La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

El objetivo de esta intervención quirúrgica es dilucidar los mecanismos de inducción de las extremidades en el embrión de pollo, evitando que las moléculas de señalización se difundan desde los tejidos mediales a las células del mesodermo de la placa lateral y estudiando su efecto sobre la expresión génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cuáles son las señales inductivas para controlar el inicio de la yema de las extremidades. La ventaja de esta técnica es que el embrión de pollito es accesible a la manipulación quirúrgica y muy robusto, además, la yema de la extremidad de control contralateral no operada sirve como un control interno muy útil.

Susan Wilde demostrará el procedimiento. Para empezar, corte un trozo cuadrado de 1 cm de papel de aluminio de 0,013 mm de grosor y esterilícelo limpiándolo con etanol al 70%. A continuación, coloque el cuadrado en una placa de Petri de plástico estéril de 6 cm.

Para evitar que la estática se adhiera, desecha la tapa y haz una nueva para el plato con el mismo papel de aluminio. A continuación, coloque la placa de Petri encima de una retícula de escenario debajo de un microscopio binocular con un aumento de 1,6x. Utilice un bisturí pequeño de 15 hojas para cortar tiras de papel de aluminio de 1,3 mm de ancho que tengan 2 mm de largo.

Separe las tiras de papel de aluminio con dos pares de pinzas de relojería número cuatro. Luego, haz una curva en ángulo recto en el centro de la barrera de aluminio de modo que se asemeje a una bisagra. Alinee las barreras en el centro de la placa de Petri con un lado plano contra la placa y el otro apuntando hacia afuera de la placa, prepare 20 o más barreras antes del día de la operación.

Coloque la tapa de aluminio sobre el plato y guarde las barreras en un lugar donde no las molesten. Con el huevo acostado de lado, agarre firmemente un par de pinzas fuertes tipo AA y use un movimiento de apuñalamiento controlado para perforar el extremo romo del huevo que contiene el saco de aire mientras sostiene el huevo con la mano libre. Asegúrese de que la membrana de la carcasa interior se haya roto.

A continuación, toma el huevo con ambas manos y gíralo 180 grados a lo largo de su eje horizontal. A continuación, toma un trozo de cinta adhesiva transparente, de aproximadamente 5 cm cuadrados, y pégala bien sobre la superficie superior del huevo para evitar que la cáscara del huevo se desmorone sobre el embrión cuando se abra el huevo. Usa un par de tijeras curvas para romper suavemente la cáscara y sus membranas celulares internas asociadas en el centro de la parte superior del huevo.

Haz un agujero muy pequeño con una hoja de las tijeras para que el aire pueda entrar en el óvulo sobre el embrión. Use las tijeras para ampliar el agujero en la cáscara a un círculo con un diámetro de aproximadamente 1 cm. Retire este trozo de cáscara del tamaño del huevo del huevo.

Cubre el agujero del huevo con un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 5 cm cuadrados. Presione la cinta para pegarla solo en el borde del orificio dejando libre la cinta restante. A continuación, se puede agarrar la cinta libre para desprecintar fácilmente el huevo.

Tome un embrión de la etapa 15 de la incubadora y coloque el óvulo en un reposahuevos bajo un microscopio binocular con un aumento de 3.2x o más. A continuación, retira la capa superior de cinta adhesiva transparente. Con ayuda de un microbisturí de acero, se realiza una incisión a través de la membrana vitelina y se coloca lateralmente el mesodermo adyacente a los somitas 26-32 en el lado derecho del embrión.

Levante la barrera con las pinzas número 5 en un extremo y gire la barrera para insertar el extremo libre en la incisión. Tan pronto como sea posible, selle el huevo con cinta adhesiva transparente y devuélvalo a la incubadora. Si se va a insertar una cuenta junto con una barrera, en primer lugar, prepare las perlas empapadas en ácido retinoico como se describe en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, tome la cuenta y un par de micropinzas número 5 e insértelas en la cara cortada del mesodermo de lugar lateral en el lado distal de la incisión. Luego, inserte la barrera en la incisión proximal al cordón. Selle el huevo y devuélvalo de inmediato a la incubadora.

Si se va a insertar una cuenta o cuentas sin una barrera, no haga la incisión larga. En su lugar, haga una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el mesodermo de la placa lateral en la posición en que se colocará la cuenta. A continuación, toma la cuenta y las micropinzas número 5 e insértalas en el orificio del mesodermo de la placa lateral.

Empújelo un poco más con los extremos cerrados de las pinzas. Tome un embrión de etapa diez con ventana de la incubadora y coloque el huevo en un reposahuevos bajo un microscopio binocular configurado con un aumento de 3.2x o más si lo prefiere. A continuación, con un microbisturí de acero, se hace una incisión a través de la membrana vitelina y la placa lateral del mesodermo, lateral a la raya primitiva en el extremo caudal del embrión en línea con los somitas, de aproximadamente seis longitudes de somita.

A continuación, levante la barrera con un par de micropinzas número 5, en el extremo que sobresalen de la placa de Petri y gire la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. Tan pronto como sea posible, selle el huevo con cinta adhesiva transparente y devuélvalo a la incubadora. Si se va a insertar una cuenta sin una barrera, haga una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el mesodermo de la placa lateral en la posición en que se va a colocar la cuenta.

A continuación, toma la cuenta y un par de micropinzas número 5 e insértalas en el orificio del mesodermo de la placa lateral. Finalmente, empújelo un poco más con los extremos cerrados de las pinzas. Aquí se muestra la posición de la barrera en el presunto nivel de la pierna de los somitas 26-32 en un embrión en etapa 15.

Esta barrera hace que la expresión de Fhf10 y Fhf8 esté ausente en la región de la yema de la pierna en el lado operado y presente en el lado izquierdo no operado. Sin embargo, la expresión de Tbx4 se observa tanto en el estadio 19 como en el estadio 23 en el lado operado. Esto implica que la expresión de Tbx4 por sí sola no es suficiente para iniciar el crecimiento de las extremidades traseras desde el lpm.

Cuando las perlas empapadas en ácido retinoico se colocan distales a la barrera en la etapa 15, Tbx4, Fgf10 y Fgf8 se expresan en el lado operado como lo están en el lado de control izquierdo. Por lo tanto, en el desarrollo normal, el ácido retinoico de los somitas es esencial antes de que se pueda iniciar el crecimiento de las yemas de las extremidades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar barreras impermeables y cuentas factorizadas empapadas candidatas para estudiar cómo las señales inductivas regulan la iniciación de las yemas de las extremidades en el embrión de pollo.