Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas humanas con el virus de Sendai. Esto se logra primero preparando y colocando placas en las células de fibroblastos que se van a transducir. El siguiente paso del procedimiento es infectar las células con el virus Sendai.

A continuación, las células de fibroblastos infectadas se transfieren a células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón fresco. El paso final es seleccionar manualmente el reprogramado. Ahora, las células madre pluripotentes, en última instancia, la reprogramación de las células de fibroblastos en PSC I, sin el uso de genes trans, se puede demostrar a través del etiquetado inmunológico y R-T-P-C-R.

La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que mejora la eficiencia de la reprogramación sin quedarse en transición y de una manera rentable para este protocolo, tiene listos fibroblastos humanos cultivados en DMEM. Con FBS, transfiera estas células a placas de 24 pocillos para la placa de experimento, las células en seis diluciones en serie para determinar la mejor densidad para la unión de células. Cada fila de la placa de 24 pocillos puede acomodar una serie de celdas de dilución.

Por lo tanto, se pueden probar cuatro tipos de células en una placa, incubar la dilución durante 24 horas. Al día siguiente, seleccione pozos en tres niveles de confluencia para la transducción. Uno a un nivel alto de 80 a 90% de confluencia, otro a alrededor del 60% de confluencia y el tercero a aproximadamente 30% de confluencia una hora o más antes de la transducción.

Reemplace el medio con 300 microlitros de medio de fibroblastos frescos para la descongelación de la transducción. Un juego de tubos de virus Sendai a 37 grados centígrados durante unos segundos y luego terminar. Descongelarlos a temperatura ambiente.

Centrifugar los virus descongelados a 6.000 g durante 10 segundos y almacenarlos en hielo en un tubo de microcentrífuga. Hacer una mezcla de los virus calculada según el número de células a transducir. Los detalles del cálculo se pueden encontrar en el protocolo de texto.

Mezcle bien los virus con un pipeteo suave. Ahora, a las celdas más densas, agregue dos volúmenes de virus. Agregue un volumen de virus a las celdas de densidad media y agregue medio volumen de virus a la selección menos densa.

Agita la placa y déjala incubar durante la noche para que la reacción tenga lugar al día siguiente. Reemplace el medio con 500 microlitros de medios de fibroblastos frescos. Vuelva a hacer esto dos días después, tres días después del segundo cambio de medio realizado en las células transducidas.

Prepare células de metanfetamina en platos de 60 milímetros con DMEM que contenga una placa de 10% de FBS, 500, 000 células por plato e incube durante la noche. Al día siguiente, reemplace los medios de las celdas de metanfetamina con medios nuevos y luego proceda con la configuración del cocultivo. En primer lugar, retire los medios de los fibroblastos transducidos y lávelos una vez con DPBS.

A continuación, añada 200 microlitros de EDTA de tripsina al 0,25% a cada pocillo de células transducidas en cinco minutos. Agrupe todas las células que se desprenden en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Girar las celdas a 1,350 G durante cuatro minutos.

A continuación, retire el sobrenadante y lave las células peletizadas con unos cinco mililitros de medio fresco para neutralizar el trippin. Ahora recoja las celdas con otro giro de cuatro minutos a 1, 350 G.Siguiente plato. La mayoría de las células como seis diluciones en serie en la metanfetamina.

Es posible que la primera y la última dilución no sean necesarias dependiendo de la tasa de mortalidad de las células. Guarde algunas de las células para una extracción de ARN e incube las placas durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio ES humano suplementado con 10 micromolares de inhibidor de la quinasa RO Y 2 7 6 3 2.

Para mejorar la supervivencia celular durante los días siguientes, cambie el medio a medios ES humanos normales no suplementados. Después de una semana de cultivo, comience a revisar los platos cada pocos días para ver si se forman colonias ES como grupos de células. Una vez que aparezcan, controle el crecimiento.

Tres semanas después de la transducción, las colonias de grupos de células madre embrionarias deberían estar listas para la expansión. Han preparado celdas alimentadoras de metanfetamina en placas de 24 pocillos, tal como se prepararon para placas de 60 milímetros. Antes de elegir cualquier colonia, cambie el medio de las células de metanfetamina a un medio ES con 10 microlitros de Y 2 7, 6, 3, 2.

Escoge una colonia a la vez de los platos. Transfiera la colonia a un tubo de 15 mililitros con solución allí. Rompe la colonia con la pipeta.

A continuación, cúbreme a mí. Bien con la colonia desarticulada. En última instancia, cargue cada pozo con una colonia dividida y cargue tantos pozos como sea posible.

Mantenga las celdas con los cambios diarios de medios y amplíelas a placas de seis pocillos y luego a placas de 60 milímetros. Típicamente, los fibroblastos infectados por el virus de Sendai no muestran ningún cambio morfológico hasta después de cinco días. Luego, las células adquieren una forma redonda con un núcleo más grande y un citoplasma más pequeño.

Este protocolo a pequeña escala incluye varios parámetros que se pueden optimizar, como la densidad de fibroblastos, el título del virus y la densidad de siembra en el mes. También se puede optimizar la transducción de células a diferentes cofluidez que se muestran en diferentes colores. Después de una semana de cocultivo con células alimentadoras de metanfetamina, los fibroblastos parcialmente reprogramados tienen una forma similar a la de una banda suelta y se recogen fácilmente en lugar de recolectarse con tripsina.

Totalmente reprogramadas, las PSC I son claramente identificables a partir de células parcialmente reprogramadas. Las células completamente reprogramadas están muy compactas y las colonias pueden tener límites claros. Las células parcialmente reprogramadas forman grupos sueltos que se separan fácilmente.

Después de expandir los clones de IPSC durante varias semanas, se justifica la tinción de los marcadores de células madre en comparación con las células H nine. Los IPC son positivos para varios anticuerpos esperados, incluidos SSEA cuatro, OCT cuatro, TRA 81 y nano G, lo que respalda su calidad pluripotente. Usando R-T-P-C-R no se observó expresión de transgenes en clones humanos de IPSC.

Después de 10 cebadores para OCT exógeno cuatro, SOX dos, klf cuatro y Cmic se utilizaron con muestras de control positivas que mostraron fuertes niveles de expresión de transgenes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo reprogramar las células somáticas para inducir las células madre polipotentes y cómo seleccionarlas, reprogramar completamente las células de las otras células.