La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y determinar la frecuencia de los estrómulos utilizando microscopía de fluorescencia confocal de células vivas dentro de las hojas, y visualizar los estrómulos in vitro utilizando cloroplastos extraídos de las hojas. Estos métodos experimentales pueden ayudar a responder preguntas clave en la biología de las células vegetales y la investigación de los cloroplastos al descubrir cómo funcionan los estrómulos. La principal ventaja de estas técnicas es que producen datos reproducibles y robustos, incluso de estas estructuras de cloroplastos altamente dinámicas.

Tuvimos la idea del estudio de aislamiento de cloroplastos porque algunas investigaciones sugerían que la formación de estrómulos requería estructuras citosólicas, como el citoesqueleto, para formarse. Así que decidimos mezclar la celda y ver si aún se podían formar estrómulos. Para preparar muestras de hojas, comience usando una cuchilla de afeitar muy afilada para cortar una pequeña sección de una hoja de Nicotiana benthamiana.

Inmediatamente después de cortar la sección de la hoja, sumérjala en una jeringa de cinco mililitros llena de agua. Luego, retire el aire de la jeringa y aplique una aspiradora con un dedo para cubrir el orificio de la jeringa, antes de tirar del émbolo. Suelte suavemente el émbolo para evitar dañar la sección de la hoja.

A continuación, repita la extracción de aire dos o tres veces, o hasta que se haya eliminado el aire y la hoja parezca de color verde intenso. Agregue una gota de agua a un tobogán y coloque la sección de la hoja en la gota. Luego agregue otra gota de agua a la parte superior de la hoja y agregue un cubreobjetos.

Si hay burbujas de aire, golpee suavemente el cubreobjetos hasta que se retiren. Con luz transmitida y un objetivo de 20x, concéntrese en un campo de visión cerca del centro de la sección de la hoja, visualizando múltiples cloroplastos simultáneamente. Guarde una imagen con luz transmitida, de modo que los tipos de celda se puedan distinguir más adelante si es necesario.

A continuación, cambie a la iluminación láser con los filtros de excitación y emisión adecuados para el fluoróforo que se está utilizando, y guarde otra imagen. Con el software del microscopio, seleccione el canal GFP y haga clic para ajustar la apertura estenopeica a una unidad aireada. Seleccione el escaneo láser para comenzar a visualizar la muestra y, a continuación, haga clic en el canal GFP y la ganancia del detector para minimizar la potencia del láser sin dejar de visualizar claramente los estrómulos.

A continuación, prepare un experimento de pila Z que recogerá la serie de imágenes a través de la epidermis de la hoja en el campo de visión. Ajuste la velocidad de escaneo y la resolución de la imagen según sea necesario para asegurarse de que la pila Z se recoja rápidamente. A continuación, guarde la pila Z para su posterior análisis.

Usando la imagen J, combine la pila Z en una sola imagen usando la intensidad máxima en el software. A continuación, identifique y cuente manualmente todos los cloroplastos de la imagen. Para cada cloroplasto, determine visualmente si se ven uno o más estrómulos que se extienden desde el cloroplasto en la imagen de la pila Z combinada.

Para extraer cloroplastos intactos, prepare un tampón de extracción en frío utilizando los siguientes reactivos. Luego, con NaOH y HCl, ajuste el pH a 6.9 y refrigere antes de usar. Prepare el tampón de aislamiento y ajuste el pH a 7,6.

Si las hojas no expresan un estromofluoróforo codificado genéticamente, prepare una solución de diacetato de carboxifluoresceína o CFDA. Para aislar los cloroplastos, retire aproximadamente de 5 a 10 gramos de hojas de varias plantas y enjuague brevemente con agua fría. Luego, transfiera inmediatamente las hojas a 50 mililitros de tampón de extracción en frío.

Con una licuadora con varios pulsos cortos, muela las hojas, luego filtra la mezcla a través de dos o tres capas de gasa para eliminar los restos de hojas. Divida el cloroplasto extraído en dos tubos de centrífuga de 50 mililitros y centrifugue durante un minuto a 750 x g. Deseche el sobrenadante y use 10 milímetros de tampón de aislamiento para volver a suspender los cloroplastos verdes.

A continuación, centrifugar de nuevo durante un minuto a 750 x g, desechar el sobrenadante y utilizar un tampón de aislamiento para volver a suspender los cloroplastos hasta un volumen final de cinco mililitros. Si los cloroplastos provienen de plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a plastos, transfiera 20 microlitros de los cloroplastos a un portaobjetos y agregue un cubreobjetos. A continuación, realice la microscopía.

Para teñir cloroplastos de plantas que no expresan proteínas fluorescentes dirigidas a plástidos, agregue cinco microlitros de caldo de CFDA de 50 milimolares a los cinco mililitros de cloroplastos en tampón de aislamiento. Después de dejar incubar los cloroplastos durante cinco minutos, transfiera una pequeña alícuota a un portaobjetos, agregue un cubreobjetos y realice la microscopía. Por último, utilice un conjunto de filtros FITC o GFP y un objetivo 20x para visualizar varios cloroplastos simultáneamente.

O un objetivo superior para visualizar un solo cloroplasto aislado. Aquí se muestra una pila combinada que muestra la frecuencia de estomulas GFP en la codoledencia de plántulas jóvenes de N. Bentimaniana. En este panel, la imagen se desaturó y se invirtió para que el estroma aparezca negro.

Los cloroplastos fueron etiquetados como sin estrómulos, o con al menos un estrómulo. De los 87 cloroplastos epidérmicos visualizados, 33 tienen estrómulos, para una frecuencia de 37.9 por ciento en esta hoja. Este gráfico representa el análisis de más de 23.000 cloroplastos y varios cientos de células de una sola hoja de 21 plantas diferentes.

La frecuencia promedio de estromula durante el día fue de 20.8 más o menos 1.8 por ciento, y la frecuencia promedio de estromula nocturna fue de 12.8 más o menos 0.9 por ciento, lo que indica una frecuencia diurna significativamente mayor, según lo determinado por la prueba T de Welch. En esta figura, se observaron estrómulos de cloroplastos in vitro después del aislamiento de N. benthamiana que expresa GFP dirigido a plastos, o después de usar CFDA para teñir cloroplastos de N. benthamiana o Spinachia oleracea. Al realizar imágenes de células vivas de estrómulas, es importante trabajar rápidamente y manipular el tejido vegetal lo menos posible.

Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el silenciamiento génico o los tratamientos químicos, para descubrir actores moleculares adicionales o vías implicadas en la formación y función de las estrómulas. Esta técnica ha sido utilizada por investigadores en biología celular vegetal e inmunidad vegetal para estudiar el papel de los estrómulos en las vías de señalización celular y las respuestas de las plantas a los patógenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo calcular la frecuencia de la estromula en una hoja y cómo observar los estrómulos en los cloroplastos extraídos.

Y recuerde que los láseres y el voltaje eléctrico que suministra un microscopio confocal electrónico de barrido pueden ser extremadamente peligrosos, y es importante comprender los requisitos del sistema para usar este equipo.