Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis electrofisiológico a nivel de célula individual en una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido del órgano vomeronasal de ratón. Este método puede ayudar a esclarecer preguntas clave en el campo de la quimiosensación, como los mecanismos de detección de señales químicas. La principal ventaja de esta técnica es que, al realizar registros en neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido, estas células pueden estudiarse en su entorno nativo.

Para comenzar este procedimiento, tras sacrificar al animal, retire la mandíbula inferior insertando un par de tijeras quirúrgicas grandes a través de la cavidad bucal y corte los huesos mandibulares y los músculos de cada lado por separado. A continuación, retire la piel del maxilar superior y alrededor de la punta de la nariz con pinzas medianas para obtener un mejor acceso a los incisivos. Luego, use las tijeras óseas para cortar la mayor parte de los incisivos en un ángulo de 45 grados en dirección rostral, con el fin de facilitar la extracción de la cápsula del órgano vomeronasal (VNO) desde la cavidad nasal.

No corte la raíz del diente para evitar dañar la punta de la cápsula del órgano vomeronasal (VNO). Después, sujete el paladar duro en su parte rostral con pinzas medianas y retire cuidadosamente en una sola pieza con un ángulo plano. Enjuague repetidamente la cavidad nasal con la solución S2 fría con hielo. Luego, use tijeras microquirúrgicas de resorte para cortar la efusión ósea entre la punta del hueso vomer y la mandíbula.

Introduzca las puntas de la tijera con la parte curva orientada lejos del órgano vomeronasal. Y corte cuidadosamente el hueso en pequeños pasos tanto en el lado izquierdo como en el derecho, en la región lateral a la cápsula del órgano vomeronasal. Para extraer la cápsula del órgano vomeronasal, corte a través del hueso vomer en la parte caudal y levante cuidadosamente el hueso vomer fuera de la cavidad nasal utilizando pinzas medianas.

Transfiera inmediatamente el órgano vomeronasal (VNO) a una pequeña placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico sobre una bolsa de gel frío, donde deben realizarse los pasos restantes de la disección. A continuación, enjuague el VNO con una pequeña cantidad de S2 frío para evitar que el tejido se seque. Luego, separe las cápsulas cartilaginosas que contienen los tejidos blandos del VNO agarrando la parte posterior del hueso vomer con pinzas medianas.

Para ello, coloque la cápsula en vista dorsal de modo que se haga visible una separación entre ambos VNO. Utilice la punta de una pinza fina para separar ambas cápsulas cartilaginosas del VNO del hueso central, manteniendo al mismo tiempo el hueso vomer sujeto en la parte posterior. Asegúrese de eliminar la pared cartilaginosa medial que previamente estaba unida al hueso vomer.

Al retirar el cartílago alrededor del órgano vomeronasal, utilice pinzas solo en el borde de la cápsula cartilaginosa. Tenga mucho cuidado de no dañar el delicado epitelio sensorial. Para eliminar el cartílago restante, gire el órgano vomeronasal con su lado lateral curvo hacia el fondo del recipiente y sujete firmemente el cartílago en un lado utilizando pinzas.

Luego, mueva cuidadosamente la segunda pinza fina desde el lado posterior con un ángulo muy bajo entre el cartílago y el órgano vomeronasal (VNO) para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago. Para evitar dañar el epitelio sensorial, desprenda lentamente el VNO del cartílago sujetándolo por su extremo caudal. Una vez que el VNO se haya separado de la cápsula, retire todas las partes pequeñas restantes de cartílago, ya que cualquier fragmento residual de cartílago despegará el tejido del agarosa circundante durante el proceso de corte en láminas.

A continuación, coloque una pequeña gota de S2 helado sobre el primer VNO diseccionado para prevenir daños en el tejido. Para incluir los VNO, llene ambos pequeños recipientes de Petri hasta el borde con S3 fundido. Después de eso, sumerja cada VNO en agarosa y muévalo horizontalmente hacia adelante y hacia atrás varias veces para eliminar la película de solución extracelular, así como cualquier burbuja de aire de su superficie. Coloque el VNO verticalmente, con la punta rostral orientada hacia el fondo del recipiente.

Posteriormente, coloque ambos platos sobre una bolsa de hielo en gel y espere hasta que el agarosa se haya solidificado. No cambie la orientación del órgano vomeronasal una vez que el agarosa haya comenzado a solidificarse, ya que esto despegaría el tejido del agarosa circundante. En este procedimiento, utilice una espátula pequeña para retirar el bloque de agarosa del plato pequeño hacia la tapa de una placa de Petri grande, y déle la vuelta al agarosa boca abajo, dejando la punta rostral del órgano vomeronasal orientada hacia arriba.

A continuación, corte el bloque en forma de pirámide utilizando un escalpelo quirúrgico, teniendo cuidado de no dañar el tejido embebido. Luego, use pegamento instantáneo para fijar el bloque con forma de pirámide al centro de la placa del espécimen del vibrátomo. Espere aproximadamente un minuto para que el pegamento se seque completamente.

Corte el espécimen en secciones de 150 a 200 micrómetros de grosor. Inspeccione brevemente la morfología de las secciones bajo el microscopio estereoscópico. A continuación, transfiera todas las secciones a la cámara oxigenada hasta su uso.

En este paso, transfiera una sección del órgano vomeronasal (VNO) a la cámara de imagen y fije la posición de la sección utilizando un anclaje de acero inoxidable con fibras sintéticas de un milímetro de grosor. No cubra la sección de tejido con ninguno de los hilos de fibra sintética. A continuación, transfiera la cámara de imagen al sistema de registro y suprafunda continuamente la sección con S2 oxigenado a temperatura ambiente.

Ajuste la micropipeta de succión a la superficie de la solución para crear un intercambio constante de la solución de baño. Luego, coloque el lápiz de perfusión multibarro de ocho en uno por encima y cerca de la parte no sensorial del corte del órgano vomeronasal que contiene el vaso sanguíneo. Posteriormente, conecte el electrodo de referencia y la solución de baño utilizando el puente de agar en forma de L lleno con cloruro de potasio 150 milimolar.

Posteriormente, llene la pipeta de registro con la solución para pipeta S4. Coloque la pipeta sobre el electrodo recubierto de cloruro de plata conectado al cabezal amplificador sin eliminar el recubrimiento y sujétela firmemente. A continuación, aplique una ligera presión positiva a la pipeta de registro antes de introducirla en el baño. Supervise la pipeta y asegúrese de que su resistencia esté entre cuatro megaohmios y 10 megaohmios.

Visualice la sección del órgano vomeronasal con una cámara CCD utilizando DIC optimizado para infrarrojo, e identifique las células que expresan FPR-rs3 i-Venus o neuronas etiquetadas de manera similar mediante iluminación de fluorescencia y un cubo de filtros adecuado. Acérquese al cuerpo celular utilizando las ruedas manuales para obtener la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, una pequeña depresión en la membrana del soma celular se vuelve visible una vez que la punta de la pipeta está en proximidad cercana.

Luego, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para succionar la membrana celular con el fin de obtener un sello de alta resistencia de uno a 20 gigaohmios. Posteriormente, aplique una succión breve y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de célula entera. En esta figura, una imagen confocal de un corte coronal de tejido del órgano vomeronasal muestra la distribución de neuronas fluorescentes positivas para FPR-rs3 Tau Venus en el epitelio sensorial vomeronasal.

Las neuronas positivas para FPR-rs3 Tau Venus exhiben una única dendrita apical que termina en una estructura en forma de nódulo en el borde luminar. Y aquí se muestran grabaciones mediante parche en todo el célula realizadas en el soma de la VSN. A continuación se presentan trazas representativas de grabaciones mediante parche en todo el célula de una corriente de sodio rápida y sensible a TTX, y de VSNs positivas para FPR-rs3.

Los registros con escalón de voltaje bajo condiciones de control revelan una corriente interna rápida y transitoria dependiente del voltaje. El tratamiento con TTX a una concentración de un micromolar reduce fuertemente la corriente. Y el trazo restado digitalmente que se muestra aquí revela la corriente de sodio sensible a TTX y regulada por voltaje.

Los trazos representativos del clampaje de corriente muestran despolarización e hiperpolarización, así como trenes de potenciales de acción generados mediante la inyección escalonada de corrientes positivas y negativas. Una vez dominado, todo el proceso de disección y corte de tejido puede realizarse en aproximadamente una hora para ambos VNO. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como grabaciones extracelulares con parche suelto o imágenes de calcio, con el fin de aumentar el rendimiento al analizar poblaciones más grandes de neuronas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes agudos de tejido del órgano vomeronasal de la boca y cómo realizar grabaciones electrofisiológicas unitarias de neuronas sensoriales vomeronasales.