Name: Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende a realizar análisis electrofisiológico de neuronas sensoriales en rebanadas agudas del órgano vomeronasal de ratón. Este método permite estudiar la quimiosensación en el entorno nativo celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Ivan Rodriguez y Benoit von der Weid por generar la línea de ratones FPR-rs3-i-venus, sus críticas constructivas y sus fructíferas discusiones. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Volkswagen (I/83533), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) y por la Iniciativa de Excelencia de los gobiernos federal y estatal alemán. MS es profesor Lichtenberg de la Fundación Volkswagen.

Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con la legislación local y de la Unión Europea sobre la protección de los animales utilizados con fines experimentales (Directiva 86/609 / CEE) y con las recomendaciones formuladas por la Federación de Asociaciones Europeas de Laboratorio de Ciencia Animal (FELASA). Ambos ratones C57BL / 6 y ratones Fpr-RS3-i-Venus fueron alojados en grupos de ambos sexos a temperatura ambiente en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con comida y agua ad libitum. Para los experimentos se utilizaron los adultos jóvenes (6-20 semanas) de ambos sexos. No se observaron diferencias obvias dependiente de género. 1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar extracelular solución S 1: 4- (2-hidroxi-etil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) tamponada solución extracelular que contiene (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado con NaOH); osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa). </li><li> preparar extracellular solución S 2: oxigenada Carbogen (95% O 2, 5% de CO 2) solución extracelular que contiene (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 CaCl 2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa). </li><li> Preparar la solución de agarosa al 4% temperatura de gelificación baja (S 3) para la incrustación de tejidos: 4% de agarosa de baja temperatura de gelificación. Disolver 2 g de agarosa de baja gelificación en 50 ml de S 1 en una botella de vidrio de laboratorio 100 ml junto con un agitador magnético. Para fundir la agarosa, poner la botella en un baño de agua (con la tapa no herméticamente cerrado) a 70 ° C durante aproximadamente 20 min o hasta que la solución se vuelve transparente mientras se agita. Enfriar y mantener agarosa fundida en un segundo baño de agua a 42 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Preparar intracelular solución S 4: solución de la pipeta contenía (en mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl 2 (libre de Ca 2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajustado con KOH); osmolaridad = 290 mOsm. </li><li> Modificar / ajustar la composición de S 1, S 2 y S 4 de acuerdo con el diseño experimental individual (por ejemplo, bloqueadores farmacológicos para aislar ciertos tipos de corrientes activados por voltaje). </li></ol> 2. Preparación del área de trabajo <ol><li> Llenar la oxigenación de la cámara de corte almacenar con S 2 al menos 30 min antes de la disección, el lugar en el hielo para el ajuste de la temperatura y el pH y la solución de compuesto oxigenado continuamente. </li><li> Llenar el depósito de superfusión rebanada a la configuración de la grabación con S 2 y oxigenar continuamente. </li><li> Antes de la disección, llenar vibratome cámara con S 2 y organizar hielo picado alrededor de la cámara. Como alternativa, transferir la solución oxigenada repuesto de hielo frío de la oxigenación de cámara en la cámara de vibratome y mantener la oxigenación de forma continua. </li><li> Organizar las herramientas quirúrgicas y consumibles. </li><li> Coloque paquete de gel de hielo bajo la disecciónmicroscopio, cubrir con una toalla de papel para evitar que el tejido VNO se congele al fondo del plato. </li><li> hoja de afeitar limpia por aclarado brevemente en 70% de etanol y agua destilada y montar a vibratome. Reemplazar para cada sesión de rebanar. </li></ol> 3. VNO disección e incrustación <ol><li> El sacrificio de animales mediante una breve exposición a CO 2 y decapitar utilizando tijeras quirúrgicas agudas. Nota: Como el tiempo de sacrificar el animal de poner la cápsula VNO en hielo es crítica, minimizar el tiempo a menos de 2 min. Para mantener la viabilidad del tejido, incrustar tanto completamente disecado VNOs en agarosa en menos de 30 min. </li><li> Retire la mandíbula inferior con grandes tijeras quirúrgicas. Entrar a través de la cavidad bucal y cortar los huesos y los músculos de la mandíbula cada lado por separado. </li><li> Coloque la parte restante de la cabeza hacia abajo en la gran placa de Petri. </li><li> Aparte la piel de la mandíbula superior y alrededor de la punta de la nariz con fórceps medio para obtener un mejor acceso a laincisivos. </li><li> Use las tijeras para cortar hueso la mayor parte de los incisivos en un ángulo de 45 ° ~ en la dirección rostral (Figura 1A). Esto facilitará la eliminación de la cápsula VNO de la cavidad nasal. Nota: No corte a la raíz del diente para evitar daños en la punta de la cápsula VNO. </li><li> Coge el paladar superior rígida en su parte rostral con fórceps medio y con cuidado la cáscara de nuevo en una sola pieza en un ángulo plano (Figura 1B). Nota: En repetidas ocasiones enjuague con helado de S 2. </li><li> Con unas tijeras micro resorte para cortar la fusión ósea entre la punta del hueso vómer y la mandíbula. Inserte las puntas de las tijeras con la parte curva de la punta apuntando hacia fuera lejos del VNO y cuidadosamente cortar el hueso en pequeños pasos tanto de izquierda y lateral derecha de la cápsula VNO. </li><li> Para quitar la cápsula VNO, utilizar tijeras micro resorte para cortar a través del hueso vómer en la parte caudal y levante con cuidado el hueso vómer fuera de la ncavidad ASAL utilizando pinzas medianas. Inmediatamente transferir el VNO a una pequeña placa de Petri con un microscopio estéreo en un paquete de gel de hielo donde se llevarán a cabo los pasos restantes de la disección. </li><li> Enjuague el VNO en una pequeña cantidad de helado de S 2 para evitar que el tejido de la desecación. </li><li> Se separan las cápsulas cartilaginosos que contienen los tejidos blandos VNO agarrando la parte posterior del hueso vómer con fórceps medianos. Coloque la cápsula para una vista dorsal de modo que una división entre ambas VNOs se hace visible (Figura 1D i). </li><li> Use la punta de unas pinzas finas para separar tanto el cartílago cápsulas VNO de la espina central, manteniendo el hueso vómer inmovilizado en la parte trasera. Nota: El uso de fórceps sólo en el borde de la cápsula de cartílago y tener mucho cuidado de no perforar a través del cartílago como el epitelio sensorial delicada se daña fácilmente. </li><li> Una vez que los dos están separados VNOs, empezar a eliminar el cartílago encapsular los abetost VNO. </li><li> Agarrar el borde superior de la cápsula con una pinza fina y dividir distancia de la pared del cartílago conectado previamente al hueso vómer (cara medial). </li><li> Para eliminar restante cartílago gire el VNO con su lado lateral curvada a la parte inferior del plato y de forma segura precisar el cartílago en un lado el uso de fórceps. Cuidadosamente mueva el segundo pinzas finas de la parte de atrás en un ángulo muy plano entre el cartílago y el VNO para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago. </li><li> lentamente la cáscara del OVN del cartílago sosteniéndolo en su extremo caudal, para no dañar el epitelio sensorial. </li><li> Una vez que el VNO se apalanca de la cápsula, asegúrese de eliminar todas las pequeñas piezas de cartílago que quedan como los trozos de cartílago se separe el tejido circundante de agarosa durante el proceso de corte. </li><li> Colocar una pequeña gota de helado de S 2 en la primera VNO diseccionados para prevenir el daño tisular. Un vaso sanguíneo grande en el lado lateral Will se hace visible que indica que el órgano está intacta y no se groseramente dañado durante la disección (Figura 2A ii). En caso de que el vaso sanguíneo se daño, todavía valdrá la pena continuar con cortar el OVN, siempre y cuando la morfología general no se vio afectada claramente. </li><li> Inmediatamente diseccionar el segundo VNO. </li><li> Para incrustar el OVN, llenar los dos pequeñas placas de Petri hasta el borde de S derretida 3 (almacenado en baño de agua a 42 ° C; véase 1.3). </li><li> Mantenga el VNO en el extremo caudal más amplio con unas pinzas finas para evitar daños en el epitelio sensorial. </li><li> Sumergir el VNO en la agarosa y moverlo horizontalmente hacia atrás y adelante varias veces para eliminar la película de la solución extracelular, así como las burbujas de aire de su superficie. </li><li> Coloque el VNO en posición vertical con la punta caudal hacia el fondo del plato. En lugar de pellizcar el OVN con las pinzas directamente, ajustar la orientación moviendo la punta fórceps en estrecha proximity al VNO. Nota: Orientación durante la incrustación es crucial ya que determina plano de corte y la accesibilidad a las neuronas sensoriales durante el experimento. </li><li> Colocar platos en bolsa de hielo en gel de agarosa y espere hasta que se haya solidificado. Nota: No cambie la orientación VNO una vez que la agarosa ha comenzado la solidificación ya que esto separar el tejido circundante de la agarosa. </li></ol> 4. coronal del tejido VNO rebanar <ol><li> Use pequeña espátula para quitar el bloque de agarosa del plato pequeño en la tapa de una gran placa de Petri, darle la vuelta al revés de agarosa dejando la punta caudal del VNO hacia arriba. </li><li> Cortar el bloque en forma de pirámide con un bisturí quirúrgico (3-4 mm en la punta, de 8-10 mm en la parte inferior). Tenga cuidado de no dañar el tejido embebido. </li><li> Utilice pegamento para fijar el bloque en forma de pirámide al centro de la placa de muestras vibratome y esperar ~ 1 minuto para que el pegamento se seque por completo. </li><li> La transferencia de la placa de la muestra a la corte en rodajas cHamber y preparar la segunda VNO, en consecuencia. Mantenga la placa con la segunda muestra a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Use un microtomo de cuchilla vibrante con los siguientes valores: espesor: 150-200 micras; velocidad: 3,5 au = 0,15 mm / seg; Frecuencia: 7.5 au = 75 Hz. Transferir las rebanadas a la cámara de oxigenación hasta su uso después de inspeccionar brevemente la morfología rebanada bajo el microscopio de disección. Las rebanadas se pueden mantener durante varias horas. </li></ol> 5. sola célula Registros electrofisiológicos <ol><li> Para las grabaciones, utilice un microscopio de fase fija en posición vertical equipado con objetivos de inmersión en agua, Dodt o infrarrojos diferencial de interferencia de contraste (IR-DIC), y epi-fluorescencia, así como una cámara CCD enfriada. Para la adquisición de datos, utilizar un amplificador de patch-clamp, etapa de la cabeza, AD tarjeta de interfaz / DA y un PC (incluyendo software de grabación). </li><li> Preparar un balance de 10-20 pipetas de parche (4-7) mO. pipetas de extracción de capilares de vidrio borosilicato (1,50 mm de diámetro exterior / 0,86 mm de diámetro interior) USINga extractor de micropipeta y extinción de esmalte con un microforge. Nota: Fuego pulir las puntas de pipeta es crucial cuando los parches más pequeños VSNS. Esto ayudará a prevenir la ruptura de la membrana celular cuando se aplica presión negativa con el fin de obtener un sello de alta resistencia. Después de pulir la abertura de la pipeta debe ser aproximadamente 1 m. </li><li> Mantenga pipetas en un frasco de almacenamiento pipeta para evitar daños y la acumulación de polvo hasta su uso. </li><li> Preparar sistema de perfusión rellenando depósitos de solución y el tubo de acuerdo con el diseño experimental. Nota: Eliminar las burbujas de aire de la tubería por completo, ya que interferirán fuertemente con los registros electrofisiológicos. </li><li> Ajustar la presión para lograr ~ 3 flujo ml / min. Nota: Las altas presiones causarán el movimiento de la lámina de tejido, así como la terminación de los registros electrofisiológicos. </li><li> Transferir VNO rebanada de cámara de imágenes y fijar la posición de fragmento utilizando anclaje de acero inoxidable cableado con 0,1 mm de espesor synthetic fibras (Figura 2 B - C). Nota: No cubra la lámina de tejido con uno de los hilos de fibra sintética, sino más bien la agarosa que rodea la rebanada. </li><li> Cámara de imágenes Transferencia de configuración de la grabación y la rebanada de forma continua superfuse con S oxigenada 2 a temperatura ambiente a través de una aplicación del baño. </li><li> Ajuste el capilar de succión a la superficie de la solución para crear una succión lenta para el intercambio constante de solución del baño. Ajuste el 8-en-1 de varios cañones para &quot;lápiz de perfusión&quot; por encima y cerca de la parte no sensorial de la rebanada VNO que contiene el vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A) 50. Será beneficioso para organizar lápiz de perfusión y la pipeta de grabación sea frente a la rebanada de direcciones opuestas. </li><li> Conectar el electrodo de referencia y solución del baño usando un puente de agar en forma de L (lleno de KCl 150 mM). </li><li> Llene la pipeta de parche con la solución de la pipeta S 4. </li><li> Montar la pipeta sobre el electrodo de parche de cloruro de plata-revestido conectado a la etapa de la cabeza, sin raspar el revestimiento y adherirse firmemente. </li><li> Aplicar una ligera presión positiva (aproximadamente 1 ml en una jeringa de plástico 10 ml) a la pipeta de parche antes de entrar en el baño. </li><li> Bajar la pipeta en el baño usando micro manipuladores lo suficiente como para ser capaz de sumergir el objetivo sin golpearlo (Figura 2D). </li><li> Vigilar la resistencia de la pipeta (R pip, entre 4-7 mO) usando el software de electrofisiología conectado a la etapa de la cabeza. Nota: Si R pip es &lt;4 mO la punta de vidrio se rompe. Si R pip es&gt; 10 mO, la punta es más probable obstruido y la pipeta debe ser reemplazado. </li><li> Visualizar el VNO rebanada con una cámara CCD usando contraste de interferencia diferencial optimizado para el infrarrojo (CID) e identificar FPR-RS3-i-Venus células que expresan (o similarmente neuronas marcadas) utilizando iluminación de fluorescenciay un cubo de filtro apropiado. </li><li> Enfoque y fluorescentes diana o células no fluorescentes dependiendo del diseño experimental. </li><li> Para acercarse al cuerpo celular, utilizar ruedas de mano para la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, una pequeña mella en la membrana soma celular se hace visible una vez que la punta de la pipeta está en estrecha proximidad. </li><li> Liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para aspirar en la membrana celular a fin de obtener un sello de alta resistencia (1-20 GΩ). Aplicar succión corta y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de célula completa. </li><li> Vigilar la resistencia acceso constante durante el experimento. Nota: Sólo incluya las neuronas que exhiben resistencia acceso pequeño y estable (≤3% de entrada R, el cambio &lt;20% en el transcurso del experimento) en el análisis. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El VNO es una estructura chemosensory que detecta semioquímicos. Hasta la fecha, la mayoría de los receptores vomeronasal queda por deorphanized tan sólo se han identificado algunos pares receptor-ligando. Entre ellos, V1rb2 fue descrito para ser activado específicamente por la feromona urinaria 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado por el macho ESP1 feromona específica 57, así como V2r1b y V2rf2 a ser activados por los péptidos MHC SYFPEITHI 48 y SEIDLILGY 58, respect...

La mayoría de los animales dependen en gran medida de sus sentidos químicos para interactuar con su entorno. El sentido del olfato juega un papel esencial para la búsqueda y evaluación de los alimentos, evitar a los depredadores y la localización de los socios de acoplamiento adecuados. En la mayoría de los mamíferos, el sistema olfativo consiste en al menos cuatro subsistemas anatómicamente y funcionalmente distintos periféricos: el epitelio olfativo principal 1,2, el ganglio Grueneberg 3,4, el órgano septal de Masera 5,6 y el órgano vomeronasal. El VNO comprende la estructura sensorial periférica del sistema olfativo accesorio (AOS), que desempeña un papel importante en la detección de señales químicas que transmiten información acerca de la identidad, el género, el rango social y el estado sexual 7-10. El VNO está situado en la base del tabique nasal derecha por encima del paladar. En los ratones, es un tubo ciego bilateral fin encerrados en una cápsula cartilaginosa 11-13. El órgano se compone tanto de un epithe sensorial medial forma de media lunaLium que alberga los VSNS y de una parte no sensorial en el lado lateral. Entre ambos epitelios se encuentra un lumen lleno de moco que está conectado a la cavidad nasal a través de la estrecha conducto vomeronasal 14. Un vaso sanguíneo lateral grande en el tejido no sensorial proporciona un mecanismo de bombeo vascular para facilitar la entrada de moléculas relativamente grandes, en su mayoría no volátiles tales como péptidos o proteínas pequeñas en el lumen VNO a través de presión negativa 15,16. Los componentes estructurales del VNO están presentes en el nacimiento y el órgano alcanza el tamaño adulto poco antes de la pubertad 17. Sin embargo, si la AOS roedores ya es funcional en los menores sigue siendo objeto de debate 18-20. VSNS se distinguen tanto por su ubicación epitelial y el tipo de receptor que expresan. VSNS muestran una morfología bipolar con un axón sin mielina y una sola dendrita apical que sobresale hacia el lumen y termina en una perilla dendríticas microvellosidades. VSN hachaons fasciculada para formar el nervio vomeronasal que sale de la cápsula cartilaginosa en el extremo dorso-caudal, asciende a lo largo del tabique, pasa la lámina cribosa y proyectos para el bulbo olfatorio accesorio (AOB) 21,22. El epitelio sensorial vomeronasal se compone de dos capas: la capa apical se encuentra más cerca del lado luminal y puertos tanto V1R- y todos menos un tipo de FPR-RS-expresando neuronas. Estas neuronas coexpresan los G αi2 G-proteína α-subunidad y proyecto a la parte anterior de la AOB 23-25. Las neuronas sensoriales situados en la capa basal más V2Rs expresas o FPR-RS1 junto G αo y envían sus axones a la región posterior de la AOB 26-28. Vomeronasal neuronas son activadas por probable más bien pequeñas semioquímicos 29-33 (V1Rs) o compuestos proteicos 34-38 (V2Rs) que son secretadas en diversos fluidos corporales, tales como orina, saliva y fluido desgarran 37,39-41 </sup&gt;. En experimentos in situ han demostrado que VSNS también se activan mediante péptidos formilados y diversos compuestos antimicrobianos / inflamación ligada 25,42. Por otra parte, expresaron de forma heteróloga FPR-rs proteínas comparten con agonistas espectros FPRs expresadas en el sistema inmunológico, lo que indica un papel potencial como detectores para la enfermedad de la misma especie o fuentes de alimentos en mal estado 25 (véase la referencia 43). Es fundamental para la comprensión de las relaciones de receptor-ligando y cascadas de señalización corriente abajo en poblaciones específicas de VSN es una evaluación detallada de sus características biofísicas básicas en un entorno nativo. En el pasado, el análisis de la señalización celular se ha beneficiado enormemente de animales modificados genéticamente que marcan una población definida de las neuronas por la coexpresión de una proteína marcadora fluorescente 30,44-49. En este protocolo, una línea de ratón transgénico que expresa FPR-RS3 junto con un marcador fluorescente (FPR-RS3-i-Venus) se utiliza.Este enfoque es un ejemplo de cómo emplear una cepa de ratones genéticamente modificado para realizar el análisis electrofisiológico de una población de células ópticamente identificable mediante sola neurona patch-clamp grabaciones en cortes de tejido coronal VNO agudas. Una presión de aire comprimido sistema de perfusión de varios cañones para los estímulos sensoriales y agentes farmacológicos permite la estimulación neuronal rápida, reversible y focal o la inhibición durante las grabaciones. grabaciones de células enteras en el tramo preparativos permiten un análisis detallado de las propiedades intrínsecas, conductancias activados por voltaje, así como patrones de descarga del potencial de acción en el entorno nativo de la célula.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Químicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (baja temperatura de gelificación)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>strong<>Comments</td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas y consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande,</td> decapitación de <td>VWR</td> de 90 mm<td>, disección de la cápsula de VNO</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri pequeña,</td> tapa de <td>VWR</td><td></td> de 35 mm <td>para disección de VNO, placa para incrustar en agarosa</td></tr><tr><td>Tijera quirúrgica grande y afilada</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>decapitación, extracción de la mandíbula inferior</td></tr><tr><td>Tijeras de hueso fuertes</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>incisivos de corte</td></tr><tr><td>Pinzas medianas, pinzas Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>para quitar la piel y el paladar</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Micro, 8,5 cm, curvas, hojas de 7 mm&nbsp;</td><td>Herramientas de Fine Science recortando</td><td></td><td>VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>Dos pares de pinzas finas, pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>diseccionando VNO de una cápsula cartilaginosa</td></tr><tr><td>Pequeña espátula de acero inoxidable</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>manejo de bloques de agarosa y rodajas de tejido</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td></td><td></td> quirúrgico <td>cortando el bloque de agarosa en forma piramidal</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td>Amplifier HEKA Elektronik EPC-10 Capilares de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> vidrio de borosilicato (1,50 mm OD/0,86 mm ID)Science Products Cámara CCD Leica Microsystems DFC360FX <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro, excitación: BP 450-490, supresión: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de fluorescencia</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético de placa calefactora</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td>Dispositivo micromanipulador <td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas, vertical de dos pasos</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Eliminador de ruido 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Osciloscopio Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión 8 en 1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH cinco fácil</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tarro de almacenamiento de pipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de registro&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini cámara</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de almacenamiento de lonchas oxigenante; las cámaras comerciales alternativas son: p. ej., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) o la precámara (BSC-PC; Warner Instruments)</td>microscopio estereoscópico hecho <td></td><td></td><td>a medida</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger interface&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td>Baño de agua <td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

En la mayoría de los mamíferos, el órgano vomeronasal (VNO) es una estructura quimiosensorial que detecta señales sociales tanto hetero como conespecíficas. Las neuronas sensoriales vomeronasales (VSN) expresan un tipo específico de receptor acoplado a proteína G (GPCR) de al menos tres familias diferentes de genes quimiorreceptores, lo que permite la detección sensible y específica de señales quimiosensoriales. Estas familias comprenden las familias de genes V1r y V2r, así como la familia de genes de quimiorreceptores putativos relacionados con el receptor de péptido de formilo (FPR) (Fpr-rs). Con el fin de comprender la fisiología de las interacciones receptor-ligando vomeronasal y la señalización posterior, es esencial identificar las propiedades biofísicas inherentes a cada clase específica de VSN.
El enfoque fisiológico descrito aquí permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales utilizando una línea de ratón transgénico (Fpr-rs3-i-Venus). El uso de este protocolo, sin embargo, no se limita a esta línea específica y, por lo tanto, puede extenderse fácilmente a otras líneas modificadas genéticamente o animales de tipo salvaje.

Para conocer las propiedades biofísicas y fisiológicas de las poblaciones de células definidas, realizamos cortes de tejido coronal agudas del ratón VNO (Figura 1 - 2). Después de la disección, rebanadas se pueden mantener en solución extracelular oxigenada enfriada con hielo (S 2) para varios hr. En la configuración de la grabación, un intercambio constante con solución oxigenada (Figura 2D) asegura la viabilidad del tejido d...

Aquí, describimos un enfoque fisiológico que permite la identificación y el análisis en profundidad de una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido coronal del órgano vomeronasal de ratón utilizando registros de patch-clamp de células completas.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis electrofisiológico a nivel de célula individual en una población definida de neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido del órgano vomeronasal de ratón. Este método puede ayudar a esclarecer preguntas clave en el campo de la quimiosensación, como los mecanismos de detección de señales químicas. La principal ventaja de esta técnica es que, al realizar registros en neuronas sensoriales en cortes agudos de tejido, estas células pueden estudiarse en su entorno nativo.Para comenzar este procedimiento, tras sacrificar al animal, retire la mandíbula inferior insertando un par de tijeras quirúrgicas grandes a través de la cavidad bucal y corte los huesos mandibulares y los músculos de cada lado por separado. A continuación, retire la piel del maxilar superior y alrededor de la punta de la nariz con pinzas medianas para obtener un mejor acceso a los incisivos. Luego, use las tijeras óseas para cortar la mayor parte de los incisivos en un ángulo de 45 grados en dirección rostral, con el fin de facilitar la extracción de la cápsula del órgano vomeronasal (VNO) desde la cavidad nasal.No corte la raíz del diente para evitar dañar la punta de la cápsula del órgano vomeronasal (VNO). Después, sujete el paladar duro en su parte rostral con pinzas medianas y retire cuidadosamente en una sola pieza con un ángulo plano. Enjuague repetidamente la cavidad nasal con la solución S2 fría con hielo. Luego, use tijeras microquirúrgicas de resorte para cortar la efusión ósea entre la punta del hueso vomer y la mandíbula.Introduzca las puntas de la tijera con la parte curva orientada lejos del órgano vomeronasal. Y corte cuidadosamente el hueso en pequeños pasos tanto en el lado izquierdo como en el derecho, en la región lateral a la cápsula del órgano vomeronasal. Para extraer la cápsula del órgano vomeronasal, corte a través del hueso vomer en la parte caudal y levante cuidadosamente el hueso vomer fuera de la cavidad nasal utilizando pinzas medianas.Transfiera inmediatamente el órgano vomeronasal (VNO) a una pequeña placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico sobre una bolsa de gel frío, donde deben realizarse los pasos restantes de la disección. A continuación, enjuague el VNO con una pequeña cantidad de S2 frío para evitar que el tejido se seque. Luego, separe las cápsulas cartilaginosas que contienen los tejidos blandos del VNO agarrando la parte posterior del hueso vomer con pinzas medianas.Para ello, coloque la cápsula en vista dorsal de modo que se haga visible una separación entre ambos VNO. Utilice la punta de una pinza fina para separar ambas cápsulas cartilaginosas del VNO del hueso central, manteniendo al mismo tiempo el hueso vomer sujeto en la parte posterior. Asegúrese de eliminar la pared cartilaginosa medial que previamente estaba unida al hueso vomer.Al retirar el cartílago alrededor del órgano vomeronasal, utilice pinzas solo en el borde de la cápsula cartilaginosa. Tenga mucho cuidado de no dañar el delicado epitelio sensorial. Para eliminar el cartílago restante, gire el órgano vomeronasal con su lado lateral curvo hacia el fondo del recipiente y sujete firmemente el cartílago en un lado utilizando pinzas.Luego, mueva cuidadosamente la segunda pinza fina desde el lado posterior con un ángulo muy bajo entre el cartílago y el órgano vomeronasal (VNO) para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago. Para evitar dañar el epitelio sensorial, desprenda lentamente el VNO del cartílago sujetándolo por su extremo caudal. Una vez que el VNO se haya separado de la cápsula, retire todas las partes pequeñas restantes de cartílago, ya que cualquier fragmento residual de cartílago despegará el tejido del agarosa circundante durante el proceso de corte en láminas.A continuación, coloque una pequeña gota de S2 helado sobre el primer VNO diseccionado para prevenir daños en el tejido. Para incluir los VNO, llene ambos pequeños recipientes de Petri hasta el borde con S3 fundido. Después de eso, sumerja cada VNO en agarosa y muévalo horizontalmente hacia adelante y hacia atrás varias veces para eliminar la película de solución extracelular, así como cualquier burbuja de aire de su superficie. Coloque el VNO verticalmente, con la punta rostral orientada hacia el fondo del recipiente.Posteriormente, coloque ambos platos sobre una bolsa de hielo en gel y espere hasta que el agarosa se haya solidificado. No cambie la orientación del órgano vomeronasal una vez que el agarosa haya comenzado a solidificarse, ya que esto despegaría el tejido del agarosa circundante. En este procedimiento, utilice una espátula pequeña para retirar el bloque de agarosa del plato pequeño hacia la tapa de una placa de Petri grande, y déle la vuelta al agarosa boca abajo, dejando la punta rostral del órgano vomeronasal orientada hacia arriba.A continuación, corte el bloque en forma de pirámide utilizando un escalpelo quirúrgico, teniendo cuidado de no dañar el tejido embebido. Luego, use pegamento instantáneo para fijar el bloque con forma de pirámide al centro de la placa del espécimen del vibrátomo. Espere aproximadamente un minuto para que el pegamento se seque completamente.Corte el espécimen en secciones de 150 a 200 micrómetros de grosor. Inspeccione brevemente la morfología de las secciones bajo el microscopio estereoscópico. A continuación, transfiera todas las secciones a la cámara oxigenada hasta su uso.En este paso, transfiera una sección del órgano vomeronasal (VNO) a la cámara de imagen y fije la posición de la sección utilizando un anclaje de acero inoxidable con fibras sintéticas de un milímetro de grosor. No cubra la sección de tejido con ninguno de los hilos de fibra sintética. A continuación, transfiera la cámara de imagen al sistema de registro y suprafunda continuamente la sección con S2 oxigenado a temperatura ambiente.Ajuste la micropipeta de succión a la superficie de la solución para crear un intercambio constante de la solución de baño. Luego, coloque el lápiz de perfusión multibarro de ocho en uno por encima y cerca de la parte no sensorial del corte del órgano vomeronasal que contiene el vaso sanguíneo. Posteriormente, conecte el electrodo de referencia y la solución de baño utilizando el puente de agar en forma de L lleno con cloruro de potasio 150 milimolar.Posteriormente, llene la pipeta de registro con la solución para pipeta S4. Coloque la pipeta sobre el electrodo recubierto de cloruro de plata conectado al cabezal amplificador sin eliminar el recubrimiento y sujétela firmemente. A continuación, aplique una ligera presión positiva a la pipeta de registro antes de introducirla en el baño. Supervise la pipeta y asegúrese de que su resistencia esté entre cuatro megaohmios y 10 megaohmios.Visualice la sección del órgano vomeronasal con una cámara CCD utilizando DIC optimizado para infrarrojo, e identifique las células que expresan FPR-rs3 i-Venus o neuronas etiquetadas de manera similar mediante iluminación de fluorescencia y un cubo de filtros adecuado. Acérquese al cuerpo celular utilizando las ruedas manuales para obtener la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, una pequeña depresión en la membrana del soma celular se vuelve visible una vez que la punta de la pipeta está en proximidad cercana.Luego, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para succionar la membrana celular con el fin de obtener un sello de alta resistencia de uno a 20 gigaohmios. Posteriormente, aplique una succión breve y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de célula entera. En esta figura, una imagen confocal de un corte coronal de tejido del órgano vomeronasal muestra la distribución de neuronas fluorescentes positivas para FPR-rs3 Tau Venus en el epitelio sensorial vomeronasal.Las neuronas positivas para FPR-rs3 Tau Venus exhiben una única dendrita apical que termina en una estructura en forma de nódulo en el borde luminar. Y aquí se muestran grabaciones mediante parche en todo el célula realizadas en el soma de la VSN. A continuación se presentan trazas representativas de grabaciones mediante parche en todo el célula de una corriente de sodio rápida y sensible a TTX, y de VSNs positivas para FPR-rs3.Los registros con escalón de voltaje bajo condiciones de control revelan una corriente interna rápida y transitoria dependiente del voltaje. El tratamiento con TTX a una concentración de un micromolar reduce fuertemente la corriente. Y el trazo restado digitalmente que se muestra aquí revela la corriente de sodio sensible a TTX y regulada por voltaje.Los trazos representativos del clampaje de corriente muestran despolarización e hiperpolarización, así como trenes de potenciales de acción generados mediante la inyección escalonada de corrientes positivas y negativas. Una vez dominado, todo el proceso de disección y corte de tejido puede realizarse en aproximadamente una hora para ambos VNO. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como grabaciones extracelulares con parche suelto o imágenes de calcio, con el fin de aumentar el rendimiento al analizar poblaciones más grandes de neuronas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes agudos de tejido del órgano vomeronasal de la boca y cómo realizar grabaciones electrofisiológicas unitarias de neuronas sensoriales vomeronasales.

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Multielectrodo array (MEA) grabaciones de proporcionar un método para estudiar la actividad eléctrica de las grandes poblaciones de neuronas. Aquí se presentan los detalles de una preparación de MEA para grabar desde el epitelio vomeronasal del ratón al mismo tiempo estimular el tejido.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

Este video describe el aislamiento de un órgano vomeronasal de ratón (VNO) y la preparación de tejido para el corte de vibratome. Las secciones se utilizan para caracterizar los atributos biofísicos y fisiológicos de un grupo específico de neuronas sensoriales.

Preparación del órgano vomeronasal de ratón para el seccionamiento de vibratomo

Este video muestra el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) en ratones utilizando una técnica de patch-clamp perforada. El epitelio olfativo, que contiene OSN con receptores de olor marcados con fluoróforos, se aísla de un ratón y se asegura en una cámara de registro. Una pipeta de registro se sujeta a la perilla dendrítica de un OSN, y la nistatina dentro de la pipeta perfora la membrana para formar una conectividad eléctrica con la célula. Por último, se...

Registro de neuronas sensoriales olfativas en ratones

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Un método eficaz para Deshuesado Manual Preparar Intact ratón tejido nasal con la organización anatómica Conservas

El bulbo olfativo accesorio ratón (AOB) ha sido difícil de estudiar en el contexto de la codificación sensorial. Este sentido, demuestran una disección que produce un vivo preparación ex en el que las neuronas AOB permanecen funcionalmente conectados a sus entradas de periferia, facilitando la investigación sobre el procesamiento de información de las feromonas del ratón y kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Este artículo proporciona un protocolo simplificado para la disección y disociación del epitelio olfativo murino con el fin de secuenciar el ARN de un solo núcleo.

Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo

Aprende a realizar análisis electrofisiológico de neuronas sensoriales en rebanadas agudas del órgano vomeronasal de ratón. Este método permite estudiar la quimiosensación en el entorno nativo celular.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal (Video) | JoVE Journal

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

Explorar más videos