Name: La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la capa libre de células en arteriolas del músculo cremáster de rata in vivo. Este método mejora la precisión en microhemodinámica y acelera el análisis respecto a técnicas manuales previas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC)/Beca Cooperativa de Investigación Básica (CBRG)/0078/2014.

Este estudio está de acuerdo con la Universidad Nacional de Singapur Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo aprobado ninguna. R15-0225). 1. Preparación quirúrgica del modelo animal <ol><li> los lúmenes de los vasos <ol><li> Anestesiar a ratas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de edad) con un peso (203 ± 20) g con ketamina (37,5 mg / ml) y xilazina (5 mg / ml) cóctel a través de inyección intraperitoneal (ip) (2 ml / kg) . No vuelva a tapar la aguja o quitarlo de la jeringa después de la inyección. </li><li> Una vez que el animal ha sido anestesiado (confirmado por los pies pellizcos), colocarlo sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C. afeitarse suavemente el pelo en la escápula, el cuello uterino anterior, parte baja del abdomen, pierna trasera medial y el saco escrotal. frenar suavemente las piernas utilizando cintas adhesivas de papel. </li><li> Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con tijeras de microdisección y pinzas en ángulo mientras observa a travésun microscopio estereoscópico. Coloque todos los instrumentos quirúrgicos cortantes en una bandeja resistente a la punción para evitar lesiones durante la cirugía. </li><li> Fregar todos los sitios quirúrgicos 3 veces alternando con yodo y alcohol al 70% antes de realizar la incisión. Enjuague todos los catéteres con 30 solución de heparina-solución salina IU / ml. </li><li> Hacer un 1-1,5 cm incisión en la piel en la línea media en las escápulas usando un par de tijeras quirúrgicas sobre la vena yugular derecha. Separar la fascia mediante disección roma para exponer la vena yugular y canular con un tubo de polietileno (PE-50) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0. Infundir anestesia suplementaria cuando sea necesario (1/3 a 1/2 de la dosis inicial, intravenosa (iv)) durante el curso de la cirugía y el experimento. </li><li> Realizar traqueotomía para mantener la permeabilidad de la vía aérea. Hacer un 1 - 1,5 cm de la incisión en la zona cervical anterior. Canular la tráquea utilizando un tubo de polietileno (PE-205) con suturas de seda 2-0 para asegurar el catéter en su lugar. </li><li> Vigilar la presión arteriala través de la canulación de la arteria femoral. Hacer un 1 - 1,5 cm incisión en la superficie medial izquierdo de la pata trasera. Separar la arteria femoral mediante disección roma. Canular la arteria femoral con un tubo de polietileno (PE-10) lleno de solución salina de heparina usando suturas de seda 5-0. </li></ol></li><li> Cremaster músculo Preparación y flujo de visualización <ol><li> Inserte una sutura de seda 5-0 a través del vértice del saco escrotal para extenderla. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Regularmente aplicar solución caliente isotónica (37 ° C; pH 7,4) al músculo expuesto. </li><li> Retire rodea los tejidos conectivos cuidadosamente ya fondo con un aplicador con punta de algodón. </li><li> Inserte una sutura de seda 5-0 a través del ápice del músculo cremáster. Cortar la sutura en dos piezas de igual longitud y un nudo en cada lado. Cortar el músculo entre los dos nudos y se extienden sobre una plataforma de plexiglás transparente personalizado tirando suavemente de la sutura. Fijarel extremo de la sutura a la plataforma con la tachuela azul. NOTA: la eliminación general de los tejidos conectivos que rodea es fundamental para determinar un contraste de imagen óptima. </li><li> 1.2.3 repita el paso hasta que se hagan de 5 a 6 fijaciones. Retirar con cuidado el músculo cremáster del epidídimo utilizando cauterio alta temperatura. Superfuse solución isotónica caliente al músculo expuesto para prevenir la deshidratación del tejido. <ol><li> Rodea el músculo cremáster con piezas plegadas de gasa. Cubrir el músculo expuesto con una película de polivinilo. Las piezas de gasa con la película forman una cubeta poco profunda para contener solución isotónica caliente para el objetivo del microscopio de inmersión en agua (Figura 1A). </li></ol></li><li> Transferir el animal en el escenario animal de un microscopio intravital (Figura 1C). Conectar la canulación arterial a un sistema de adquisición de datos fisiológicos de control de la presión continua (Figura 1E). </li><li> Mantener la temperat muscularure a 35 ° C con un elemento de calentamiento fijado debajo de la plataforma de los animales (Figura 1B). Colocar una sonda de temperatura al lado del músculo para proporcionar retroalimentación negativa para el controlador de potencia del elemento de calentamiento (Figura 1D). </li><li> Dejar al animal en el escenario durante 15 min se equilibre con el medio ambiente. </li><li> Visualizar el flujo sanguíneo en un microscopio intravital con un objetivo de inmersión en agua de 40X y un condensador de trabajo larga. </li><li> Elija una arteriola no ramificado (&lt;60 micras), basado en un enfoque de la imagen clara y el contraste entre el núcleo de glóbulos rojos, paredes CFL y de los vasos, con el fin de enfocar el microscopio en el plano diametral del vaso sanguíneo. Girar la cámara montada en el microscopio para alinear verticalmente la pared del vaso. </li><li> Registrar el flujo de sangre usando una cámara de vídeo de alta velocidad a una velocidad de 3.000 / seg durante 1 seg. Guardar el vídeo grabado en formato AVI sin comprimir en escala de grises de 8 bits para preservar la calidad de la imagen. NOTA:<html> Se recomienda una velocidad mínima de fotogramas de grabación de 3.000 cuadros / seg para garantizar que la medición CFL se puede realizar al menos una vez por RBC en condiciones de flujo arteriolar fisiológicas. </li><li> Utilice un filtro azul con pico de transmisión a una longitud de onda de 394 nm y de paso de banda espectral a 310 - 510 nm para mejorar el contraste entre los glóbulos rojos y plasma. NOTA: Asegúrese de que el espectro de la luz que pasa a través del filtro azul de la fuente de luz microscópico (100 W lámpara halógena) es de baja intensidad de la luz para evitar cualquier daño tisular potencial. </li><li> Al final del experimento, la eutanasia a los animales con una sobredosis de pentobarbital sódico. </li></ol></li></ol> 2. Análisis de Imagen <ol><li> Procesamiento previo para la medida de ancho CFL <ol><li> Abra MATLAB y ejecute el archivo &#39;CFL_pre.m&#39;. (Este y otros archivos de MATLAB se puede encontrar en elip &quot;&gt; Suplementario Archivo MATLAB.) </li><li> Haga clic en &quot;Abrir archivo&quot; para seleccionar el archivo de vídeo para analizar. </li><li> Ajuste el deslizador hacia la &quot;rotación&quot; para alinear verticalmente las paredes de los vasos. NOTA: Los usuarios pueden visualizar las líneas de la cuadrícula de asistencia para la alineación buque seleccionando el botón de opción &#39;Guía On&#39;, y ajustar el nivel de zoom de la imagen deslizando el control deslizante &quot;Zoom&quot;. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Confirmar Editar &#39;para confirmar la alineación del vaso. </li><li> Haga clic en el botón &#39;Set ROI de cultivo &quot;para definir la región de interés (ROI). La imagen alineada se mostrará en una ventana emergente. Ajustar el objetivo rectangular en la imagen y haga doble clic para confirmar el retorno de la inversión. Omitir este paso si no se requiere el recorte de la imagen. NOTA: solo incluye un solo barco en el retorno de la inversión para analizar el ancho de CFL del recipiente. Haga clic en el botón &quot;Reiniciar Imagen&quot; para restaurar la imagen a su forma original, si es necesario. </li><li> Haga clic en el9; &#39;botón para extraer todos los fotogramas de vídeo editado en imágenes de mapa de bits consecutivos (en escala de grises de 8 bits&#39; Extraer imágenes en formato BMP &#39;). Las imágenes extraídas se pueden encontrar en la carpeta con el mismo nombre que el archivo de vídeo seleccionado. </li></ol></li><li> La medición de la anchura de CFL <ol><li> Abra MATLAB y ejecute el archivo &#39;CFL_measure.m&#39;. </li><li> Haga clic en &quot;Seleccionar carpeta&quot; para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes extraídas. </li><li> Haga clic en la carpeta que contiene las imágenes y haga clic en &quot;Seleccionar carpeta&quot;. El primer cuadro de imagen en la carpeta se carga y se muestra en el panel de &quot;Escala de grises imagen &#39;, junto con su gris histograma de intensidad en el panel&#39; del histograma &#39;. </li><li> Seleccione el cuadro de imagen que desee en el cuadro de lista para realizar el análisis, de lo contrario se seleccionará el primer cuadro de la imagen. </li><li> Haga clic en &quot;Encontrar paredes de los vasos &#39;para identificar la pared del vaso interno en la imagen, que se determina en el lugar donde laperfil de intensidad de luz tránsitos pico de oscuro a claro más de dos píxeles. </li><li> Check &#39;filtro de mediana&#39; para aplicar un filtro de mediana a la imagen para reducir el ruido &quot;sal y pimienta&quot;. </li><li> Consultar &quot;Contraste automático&quot; para ajustar las intensidades de imagen digital para mejorar el contraste de la imagen. </li><li> Seleccione un algoritmo de umbral en el cuadro de lista que determina automáticamente un valor de umbral (τ) que divide los niveles de gris en dos clases - los píxeles blancos con niveles de gris por encima τ (CFL), y los píxeles negros con niveles de gris por debajo de τ (RBC básicos). NOTA: Como un método alternativo, el uso de umbralización manual si ninguno de algoritmo de umbral automatizado proporciona una umbralización imagen correspondiente. Haga clic en el botón de opción &quot;Manual&quot; y ajustar el control deslizante para definir el valor de umbral manual. </li><li> Para medir la variación espacial de los anchos de CFL, introduzca la resolución de píxeles en el cuadro &#39;píxeles de resolución&#39; (la resolucióncon esta configuración experimental fue 0,42 m / píxel). </li><li> Haga clic en el botón &quot;Calcular&quot; para obtener la variación espacial de los anchos de CFL. Haga clic en &quot;.csv Exportar &#39;para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado. </li><li> Para medir la variación temporal de los anchos de CFL en una línea de análisis específico a lo largo del recipiente, haga clic en el botón de opción &#39;Variación temporal&#39; e introduzca la información de velocidad de fotogramas (la frecuencia de imagen utilizada en este sistema experimental fue de 3.000 cuadros / seg). </li><li> Introduzca el primer fotograma y el último fotograma de las imágenes para el análisis de las cajas &#39;de comienzo de trama &quot;y&quot; último cuadro&#39;, respectivamente. </li><li> Seleccione la posición de la línea de análisis a lo largo del buque deslizando la barra deslizante &#39;Análisis de línea ». Confirmar la posición de la línea de análisis, que se ilustra en tanto la &#39;Escala de grises imagen&#39; y &#39;la imagen binaria&#39;. </li><li> Haga clic en &quot;Calcular&quot; para obtener la variación temporal de los anchos de CFL. Click &#39;Exportar CSV &quot;para exportar los datos de anchura CFL en un formato tabulado. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La medición de la anchura CFL es esencial para una mejor comprensión de la hemodinámica en la microcirculación. En particular, la medición de las anchuras CFL se ha realizado en mesentérica 6, spinotrapezius 24 y cerebrales 25 microcirculations. La medición convencional de la in vivo anchuras CFL se restringió a estimaciones por la inspección manual de los fotogramas de vídeo grabadas. Las mediciones manuales requieren el cálculo del promedio de varios fotogramas de vídeo sucesi...

Los estudios in vivo en animales son fundamentales para la ciencia básica para comprender la fisiología y la patología humanas. En particular, los estudios microhemodinámicos in vivo pueden dilucidar el posible deterioro de las funciones microcirculatorias alteradas por condiciones reológicas anormales de la sangre. En varios estudios microhemodinámicosprevios1 se ha utilizado el modelo de músculo Cremaster de rata para visualizar el flujo sanguíneo microvascular. El músculo cremaster es una capa delgada de músculo estriado que rodea los testículos. Por lo tanto, el flujo sanguíneo en el músculo se puede visualizar con un microscopio de iluminación trans mediante exposición quirúrgica. Esto nos permite adquirir las imágenes de flujo sanguíneo in vivo sin el uso de agentes de fluorescencia o contraste. Además, toda la perfusión sanguínea de la red muscular se puede controlar reduciendo el flujo sanguíneo ascendente con la oclusión de la aorta abdominal2. Debido a estas ventajas, el modelo de músculo cremaster ha sido ampliamente utilizado para investigar la formación de capas libres de células (CFL) en microvasos1,3. 
El ancho CFL es un parámetro hemodinámico prominente en la microcirculación, que ha sido de gran interés por sus importantes funciones en la regulación de las funciones microcirculatorias. La CFL se forma por la migración transversal hacia adentro inducida por cizallamiento de los glóbulos rojos (RBC) hacia el centro de flujo4. En consecuencia, esta migración conduce al agotamiento de los glóbulos rojos cerca de las paredes de los vasos, lo que finalmente resulta en una capa de plasma libre de células. En consecuencia, la CFL parietal se convierte naturalmente en una barrera de difusión para el suministro de oxígeno (O2) desde el núcleo de los glóbulos rojos a los tejidos, y para la eliminación de óxido nítrico (NO) por los glóbulos rojos5,6. Además, la producción de NO también puede ser modulada por las variaciones dinámicas de la anchura de la CFL7,8. Por lo tanto, es necesario determinar completamente el papel de la CFL tanto en el transporte de gas como en la regulación de la homeostasis en la microcirculación para comprender mejor el flujo sanguíneo en la microcirculación. Estudios recientes se han centrado en tender puentes entre las funciones hemodinámicas y de transporte de gases de la CFL en la microcirculación9-12. Además, un conjunto separado de estudios también ha investigado cómo la elevación patológica en la agregación de glóbulos rojos modula la formación de CFL y su efecto sobre la biodisponibilidad de O2 y NO en los tejidos13,14. 
Las funciones de la CFL se vuelven más significativas en la microcirculación, donde el tamaño relativo de la anchura de la CFL con respecto al diámetro del vaso es prominente. Esto requiere un enfoque eficaz para cuantificar el flujo sanguíneo in vivo de las CFL. En particular, la adquisición y el análisis de imágenes son los dos componentes clave que determinan la precisión de la medición del ancho CFL. La visualización exitosa del flujo sanguíneo tisular debe ir precedida de una preparación quirúrgica adecuada del modelo animal. Además, se necesita una técnica de análisis de imagen adecuada para superar las limitaciones de las mediciones manuales convencionales que en su mayoría son inducidas por errores humanos15,16. Con los avances en la instrumentación óptica y la potencia de cálculo para el procesamiento digital de imágenes, ahora es posible lograr una medición más precisa y consistente del ancho CFL17-19. No obstante, la precisión de estas mediciones, al estar basadas en imágenes, depende en última instancia de la calidad de las imágenes.
Por lo tanto, este estudio explora los factores que influyen en la medición del ancho de CFL in vivo. Nos centramos particularmente en la demostración de la preparación quirúrgica y el análisis de imágenes digitales para las mediciones de la anchura de las CFL en las arteriolas del músculo cremaster de rata.

<table><tbody><tr><td>Microscopio intravital</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Cámara de alta velocidad</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Filtro azul</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Sensor de presión y sistema biopac</td><td>Sistema Biopac</td><td>TSD104A, MP100</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC:0338-0221</td><td>Caliente en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>solución salina 0.9%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparina (5,000 UI/ml)</td><td>Tubo de</td> polietileno LEO <td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400.024</td><td>" OD x .011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE-50</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427411.038" OD x .023" ID</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE-205</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427446.082" OD x .062" ID</td></tr><tr><td>2-0 sutura de seda no absorbible</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda no absorbible</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica de circulación de agua</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Equipment Gasa</td></tr><tr><td>de algodón estéril&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14188</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Pinza de microdisección</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Pinza de iris 1 x 2 dientes</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Surgical instrumento</td></tr><tr><td>Pinza de canulación de vasos</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Micro tijera</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Tijera de iris</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr><tr><td>Clip para vasos</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Instrumental quirúrgico</td></tr><tr><td>Gemini</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Instrumento quirúrgico</td></tr></tbody></table>

la visualización y cuantificación de la capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster rata

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

La capa libre de células se define como la capa de plasma parietal en el flujo de microvasos, que está desprovista de glóbulos rojos. La medición de la anchura de la capa libre de células in vivo y sus variaciones espacio-temporales puede proporcionar una comprensión completa de la hemodinámica en la microcirculación. En este estudio, utilizamos un sistema microscópico intravital junto con una cámara de video de alta velocidad para cuantificar los anchos de capa libre de células en arteriolas in vivo. El músculo cremaster de las ratas Sprague-Dawley se exteriorizó quirúrgicamente para visualizar el flujo sanguíneo. También se desarrolló un script de imagen personalizado para automatizar el procesamiento de imágenes y el análisis del ancho de la capa sin celdas. Este enfoque permite la cuantificación de las variaciones espacio-temporales de manera más consistente que las mediciones manuales anteriores. Sin embargo, la precisión de la medición depende en parte del uso de un filtro azul y de la selección de un algoritmo de umbral adecuado. En concreto, evaluamos el contraste y la calidad de las imágenes adquiridas con y sin el uso de un filtro azul. Además, comparamos cinco algoritmos diferentes de umbral basados en histogramas de imágenes (Otsu, mínimo, intermodo, selección iterativa y umbral entrópico difuso) e ilustramos las diferencias en su determinación del ancho de la capa libre de celdas.

La visualización de la CFL in vivo depende en gran medida de las preparaciones quirúrgicas de la animal. pérdida excesiva de sangre o la duración de la cirugía prolongada se puede someter al animal a golpes y aberraciones del flujo sanguíneo. El mantenimiento de la temperatura del tejido usando una almohadilla de calefacción, así como una plataforma personalizada durante la cirugía y el experimento también es crucial para el mantenimiento de las condiciones fisiológicas de la rata. Mediante el uso de una lámpar...

Este estudio demuestra la preparación quirúrgica del músculo cremaster de rata para la visualización de la capa libre de células in vivo. En este estudio se discuten factores considerables que afectan la precisión de la medición del ancho de la capa libre de celdas.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar las variaciones espacio-temporales en el ancho de la capa libre de células in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microhemodinámica, para comprender mejor el papel de la filia celular en la microcirculación. La principal ventaja de este método es que el ancho de la filia celular in vivo se puede cuantificar de manera más consistente y conveniente que las técnicas anteriores de medición manual, que eran muy lentas.Antes de comenzar la medición del ancho de la capa libre de células, ejecute el archivo de script previo a MatLab para la capa libre de células. A continuación, haga clic en abrir archivo para seleccionar el archivo de video para el análisis y ajuste el control deslizante de rotación para alinear verticalmente las paredes del vaso único, utilizando el control deslizante de zoom para ajustar el nivel de aumento según sea necesario. Cuando el vaso esté en la posición adecuada, haga clic en confirmar edición y luego haga clic en establecer ROI para recortar y definir la región de interés.La imagen alineada se mostrará en una ventana emergente. Ajuste el rectángulo objetivo sobre la imagen según sea necesario y haga doble clic en el objetivo para confirmar la región de interés. Luego, haga clic en Extraer Imágenes para extraer todos los fotogramas del video editado en imágenes bitmap consecutivas, que se encontrarán en la carpeta con el mismo nombre que el archivo de video seleccionado.Para medir el ancho de la capa acelular, haga clic en Seleccionar carpeta y luego haga clic en la carpeta de imágenes. El primer cuadro de imagen aparecerá en el panel de imagen en escala de grises junto con el histograma de intensidad de grises correspondiente en el panel de histograma de imagen. Seleccione el cuadro de imagen deseado en el cuadro de lista para realizar el análisis y haga clic en Encontrar paredes del vaso para identificar la pared interna del vaso en la imagen, determinada como la ubicación donde el pico del perfil de intensidad luminosa cambia de oscuro a claro en dos píxeles.Marque el filtro mediano para aplicar un filtro mediano a la imagen y reducir el ruido sal y pimienta. Marque el contraste automático para ajustar digitalmente las intensidades de la imagen y mejorar el contraste. Luego, seleccione un algoritmo de umbralización en el cuadro de lista para determinar automáticamente el valor de umbralización que divide los niveles de gris en dos clases: píxeles blancos con niveles de gris por encima del valor de umbralización y píxeles negros con niveles de gris por debajo del valor de umbralización.Para medir la variación espacial de los anchos de la capa libre de células, ingrese la resolución del píxel en el cuadro de resolución del píxel. Luego, haga clic en Calcular para obtener la variación espacial de los anchos de la capa libre de células y haga clic en Exportar .csv para exportar los datos del ancho de la capa libre de células en un formato tabulado.Para medir la variación temporal de los anchos de la capa libre de células en una línea de análisis específica a lo largo del vaso, haga clic en Variación Temporal e ingrese la información de la frecuencia de cuadros. Ingrese los cuadros inicial y final de las imágenes para el análisis en los cuadros de cuadro inicial y cuadro final, respectivamente. Ajuste la barra deslizante de la línea de análisis para seleccionar la posición de la línea de análisis a lo largo del vaso y confirme la posición de la línea de análisis tal como se ilustra en las imágenes en escala de grises y en las imágenes binarias.Luego, haga clic en Calcular para obtener la variación temporal de los anchos de la capa libre de células y haga clic en Exportar. csv para exportar los datos del ancho de la capa libre de células en un formato tabulado. Aquí se muestra un flujo típico de glóbulos rojos a través de una arteria no ramificada en el músculo cremáster de la rata, donde se puede observar la capa libre de células entre el núcleo de GR y la pared interna del vaso.Un buen contraste entre estos componentes es fundamental para garantizar la precisión de las mediciones del ancho de la capa libre de células. La fase inicial del análisis de la imagen consistió en la detección de la pared interna del vaso. Al obtener el perfil de intensidad de luz a lo largo de la línea de análisis perpendicular al vaso, la ubicación se aproxima en el pico que pasa de oscuro a claro en dos píxeles.Posteriormente, los límites del núcleo de los glóbulos rojos se detectan mediante el algoritmo de umbralización de imagen y luego pueden calcularse los anchos de la capa libre de células. Dado que los glóbulos rojos en la capa libre de células poseen diferentes transmitancias de luz, la diferencia en los niveles de gris puede dividirse en dos clases. Sin embargo, la identificación de un valor de umbral preciso entre los dos picos del histograma de la imagen puede verse limitada por la baja calidad y contraste de la imagen.Para mejorar el contraste entre los glóbulos rojos y la capa libre de células, se puede utilizar un filtro azul. Esto es aún más evidente en estas imágenes, donde los límites de los núcleos de los glóbulos rojos se identificaron con mayor precisión mediante un filtro azul. El algoritmo de umbralización también puede influir en la medición del ancho de la capa libre de células, como se observa en estas imágenes, en las que diferentes algoritmos de umbralización dieron lugar a la identificación de distintos límites del núcleo de los glóbulos rojos y, por lo tanto, a diferentes anchos de la capa libre de células.La medición del ancho de la capa acelular in vivo es muy sensible a la calidad de las imágenes. Por lo tanto, asegúrese de realizar la cirugía con cuidado y de utilizar un asistente óptico adecuado para obtener una buena calidad de imagen. Además, es esencial seleccionar el algoritmo de umbralización de imagen apropiado para garantizar una medición precisa y consistente del ancho de la capa acelular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

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Aprende a visualizar y cuantificar la capa libre de células en arteriolas del músculo cremáster de rata in vivo. Este método mejora la precisión en microhemodinámica y acelera el análisis respecto a técnicas manuales previas.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

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