Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de co-cultivo celular de dos tipos celulares utilizando insertos con una membrana permeable, lo que permite la difusión de factores solubles secretados. Esto se logra mediante una serie de pasos que colocan con precisión insertos que contienen un tipo celular en una placa de cultivo de tejidos con múltiples pocillos que contiene un segundo tipo celular. Comenzamos sembrando el tipo celular número uno en los insertos y el tipo celular número dos en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos.

El segundo paso consiste en transferir los insertos a los pocillos de la placa que contiene el tipo de célula número dos. En última instancia, esto permite cosechar los dos tipos celulares así como sus respectivos sobrenadantes. Por lo tanto, es posible evaluar el efecto de los factores solubles secretados sobre el tipo de célula de interés.

En organismos pluricelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas en diferentes tipos celulares como resultado de la señalización paracrina. Por tanto, el valor de un sistema de co-cultivo con inserto radica en su capacidad para ofrecer una forma original de evaluar los cambios en los parámetros celulares mediados por factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula. Los sistemas de co-cultivo con inserto ofrecen varias ventajas frente a otras técnicas de co-cultivo, tales como: uno señalización direccional; dos polaridad celular conservada; y tres detección específica por poblaciones de los cambios celulares.

Se detallará a continuación un protocolo específico para medir los efectos tóxicos de la citocina secretada por microglía N9 activada con lipopolisacárido sobre células neuronales PC12, proporcionando así una comprensión concreta del método de cultivo inserto en co-cultivo. Para comenzar, retire el envoltorio de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y de los insertos de politetrafluoroetileno poroso de 0,4 micrones. Luego, coloque los insertos en los pocillos vacíos de la placa de cultivo de tejidos sujetando el borde superior del inserto con pinzas estériles.

A continuación, llene los insertos con medio N9 de rutina hasta que la membrana esté completamente cubierta. Incube los insertos durante al menos una hora, o durante la noche, para mejorar la capacidad de las células para adherirse. Una vez que los insertos estén listos, divida las microglías N9 al 80-90 % de confluencia utilizando medio N9 de rutina para obtener una suspensión celular que se usará para sembrar los insertos.

A continuación, retire el medio de rutina de los insertos teniendo cuidado de no perforar la membrana con la punta de la micropipeta. Luego, siembre cada inserto a 60.000 células por centímetro cuadrado con 50 microlitros de la suspensión celular, o según el protocolo del fabricante del inserto. Al distribuir la suspensión celular, asegúrese de que permanezca homogénea invirtiendo ocasionalmente el tubo.

Una vez sembrados todos los insertos, agite suavemente la placa de adelante hacia atrás y luego de izquierda a derecha para distribuir las células de manera uniforme. Evite realizar movimientos circulares, ya que esto hará que las células se acumulen en el centro del inserto. Posteriormente, incube la placa que contiene los insertos durante 24 horas antes de proceder con la activación de microglía N9.

Comience pesando 10 miligramos de lipopolisacárido y guárdelos en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros para su uso posterior. Dado que el lipopolisacárido es un endotoxina proinflamatoria potente y requiere precauciones especiales de seguridad, se recomienda encarecidamente el uso de gafas, guantes y un respirador contra partículas. Posteriormente, prepare una serie de diluciones sucesivas de lipopolisacárido utilizando medio de tratamiento N9 tibio para obtener soluciones de trabajo de cuatro, dos y un microgramo por mililitro.

Finalmente, retire la mitad del medio de cultivo de los insertos, teniendo cuidado de no perturbar las células. Luego, agregue suavemente 25 microlitros de las soluciones de trabajo de lipopolisacárido a los insertos para obtener diluciones finales de 2, 1 o 0,5 microgramos por mililitro. Incube la placa durante otras 24 horas antes de proceder con los experimentos de co-cultivo.

Este paso requiere células PC12 sembradas a 30.000 células por centímetro cuadrado, interneuronas diferenciadas y microglía N9 activada con lipopolisacárido durante 24 horas, como se describió en la sección anterior. Comience retirando suavemente todo el medio de los insertos y reemplazándolo con 50 microlitros de medio de tratamiento N9 fresco y tibio. Esto es necesario para eliminar todos los rastros de lipopolisacárido, dejando únicamente microglía N9 activada.

Tenga en cuenta que los insertos están sueltos en los pocillos de la placa de cultivo celular y pueden moverse si se presiona demasiado la punta contra la pared. Este paso debe realizarse un inserto a la vez para evitar que las células se sequen debido al contacto prolongado con el aire. Posteriormente, retire completamente el medio de las células neuronales PC12 y sustitúyalo con 0,6 mililitros de medio de tratamiento PC12 fresco y tibio.

Hágalo uno a la vez, asegurándose de que las células no se sequen. Usando pinzas, sujete el borde superior de un inserto y colóquelo suavemente en el pocillo que contiene las células neuronales PC12. Una vez que todos los insertos hayan sido transferidos, verifique la presencia de burbujas de aire debajo de las membranas de los insertos.

Las burbujas de aire impedirán cualquier intercambio a través de la membrana del inserto y pueden comprometer todo el experimento. Elimine las burbujas de aire levantando muy suavemente el inserto del pocillo con pinzas y colocándolo nuevamente en el medio de cultivo celular; esta acción debería eliminar la mayoría de las burbujas. Sin embargo, para las burbujas persistentes, intente sumergir suavemente el inserto de nuevo en el medio de cultivo celular en un ángulo.

No golpee ni agite los insertos, ya que esto tiende a provocar la disociación de las células adherentes. Posteriormente, verifique los volúmenes de medio en los insertos y en los pocillos; el líquido en ambos compartimentos debe estar aproximadamente al mismo nivel. Una vez eliminadas todas las burbujas de aire y cuando los volúmenes de medio sean adecuados, incube la placa.

Las células, el medio de cultivo o ambos, pueden entonces cosecharse para medir los efectos de la señalización paracrina entre la microglía N9 y las células neuronales PC12. Se realizaron ensayos inmunoenzimáticos en el medio de cultivo de la cámara inferior para cuantificar citocinas proinflamatorias. Los resultados muestran que 24 horas después del período de activación, la microglía N9 tratada con dos microgramos por mililitro de lipopolisacárido secretó significativamente más citocinas proinflamatorias, como interleucina-6, factor de necrosis tumoral alfa e interferón gamma, en comparación con la microglía no tratada.

Además, las microglías N9 tratadas con un microgramo por mililitro de lipopolisacárido secretaron significativamente más interferón gamma tras 24 horas, mientras que se necesitaron 48 horas para observar un aumento significativo en los niveles del medio celular de interleucina-6 y factor de necrosis tumoral alfa. En contraste, la condición de 0,5 microgramos por mililitro no logró potenciar la expresión de citoquinas en las microglías N9 a las 24 y 48 horas posteriores al período de activación. Además, los datos a las 24 horas en el grupo de dos microgramos por mililitro sugieren que hubo microgliosis, un aumento en la población de microglías.

Sin embargo, solo después de 48 horas el número celular aumentó significativamente. Finalmente, con el fin de evaluar las consecuencias de la activación microglial que conduce a una mayor secreción de citoquinas y microgliosis, se evaluó la citotoxicidad en las células neuronales PC12 en co-cultivo. Al medir los niveles de lactato deshidrogenasa extracelular, que es liberada por células dañadas, se encontró que las células neuronales PC12 presentaban mayor muerte celular a medida que aumentaba la concentración de lipopolisacárido en las células N9.

Por tanto, estos resultados demuestran que los factores solubles secretados son capaces de atravesar la membrana de los insertos de co-cultivo y pueden causar daño citotóxico a las células neuronales PC12 en ausencia de contacto célula-célula. Aunque aquí se presentó solo un escenario de co-cultivo con insertos, se trata de una técnica muy flexible. En este protocolo, un tipo celular fue previamente tratado con la molécula responsable de reducir la secreción de factores solubles que, tras transferir el inserto al pocillo, afectan el comportamiento de un segundo tipo celular.

Sin embargo, es posible incubar ambos tipos de células juntos en un sistema de co-cultivo para detectar el aumento de debilidad o resistencia de una o ambas poblaciones celulares frente a un tratamiento posterior. Esta técnica puede utilizar simplemente dos poblaciones de células incubadas juntas sin ningún tratamiento, para evaluar la señalización paracrina recíproca basal, por ejemplo. Además de tener valor en el campo de la neuroinflamación, como se demuestra aquí, los sistemas de co-cultivo con insertos pueden utilizarse para responder una amplia gama de preguntas relacionadas con la regénesis tumoral, la neurolatinización, la señalización de apoptosis o cualquier otro tema que incluya un componente de señalización paracrina.

Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo los sistemas de co-cultivo con insertos pueden ofrecer una manera sencilla de evaluar los cambios mediados por factores solubles secretados. Y esperamos haberle convencido del alto potencial de estos sistemas de co-cultivo con insertos en el estudio de la señalización paracrina multicelular en ausencia de contacto célula-célula.