Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

El objetivo general de este protocolo histológico y de imagen es presentar un sistema robusto que preserve la antigenicidad del epitol y la integridad estructural de la piel, lo que permite la plena explotación de las modalidades de imagen confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las que es necesario examinar la naturaleza de cualquier tipo de célula dentro de una arquitectura compleja de tejido tridimensional. La principal ventaja de esta técnica en comparación con las técnicas histológicas estándar es que es robusta y fácil de realizar.

Además, el protocolo complementa perfectamente el análisis tridimensional en microscopía confocal. Comience recortando la piel extraída de la región medial dorsal de un ratón en pedazos rectangulares. Cada pieza debe tener el tamaño adecuado para caber en la parte inferior de un criomolde.

Aquí se muestra un área de un centímetro cuadrado de piel dorsal que cabe en un criomold de 22 milímetros por 30 milímetros por 20 milímetros. Después de la fijación, empuje la piel lavada hasta el fondo del molde lleno de OCT para que quede al ras con el fondo. Marque la orientación del folículo piloso en el criomolde, ya que esto determina la orientación del corte crioestadístico.

Transfiera los bloques criogénicos a una placa de metal en un congelador de menos 80 grados para evitar que el tejido flote y se disloque. Supervise el proceso de congelación para mantener la orientación de la piel en la parte inferior del criomolde, ya que las burbujas de aire invisibles pueden hacer que la piel suba a la superficie del criomolde. Comience fijando un criobloque congelado a la etapa de un criostato con la orientación del folículo piloso, como se indica en el criomolde a lo largo del plano de corte.

El ajuste adecuado de la orientación exacta del folículo piloso en el criostato es fundamental, ya que este paso determina el plano de la sección que genera cortes de piel con toda la longitud de los folículos pilosos intacta. Utilice el criostato para cortar una sección de 100 micras. Sujete la OCT alrededor de la pieza de piel incrustada con pinzas y transfiera la sección fuera del criostato al cultivo de 100 milímetros lleno de PBS.

A temperatura ambiente, el PBS disolverá la OCT, dejando rodajas de piel que son fáciles de manipular con fórceps. Después de seccionar, use pinzas para transferir las secciones de piel flotantes al pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga 2,5 mililitros de PBS. Comience el marcaje inmunofluorescente agregando primero 500 microlitros de tampón PB a los tubos de microcentrífuga marcados de 1,5 mililitros.

Use con cuidado pinzas para transferir las rodajas de piel de la placa de 12 pocillos a los tubos para bloquearlas. Asegúrese de que todas las rodajas de piel estén completamente sumergidas. Coloque los tubos de la microcentrífuga en un balancín de sierra de sierra a 10 oscilaciones por minuto o menos, durante una hora a temperatura ambiente.

Etiquete tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros por separado para cada corte de piel y agregue 500 microlitros de tampón PB que contenga la cantidad adecuada de anticuerpo primario. Después de una hora de bloqueo, transfiera las rodajas de piel a los tubos recién preparados que contienen los anticuerpos. Incubar las rodajas a cuatro grados centígrados durante la noche a baja velocidad en un balancín.

Al día siguiente, transfiera las rodajas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de PBS y lave durante una hora a temperatura ambiente en un balancín. A continuación, transfiera las rodajas a tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de tampón PB con la concentración adecuada de anticuerpos secundarios y DAPI. Incubar a temperatura ambiente durante una hora con balanceo, si lo desea, las muestras se pueden almacenar hasta cuatro días a cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento.

Antes de la toma de imágenes, transfiera las rodajas de piel a tubos de microcentrífuga separados que contengan 500 microlitros de PBS para lavar los anticuerpos secundarios y DAPI. A continuación, coloque un cubreobjetos de 22 mililitros por 50 mililitros sobre un fondo oscuro bajo un microscopio de disección. A continuación, utilice una pipeta de 1.000 microlitros con el extremo de la punta cortado, para añadir una gota de glicerol al 100% en el cubreobjetos.

Transfiera la rebanada de piel del tubo de microcentrífuga a la gota de glicerol. Luego, mientras mira a través del microscopio de disección, use pinzas puntiagudas para desenrollar con cuidado las rodajas de piel que están enroscadas persuadiéndolas para que vuelvan a su forma natural mientras flotan en glicerol. No fuerce el enderezamiento antinatural de la rebanada, ya que esto podría causar daños en el tejido.

Una vez que toda la longitud de la sección esté correctamente orientada y aplanada en el cubreobjetos. Monte el tejido en un portaobjetos de microscopio normal, este paso enderezará aún más la rodaja de piel. Tome una imagen de las secciones de piel montadas en glicerol dentro de los próximos dos días.

Esta imagen muestra una criosección de piel de 10 micras de espesor obtenida clásicamente y marcada con integrina alfa seis e integrina alfa ocho, para visualizar el compartimento epidérmico y los músculos pili directores respectivamente. Esta sección transversal de tejido 3D de 100 micras de espesor se etiquetó de la misma manera. La imagen que se muestra son las proyecciones máximas de una pila z grande.

Los detalles de ambas imágenes se comparan uno al lado del otro aquí, en las secciones congeladas clásicas, la mayoría de los folículos pilosos visualizados con integrina alfa seis no se seccionaron a lo largo de toda la longitud, generando folículos pilosos predominantemente incompletos por sección, en comparación con los montajes enteros horizontales. Se cuantificaron los folículos pilosos intactos y los músculos arrector pili intactos tanto en la sección clásica como en la horizontal. Se cuantificó una sección para la replicación biológica, como se ve aquí, toda la sección de la montura tiene una mayor proporción de folículos intactos y músculos arrector pili.

Una vez dominada, esta técnica de crioseccionado se puede realizar a velocidades de más de 15 secciones por minuto, logrando muestras perfectamente orientadas si el montaje se realizó correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar y analizar secciones transversales de tejido grueso en un entorno tridimensional.