliminadas todas las burbujas de aire y cuando los volúmenes de medio sean adecuados, incube la placa.Las células, el medio de cultivo o ambos, pueden entonces cosecharse para medir los efectos de la señalización paracrina entre la microglía N9 y las células neuronales PC12. Se realizaron ensayos inmunoenzimáticos en el medio de cultivo de la cámara inferior para cuantificar citocinas proinflamatorias. Los resultados muestran que 24 horas después del período de activación, la microglía N9 tratada con dos microgramos por mililitro de lipopolisacárido secretó significativamente más citocinas proinflamatorias, como interleucina-6, factor de necrosis tumoral alfa e interferón gamma, en comparación con la microglía no tratada.Además, las microglías N9 tratadas con un microgramo por mililitro de lipopolisacárido secretaron significativamente más interferón gamma tras 24 horas, mientras que se necesitaron 48 horas para observar un aumento significativo en los niveles del medio celular de interleucina-6 y factor de necrosis tumoral alfa. En contraste, la condición de 0,5 microgramos por mililitro no logró potenciar la expresión de citoquinas en las microglías N9 a las 24 y 48 horas posteriores al período de activación. Además, los datos a las 24 horas en el grupo de dos microgramos por mililitro sugieren que hubo microgliosis, un aumento en la población de microglías.Sin embargo, solo después de 48 horas el número celular aumentó significativamente. Finalmente, con el fin de evaluar las consecuencias de la activación microglial que conduce a una mayor secreción de citoquinas y microgliosis, se evaluó la citotoxicidad en las células neuronales PC12 en co-cultivo. Al medir los niveles de lactato deshidrogenasa extracelular, que es liberada por células dañadas, se encontró que las células neuronales PC12 presentaban mayor muerte celular a medida que aumentaba la concentración de lipopolisacárido en las células N9.Por tanto, estos resultados demuestran que los factores solubles secretados son capaces de atravesar la membrana de los insertos de co-cultivo y pueden causar daño citotóxico a las células neuronales PC12 en ausencia de contacto célula-célula. Aunque aquí se presentó solo un escenario de co-cultivo con insertos, se trata de una técnica muy flexible. En este protocolo, un tipo celular fue previamente tratado con la molécula responsable de reducir la secreción de factores solubles que, tras transferir el inserto al pocillo, afectan el comportamiento de un segundo tipo celular.Sin embargo, es posible incubar ambos tipos de células juntos en un sistema de co-cultivo para detectar el aumento de debilidad o resistencia de una o ambas poblaciones celulares frente a un tratamiento posterior. Esta técnica puede utilizar simplemente dos poblaciones de células incubadas juntas sin ningún tratamiento, para evaluar la señalización paracrina recíproca basal, por ejemplo. Además de tener valor en el campo de la neuroinflamación, como se demuestra aquí, los sistemas de co-cultivo con insertos pueden utilizarse para responder una amplia gama de preguntas relacionadas con la regénesis tumoral, la neurolatinización, la señalización de apoptosis o cualquier otro tema que incluya un componente de señalización paracrina.Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo los sistemas de co-cultivo con insertos pueden ofrecer una manera sencilla de evaluar los cambios mediados por factores solubles secretados. Y esperamos haberle convencido del alto potencial de estos sistemas de co-cultivo con insertos en el estudio de la señalización paracrina multicelular en ausencia de contacto célula-célula.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

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