Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis electrofisiológico de una sola célula de una población definida de neuronas sensoriales en cortes de tejido agudo del órgano vomeronasal del ratón. Este método puede ayudar a dilucidar preguntas clave en el campo de la quimiosensación, como los mecanismos de detección química see-no. La principal ventaja de esta técnica es que, mediante el registro de las neuronas sensoriales en cortes de tejido agudo, estas células pueden ser investigadas en su entorno nativo.

Para comenzar este procedimiento, después de sacrificar al animal, retire su mandíbula inferior, insertando un par de tijeras quirúrgicas grandes a través de la cavidad bucal, y corte los huesos de la mandíbula y el músculo de cada lado por separado. A continuación, retire la piel del maxilar superior y alrededor de la punta de la nariz con pinzas medianas, para obtener un mejor acceso a los incisivos. A continuación, utilice las tijeras para huesos para cortar la parte más grande de los incisivos en un ángulo de 45 grados en la dirección rostral para facilitar la extracción de la cápsula de VNO de la cavidad nasal.

No corte la raíz del diente para evitar daños en la punta de la cápsula de VNO. Después de eso, agarre el paladar superior rígido en su parte rostral con pinzas medianas y despegue con cuidado una pieza en un ángulo plano. Enjuague repetidamente la cavidad naval con una solución helada S2. Luego use tijeras de micro resorte para cortar el derrame óseo entre la punta del hueso vómer y la mandíbula.

Inserte las puntas de las tijeras con la parte curva apuntando en dirección opuesta al VNO. Y corte cuidadosamente el hueso en pequeños pasos tanto en el lado izquierdo como en el derecho, lateral a la cápsula VNO. Para extraer la cápsula de VNO, corte a través del hueso vómer en la parte caudal y levante con cuidado el hueso vómer fuera de la cavidad nasal con pinzas medianas.

Transfiera inmediatamente el VNO a una pequeña placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico en una bolsa de gel de hielo, donde se deben realizar los pasos restantes de la disección. A continuación, enjuague el VNO con una pequeña cantidad de S2 helado, para evitar que el tejido se seque. A continuación, separe las cápsulas cartilaginosas que contienen los tejidos blandos VNO agarrando la parte posterior del hueso vómer con pinzas medianas.

Para ello, coloque la cápsula en una vista dorsal de modo que se haga visible una división entre ambos VNO. Utilice la punta de unas pinzas finas para separar ambas cápsulas de cartílago VNO del hueso central, manteniendo el hueso vómer inmovilizado en la parte posterior. Asegúrese de que se haya extirpado la pared del cartílago medial que estaba previamente unida al hueso del vómer.

Al extraer el cartílago alrededor del VNO, use pinzas solo en el borde de la cápsula de cartílago. Y tenga mucho cuidado de no dañar el delicado epitelio sensorial. Para eliminar el cartílago restante, gire el VNO con su lado lateral curvo hacia el fondo del plato y sujete firmemente el cartílago de un lado con pinzas.

A continuación, mueva con cuidado la segunda pinza fina desde la parte posterior en un ángulo muy plano entre el cartílago y el VNO para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago. Para evitar dañar el epitelio sensorial, retire lentamente el VNO del cartílago sosteniéndolo en su punta caudal. Una vez que el VNO se haya separado de la cápsula, retire todas las partes pequeñas de cartílago restantes, ya que las piezas restantes de cartílago desprenderán el tejido de la agarosa circundante durante el proceso de corte.

A continuación, coloque una pequeña gota de S2 helado en el primer VNO diseccionado para evitar daños en los tejidos. Para incrustar los VNO, llene ambas placas de Petri pequeñas hasta el borde con S3 derretido. Después de eso, sumerja cada VNO en agarosa y muévalo horizontalmente hacia adelante y hacia atrás varias veces para eliminar la película de solución extracelular, así como las burbujas de aire de su superficie. Coloque el VNO verticalmente, con la punta rostral hacia el fondo del plato.

Posteriormente, coloque ambos platos en una bolsa de hielo en gel y espere hasta que la agarosa se haya solidificado. No cambies la orientación del VNO una vez que la agarosa haya comenzado a solidificarse, ya que esto desprenderá el tejido de la agarosa circundante. En este procedimiento, use una espátula pequeña para quitar el bloque de agarosa del plato pequeño y colóquelo en la tapa de una placa de Petri grande y voltee la agarosa al revés, dejando la punta rostral del VNO hacia arriba.

A continuación, corte el bloque en forma piramidal con un bisturí quirúrgico y tenga cuidado de no dañar el tejido incrustado. Luego, use superpegamento para fijar el bloque en forma de pirámide al centro de la placa de muestra del vibratomo. Y espera aproximadamente un minuto para que el pegamento se seque por completo.

Corta la muestra en secciones de 150 a 200 micrómetros de grosor. Inspeccione brevemente la morfología del corte bajo el microscopio de disección. A continuación, transfiera todas las rodajas a la cámara de oxigenación hasta su uso.

En este paso, transfiera un corte VNO a la cámara de imágenes y fije la posición del corte con un anclaje de acero inoxidable cableado con fibras sintéticas de espesor de milímetro de punto uno. No cubra la rebanada de pañuelo con ninguno de los hilos de fibra sintética. A continuación, transfiera la cámara de imagen a la configuración de grabación y superfusione continuamente el corte con S2 oxigenado a temperatura ambiente.

Ajuste el capilar de succión a la superficie de la solución para crear un intercambio constante de solución de baño. A continuación, ajuste el lápiz de profusión de barriles múltiples ocho en uno por encima y cerca de la parte no sensorial del corte de VNO que contiene el vaso sanguíneo. A continuación, conecte el electrodo de referencia y la solución de baño utilizando el puente de agar en forma de L lleno de cloruro de potasio de 150 milimolares.

A continuación, llene la pipeta de parche con la solución de pipeta S4. Monte la pipeta sobre el electrodo recubierto de cloruro de plata conectado a la platina principal sin raspar el recubrimiento y fíjela firmemente. A continuación, aplique una ligera presión positiva a la pipeta de parche antes de entrar en el baño. Controle la pipeta y asegúrese de que esté entre cuatro megaohmios y 10 megaohmios.

Visualice el corte VNO con una cámara CCD que utilice DIC optimizado para infrarrojos, e identifique las células que expresan i-Venus FPR-rs3 o las neuronas marcadas de forma similar mediante iluminación de fluorescencia y un cubo de filtro adecuado. Acérquese al cuerpo de la célula con volantes para obtener la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, se hace visible una pequeña abolladura en la membrana del soma celular una vez que la punta de la pipeta está muy cerca.

A continuación, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para aspirar la membrana celular con el fin de obtener un sello de alta resistencia de uno a 20 gigaohmios. Posteriormente, aplique una succión corta y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración celular completa. En esta figura, una imagen confocal de un corte de tejido VNO coronal muestra la distribución de neuronas fluorescentes FPR-rs3 Tau Venus positivas en el epitelio sensorial vomeronasal.

Las neuronas positivas FPR-rs3 Tau Venus exhiben una sola dendrita apical que termina en una estructura similar a una perilla en el borde luminal. Y aquí se muestran las grabaciones completas de la pinza del parche celular realizadas desde el soma de VSN. Aquí están las trazas representativas de las grabaciones de abrazaderas de parche al por mayor de una corriente de sodio de activación rápida sensible a TTX y VSN positivas FPR-rs3.

Los registros de pasos de voltaje en condiciones de control revelan una corriente entrante rápida y transitoria dependiente del voltaje. El tratamiento con TTX en un micromolar disminuye fuertemente la corriente. Y la traza sustraída digitalmente que se muestra aquí revela la corriente de sodio dependiente de voltaje sensible TTX.

Las trazas representativas de la pinza amperimétrica muestran la despolarización y la hiperpolarización y los trenes de potenciales de acción generados tras la inyección de corriente positiva y negativa por pasos. Una vez dominado, todo el proceso de disección y corte de tejido se puede realizar en aproximadamente una hora para ambos VNO. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como registros de parches sueltos extracelulares o imágenes de calcio para aumentar el rendimiento al analizar poblaciones más grandes de neuronas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer cortes agudos de tejido a partir del órgano vomeronasal bucal y cómo realizar registros electrofisiológicos de células individuales a partir de neuronas sensoriales vomeronasales.