Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de cocultivo celular de dos tipos de células utilizando insertos con una membrana permeable, permitiendo así la difusión de los factores solubles secretados. Esto se logra con una serie de pasos que colocan finamente insertos que contienen un tipo de célula en una placa de cultivo de tejidos de múltiples pocillos que contiene un segundo tipo de célula. Comenzamos mi tipo de célula de siembra número uno en insertos, y la siembra del tipo de célula número dos en una placa de cultivo de tejidos de pocillos múltiples.

El segundo paso es transferir los insertos a los pocillos de la placa que contiene el tipo de celda número dos. En última instancia, esto da la capacidad de cosechar los dos tipos de células, así como los respectivos sobrenadantes. Por lo tanto, es posible evaluar el efecto de los factores solubles secretados sobre el tipo de célula de interés.

En los organismos pluricelulares secretados, los factores solubles provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Como tal, el valor de un sistema de cocultivo de insertos reside en su capacidad para ofrecer una forma original de evaluar los cambios de los parámetros celulares mediados por factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula. Los sistemas de cocultivo con insertos ofrecen varias ventajas sobre otras técnicas de cocultivo, tales como: uno por señalización direccional; dos polaridades de células conservadas; y tres detectores de cambios celulares específicos de la población.

A continuación se detallará un protocolo específico para medir los efectos tóxicos de las citocinas secretadas por la microglía N9 activada por lipopolisacáridos en las células neuronales PC12, proporcionando así una comprensión concreta de la metodología de cocultivo de insertos. Para comenzar, desenvuelva la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y los insertos de politetrafluoroetileno de 0,4 micras de su empaque. A continuación, coloque los insertos en los pocillos vacíos de la placa de cultivo de tejidos agarrando el borde superior del inserto con unas pinzas estériles.

A continuación, llene los insertos con medio N9 de rutina hasta que la membrana esté completamente cubierta. Incube los insertos durante al menos una hora, o toda la noche, para mejorar la capacidad de adhesión de las células. Una vez que los insertos estén listos, divida la microglía N9 a un 80 a 90% de confluencia utilizando un medio N9 de rutina para obtener una suspensión celular que se utilizará para sembrar los insertos.

A continuación, retire el medio de rutina de los insertos teniendo cuidado de no perforar la membrana con la punta de la micropipeta. A continuación, siembre cada inserto a 60.000 células por centímetro cuadrado con 50 microlitros de suspensión celular, o de acuerdo con el protocolo del fabricante del inserto. Mientras distribuye la suspensión celular, asegúrese de que permanezca homogénea invirtiendo ocasionalmente el tubo.

Cuando todos los insertos estén sembrados, balancee suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás, luego de izquierda a derecha, para distribuir las celdas de manera uniforme. Evite hacer movimientos circulares, ya que esto hará que las celdas se acumulen en el centro del inserto. Posteriormente, incubar la placa que contiene los insertos durante 24 horas antes de continuar con la activación de la microglía N9.

Comience pesando 10 miligramos de lipopolisacárido y guárdelo en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros para su uso posterior. Dado que el lipopolisacárido es una potente endotoxina proinflamatoria y requiere precauciones de seguridad particulares, se recomienda encarecidamente el uso de gafas, guantes y un respirador para partículas. A continuación, cree un conjunto de diluciones en serie de lipopolisacáridos utilizando un medio de tratamiento N9 caliente para obtener soluciones de trabajo de cuatro, dos y un microgramos por mililitro.

Finalmente, retire la mitad del medio de cultivo de los insertos, teniendo cuidado de no alterar las células. A continuación, añada suavemente 25 microlitros de las soluciones de trabajo de lipopolisacáridos a los insertos para obtener diluciones finales de dos, uno o 0,5 microgramos por mililitro. Incubar la placa durante otras 24 horas antes de continuar con los experimentos de cocultivo.

Este paso requiere células PC12 con placas de 30.000 células por centímetro cuadrado de interneuronas diferenciadas, y microglía N9 activada con lipopolisacárido durante 24 horas como se describe en la sección anterior. Comience retirando suavemente todo el medio de los insertos y reemplácelo con 50 microlitros de medio de tratamiento N9 fresco y tibio. Esto es necesario para eliminar todos los rastros de lipopolisacáridos, dejando solo la microglía N9 activada.

Tenga en cuenta que los insertos están sueltos en los pocillos de la placa de cultivo de tejidos y pueden moverse si la punta se presiona demasiado fuerte contra la pared. Este paso debe ejecutarse un inserto a la vez para evitar que las células se sequen debido al contacto prolongado con el aire. A continuación, retire por completo el medio celular neuronal PC12 y sustitúyalo por 0,6 mililitros de medio de tratamiento PC12 fresco y tibio.

Haga esto bien a la vez para asegurarse de que las células no se sequen. Con unas pinzas, agarre el borde superior de un inserto y colóquelo suavemente en el pocillo que contiene las células neuronales PC12. Cuando se transfieran todos los insertos, verifique la presencia de burbujas de aire debajo de las membranas de los insertos.

Las burbujas de aire impedirán cualquier intercambio a través de la membrana del inserto y pueden poner en peligro todo el experimento. Elimine las burbujas de aire levantando muy suavemente el inserto del pocillo con pinzas y volviéndolo a colocar en el medio de cultivo celular, esta acción debería eliminar la mayoría de las burbujas. Sin embargo, para las burbujas persistentes, intente sumergir suavemente el inserto en el medio de cultivo celular en ángulo.

No golpee ni revuelva los insertos, ya que esto tiende a causar la disociación de las células adherentes. Luego, verifique los volúmenes de medios tanto en los insertos como en los pocillos, el líquido en ambos compartimentos debe estar aproximadamente al mismo nivel. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas de aire y los volúmenes de medio sean adecuados, incube la placa.

A continuación, se pueden recolectar las células, el medio de cultivo o ambos, para medir los efectos de la señalización paracrina entre la microglía N9 y las células neuronales PC12. Se realizaron ensayos de inmunoabsorción enzimática en el medio de cultivo celular del compartimento inferior para cuantificar las citocinas proinflamatorias. Los resultados ilustran que 24 horas después del período de activación, la microglía N9 tratada con dos microgramos por mililitro de lipopolisacárido secretó significativamente más citocinas proinflamatorias, como interluken-6, factor de necrosis tumoral alfa e interferón gamma, en comparación con la microglía que no fue tratada.

Además, la microglía N9 tratada con un microgramo por mililitro de lipopolisacárido secretó deliberadamente más interferón gamma después de 24 horas, mientras que se necesitaron 48 horas para ver un aumento significativo en los niveles de interluken-6 y factor de necrosis tumoral alfa en el medio celular. Por el contrario, la condición de 0,5 microgramos por mililitro no mejoró la expresión de citocinas en la microglía N9 tanto a las 24 como a las 48 horas después del período de activación. Además, los datos a las 24 horas en el grupo de dos microgramos por mililitro sugieren que hubo microgliosis, un aumento en la población microglial.

Sin embargo, no fue hasta después de 48 horas cuando el número de teléfonos móviles aumentó significativamente. Por último, con el fin de evaluar las consecuencias de la activación microglial que conduce a una mayor secreción de citocinas y microgliosos, se evaluó la citotoxicidad en las células neuronales PC12 cocultivadas. Al medir los niveles de lactato deshidrogenasa extracelular, que es liberada por las células dañadas, se encontró que las células neuronales PC12 exhibían más muerte celular a medida que aumentaba la concentración de lipopolisacárido en las células N9.

Como tal, estos resultados muestran que los factores solubles secretados son capaces de atravesar la membrana de los insertos de cocultivo y pueden causar daño citotóxico a las células neuronales PC12 en ausencia de contacto célula-célula. Si bien aquí solo se presentó un escenario de cocultivo de insertos, es una técnica muy flexible. En este protocolo, un tipo de célula fue pretratada con la molécula responsable de reducir la secreción de factores solubles que, al transferir el inserto al pocillo, afectan el comportamiento del segundo tipo de célula.

Sin embargo, es posible incubar ambos tipos de células juntas en un sistema de cocultivo para detectar el aumento de la debilidad o resistencia de una o ambas poblaciones celulares a un tratamiento posterior. Esta técnica puede simplemente hacer uso de dos poblaciones de células incubadas juntas sin ningún tratamiento, para evaluar la señalización recíproca paracrina basal, por ejemplo. Además de ser valorados en el campo de la neuroinflamación, como se ha demostrado aquí, los sistemas de cocultivo de insertos se pueden utilizar para responder a una amplia gama de preguntas relacionadas con la regénesis tumoral, el neurolatirisma, la señalización de la apoptosis o cualquier otro tema con un componente de señalización paracrina.

Después de ver este vídeo, ahora debería tener una buena comprensión de cómo los sistemas de cocultivo de insertos pueden ofrecer una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por el factor soluble secretado. Y esperamos haberles convencido del alto potencial de estos sistemas de cocultivo en el estudio de la señalización paracrina multicelular en ausencia de contacto célula-célula.