Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

El objetivo general de esta técnica es cribar rápidamente los autoanticuerpos de forma múltiple. Este método puede ayudar a identificar preguntas clave en el campo de la autoinmunidad, como qué autoanticuerpos se correlacionan con diferentes estados de la enfermedad. Las principales ventajas de esta técnica son que los autoanticuerpos se pueden cribar de forma paralela, solo se necesitan microlitros de suero y solo se necesitan microgramos de antígeno.

Para generar microarrays de antígenos, comience diluyendo los antígenos en PBS hasta una concentración final de 2 miligramos por mililitro. Configure una configuración de micro array con nueve pines para imprimir hasta 162 antígenos únicos por duplicado. Incluir antígenos IgG e IgM en la biblioteca de antígenos como controles positivos.

Incluya PBS solo como un control negativo. Agregue 20 microlitros de cada antígeno a la placa fuente de 384 pocillos en grupos que reflejen la configuración del cabezal de impresión. Use papel de aluminio para cubrir la placa de origen y congele la placa a menos 80 grados centígrados, hasta que esté lista para imprimir matrices.

Limpie los pines sólidos del microarray incubándolos en un baño de sonicación con agua desionizada tres veces durante un minuto cada una. Coloque los alfileres en una rejilla para que se sequen. A continuación, coloque los pines en el cabezal de impresión de microarrays.

Para nueve pines, use una configuración de tres por tres. A continuación, programe el microarrayer para la tirada de impresión ajustando el número de pines en el cabezal de impresión, el número de portaobjetos a imprimir, el número de almohadillas en cada portaobjetos y el número de puntos replicados para cada antígeno. Además, programe el microarrayer para sonicar los pines en el agua entre diferentes grupos de antígenos.

A continuación, después de descongelar la placa fuente, centrifugala durante un minuto a 100 veces G. Coloque la placa fuente en el lugar designado en el microarrayer, luego retire la sección de papel de aluminio que cubre el primer grupo de antígenos que se imprimirán. Coloque las diapositivas no impresas en la superficie del matriz, y ejecute el programa de impresión. Imprima portaobjetos a temperatura ambiente con la humedad establecida en el matrizador entre el 55 y el 60%Después de que cada grupo de antígenos se imprima en todas las diapositivas, detenga el microarrayer.

Cubra los antígenos que se acaban de imprimir con papel de aluminio para evitar la evaporación y descubra el siguiente grupo de antígenos que se imprimirán. A continuación, continúe con el programa de impresión. Una vez que se hayan impreso todos los antígenos, cubra la placa fuente con un nuevo trozo de papel de aluminio y congélela a menos 80 grados centígrados.

Coloque las diapositivas impresas en una caja de diapositivas y séllela al vacío. Las diapositivas se pueden usar al día siguiente o hasta un mes después. Para sondear microarrays con sueros diluidos utilizando cámaras de incubación, coloque los portaobjetos en marcos.

A continuación, añada 700 microlitros de tampón de bloqueo a cada superficie de la matriz. Coloque la película adhesiva sobre el marco y transfiérala a un recipiente sellado con un trozo de pañuelo húmedo. Luego, incuba los portaobjetos a cuatro grados centígrados en un balancín durante la noche.

Al día siguiente, diluya las muestras de suero de una a 100 en tampón de bloqueo. A continuación, aspire la solución de bloqueo de las matrices y añada 500 microlitros de muestra diluida a cada superficie de la matriz. A continuación, cubra las matrices con una película adhesiva e incube a cuatro grados centígrados, meciendo durante una hora.

Luego, aspire las muestras de suero de las matrices y use un tampón de enjuague para enjuagar las superficies de la matriz cuatro veces vertiendo el tampón sobre los portaobjetos y sacudiéndolo rápidamente. Use 700 microlitros de tampón de bloqueo para lavar cada superficie de la matriz e incube 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo. Luego, agregue 500 microlitros de anticuerpo secundario diluido a cada superficie del portaobjetos y use una película adhesiva para cubrirlo.

Incubar los portaobjetos a cuatro grados centígrados meciéndolos durante 45 minutos. Después de la incubación, aspire la mezcla de anticuerpos secundarios de los portaobjetos y enjuague cuatro veces, como se acaba de demostrar. A continuación, lave los portaobjetos con 700 microlitros de tampón de dilución bloqueante, tres veces durante 10 minutos cada una.

Retire las diapositivas de los marcos, luego colóquelas en un soporte de diapositivas de metal y sumérjalas en PBS. Incubar a temperatura ambiente con agitación orbital durante 20 minutos. Coloque una rejilla deslizante en un recipiente con agua desionizada durante 15 segundos.

Luego coloque la rejilla en un nuevo recipiente con agua e incube durante otros 15 segundos. Para secar los portaobjetos, coloque la rejilla de portaobjetos en un adaptador de placa ELISA en la centrífuga y gire a 220 veces G y temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque las diapositivas en una caja ligera y hermética hasta que estén listas para escanear.

Para escanear los portaobjetos, utilice un escáner de micromatrices que pueda detectar señales fluorescentes SI tres y SI cinco. Determine el tubo multiplicador óptimo, o la configuración de PMT, mediante el escaneo previo de un portaobjetos de biblioteca de antígenos completo que solo se probó con anticuerpos secundarios. Establezca los valores de PMT utilizados presionando el botón de hardware para que las características de IgG humana en el canal SI de tres canales y las características de IGM humana en el canal SI de cinco tengan una intensidad de fluorescencia media similar menos el fondo, o MFIB, que suele ser 40, 000.

A continuación, escanee las diapositivas experimentales en los dos canales presionando el botón de escaneo. Guarde las imágenes de diapositivas en ambos canales después de cada escaneo. Con el botón de archivo, cargue el portaobjetos que se va a analizar en el software de microarrays.

A continuación, utilice el botón de archivo para cargar la lista de matrices de genes, o el archivo GAL, que tiene el diseño de la matriz, con las identidades de las características de la matriz. Coloque la plantilla de matriz sobre la imagen escaneada, de modo que las características de las matrices coincidan lo más posible con la plantilla. Pulse el botón de alineación para alinear las entidades de todos los bloques con la plantilla.

A continuación, el software calcula un MFI menos el fondo para cada uno de los antígenos. Finalmente, use el botón de archivo para exportar los resultados como un archivo de texto y analizar los datos de acuerdo con el protocolo de texto. En esta figura, que muestra portaobjetos de control positivos y negativos, el portaobjetos negativo solo se sondea con anticuerpos secundarios, y el portaobjetos de control positivo se sondea con suero de un paciente con lupus eritematoso sistémico.

Como se indica aquí, se ha demostrado que el suero de control positivo, con reactividad conocida a riboP, tiene anticuerpos IgM contra el ADN monocatenario y anticuerpos IgG contra riboP. Se observaron respuestas lineales con IgM en todas las diluciones séricas, y con IgG hasta un MFI menos fondo de aproximadamente 30.000. En este experimento, la matriz se sondea con suero humano de un paciente con vasculitis crioglobulinémica, con un factor reumatoide documentado, que es un anticuerpo IgM contra IgG.

La característica de IgG es de color amarillo verdoso debido a la unión de IgM en el suero del paciente a la IgG inmovilizada en la matriz. Usando solo anticuerpos secundarios, no se observa reactividad de IgM contra IgG que se detecta en la matriz. Como se muestra aquí, la IgM y la IgG de ratón detectadas en la matriz, solo se detectan con anticuerpos secundarios anti-ratón contra IgM e IgG respectivamente.

Esta figura muestra la alineación de una cuadrícula de plantilla en una imagen de matriz escaneada, utilizando un software de análisis de microarrays. Una vez alineadas, las características del conjunto se pueden analizar para obtener la intensidad de fluorescencia media menos el fondo para cada característica. Una vez dominado, el sondeo de los microarrays de antígenos se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como el ELISA para validar los resultados obtenidos de los microarrays de antígenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo imprimir micromatrices de antígenos, cómo sondear micromatrices de antígenos con suero y cómo escanear micromatrices de antígenos con un escáner. No olvide que trabajar con suero humano puede ser peligroso y se deben tomar precauciones universales al realizar este procedimiento.