Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

El objetivo general de esta técnica es realizar un cribado rápido de autoanticuerpos de forma multiplex. Este método puede ayudar a identificar preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como qué autoanticuerpos se correlacionan con diferentes estados de enfermedad. Las principales ventajas de esta técnica son que los autoanticuerpos pueden cribarse de forma paralela, solo se necesitan microlitros de suero y solo se requieren microgramos de antígeno.

Para generar microarreglos de antígenos, comience por diluir los antígenos en PBS hasta una concentración final de 2 miligramos por mililitro. Configure un microdispensador con nueve puntas para imprimir hasta 162 antígenos únicos en duplicado. Incluya antígenos IgG e IgM en la biblioteca de antígenos como controles positivos.

Incluya PBS únicamente como control negativo. Añada 20 microlitros de cada antígeno a la placa fuente de 384 pocillos en grupos que reflejen la configuración de la cabeza de impresión. Cubra la placa fuente con papel de aluminio y congele la placa a menos 80 grados Celsius hasta que esté lista para imprimir los arreglos.

Limpie los pinzas sólidos para microarreglos incubándolos en un baño ultrasónico con agua desionizada tres veces durante un minuto cada vez. Coloque las pinzas en un portapinzas para que sequen. Luego, coloque las pinzas en la cabeza de impresión del microarreglo.

Para nueve alfileres, utilice una configuración de tres por tres. A continuación, programe el microdispensador para la impresión estableciendo el número de alfileres en la cabeza de impresión, el número de portaobjetos a imprimir, el número de cuadrículas en cada portaobjetos y el número de puntos replicados para cada antígeno. Además, programe el microdispensador para someter los alfileres a sonicación en agua entre diferentes grupos de antígenos.

A continuación, tras descongelar la placa de origen, centrifúguela durante un minuto a 100 veces G. Coloque la placa de origen en el lugar designado del microdispensador y retire la sección de lámina de aluminio que cubre el primer grupo de antígenos que se imprimirán. Organice las laminillas sin imprimir sobre la superficie del microdispensador y ejecute el programa de impresión. Imprima las laminillas a temperatura ambiente con la humedad del microdispensador ajustada entre 55 y 60%. Tras imprimir cada grupo de antígenos en todas las laminillas, detenga el microdispensador.

Cubra los antígenos que acaban de imprimirse con papel de aluminio para evitar la evaporación, y descubra el siguiente grupo de antígenos que se van a imprimir. Luego, continúe con el programa de impresión. Después de que se hayan impreso todos los antígenos, cubra la placa de origen con un nuevo trozo de papel de aluminio y congélela a menos 80 grados Celsius.

Coloque las láminas impresas en una caja para láminas y séllela al vacío. Las láminas pueden usarse al día siguiente o hasta un mes después. Para sondar microarreglos con sueros diluidos utilizando cámaras de incubación, coloque las láminas en los marcos.

Luego, agregue 700 microlitros de tampón de bloqueo a cada superficie de matriz. Coloque la película adhesiva sobre el marco y transfiéralo a un recipiente hermético con un trozo de tejido húmedo. A continuación, incube las laminillas a cuatro grados Celsius en un agitador durante la noche.

Al día siguiente, diluya las muestras de suero uno a 100 en tampón de bloqueo. Luego aspire la solución de bloqueo de los arreglos y agregue 500 microlitros de la muestra diluida a cada superficie de arreglo. A continuación, cubra los arreglos con una película adhesiva e incube a cuatro grados Celsius con agitación durante una hora.

Luego, aspire las muestras de suero de los arreglos y use el tampón de lavado para enjuagar las superficies de los arreglos cuatro veces, vertiendo el tampón sobre los portaobjetos y eliminándolo rápidamente con un movimiento brusco. Use 700 microlitros de tampón bloqueador para lavar cada superficie del arreglo e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. A continuación, agregue 500 microlitros de anticuerpo secundario diluido a cada superficie del portaobjetos y cúbralo con una película adhesiva.

Incube los portaobjetos a cuatro grados Celsius con agitación durante 45 minutos. Después de la incubación, aspire la mezcla de anticuerpo secundario de los portaobjetos y enjuague cuatro veces, tal como se acaba de demostrar. A continuación, lave los portaobjetos con 700 microlitros de tampón de dilución bloqueante, tres veces durante 10 minutos cada vez.

Retire las laminillas de los portaportes, colóquelas en una rejilla metálica para laminillas e inmérjalas en PBS. Incube a temperatura ambiente con agitación orbital durante 20 minutos. Coloque una rejilla con laminillas en un recipiente con agua desionizada durante 15 segundos.

Luego, coloque la rejilla en un recipiente nuevo con agua e incube durante otros 15 segundos. Para secar los portaobjetos, coloque la rejilla de portaobjetos sobre un adaptador de placa de ELISA en la centrífuga y centrifugue a 220 veces G y temperatura ambiente durante cinco minutos. Guarde los portaobjetos en una caja hermética a la luz hasta que estén listos para su escaneo.

Para escanear las láminas, utilice un escáner de microarreglos que pueda detectar las señales fluorescentes SI tres y SI cinco. Determine los ajustes óptimos del tubo multiplicador, o PMT, mediante un preescaneo de una lámina de biblioteca de antígenos completa que haya sido incubada solo con anticuerpos secundarios. Establezca los valores de PMT utilizados presionando el botón de hardware de modo que las características de IgG humana en el canal SI tres y las características de IgM humana en el canal SI cinco tengan una intensidad de fluorescencia mediana menos fondo, o MFIB, similar, que generalmente es de 40 000.

A continuación, escanee las laminillas experimentales en los dos canales presionando el botón de escaneo. Guarde las imágenes de la laminilla en ambos canales después de cada escaneo. Utilizando el botón de archivo, cargue la laminilla que se va a analizar en el software de microarreglos.

Luego, utilice el botón de archivo para cargar la lista de matriz de genes, o archivo GAL, que contiene la distribución de la matriz, con las identidades de las características de la matriz. Coloque la plantilla de la matriz sobre la imagen escaneada, de modo que las características de la matriz coincidan con la plantilla lo más exactamente posible. Presione el botón de alineación para alinear las características en todos los bloques con la plantilla.

El software calculará entonces la MFI menos el fondo para cada uno de los antígenos. Finalmente, utilice el botón de archivo para exportar los resultados como un archivo de texto, y analice los datos de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. En esta figura, que muestra diapositivas de control positivo y negativo, la diapositiva negativa solo se incubó con anticuerpos secundarios, y la diapositiva de control positivo se incubó con suero de un paciente con lupus eritematoso sistémico.

Como se indica aquí, el suero de control positivo, con reactividad conocida frente a riboP, mostró anticuerpos IgM contra ADN de cadena sencilla y anticuerpos IgG contra riboP. Se observaron respuestas lineales con IgM en todas las diluciones del suero, y con IgG hasta un valor de MFI menos fondo de aproximadamente 30.000. En este experimento, el microarreglo se incubó con suero humano de un paciente con vasculitis crioglobulinémica, que presenta un factor reumatoide documentado, el cual es un anticuerpo IgM dirigido contra IgG.

La característica de IgG es de color verde amarillento debido a la unión de IgM en el suero del paciente a la IgG inmovilizada en la matriz. Al usar solo anticuerpos secundarios, no se observa reactividad de IgM contra la IgG que se ha depositado en la matriz. Aquí se muestran IgM e IgG de ratón depositadas en la matriz, que solo son detectadas con anticuerpos secundarios anti-ratón específicos para IgM e IgG, respectivamente.

Esta figura muestra el alineamiento de una cuadrícula de plantilla sobre una imagen de matriz escaneada, utilizando un software de análisis de microarreglos. Una vez alineados, las características de la matriz pueden analizarse para obtener la intensidad de fluorescencia mediana menos el fondo para cada característica. Una vez dominado, el análisis de microarreglos de antígenos puede realizarse en cuatro horas si se hace correctamente.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como ELISA, para validar los resultados obtenidos a partir de las micromatrices de antígenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo imprimir micromatrices de antígenos, cómo analizar micromatrices de antígenos con suero y cómo escanear micromatrices de antígenos con un escáner. No olvide que trabajar con suero humano puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.