La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y determinar la frecuencia de estromulos mediante microscopía de fluorescencia confocal en células vivas dentro de hojas, y para visualizar estromulos in vitro utilizando cloroplastos extraídos de hojas. Estos métodos experimentales pueden ayudar a responder preguntas clave en biología celular vegetal e investigación de cloroplastos al descubrir cómo funcionan los estromulos. La principal ventaja de estas técnicas es que producen datos reproducibles y robustos, incluso de estas estructuras de cloroplastos altamente dinámicas.

Tuvimos la idea del estudio de aislamiento de cloroplastos porque algunas investigaciones sugerían que la formación de estromulillas requería estructuras citoplasmáticas, como el citoesqueleto, para desarrollarse. Por lo tanto, decidimos homogeneizar la célula y observar si las estromulillas aún podían formarse. Para preparar las muestras de hoja, comience utilizando una cuchilla muy afilada para cortar una pequeña sección de una hoja de Nicotiana benthamiana.

Inmediatamente después de cortar la sección de la hoja, sumérjala en una jeringa de cinco mililitros llena de agua. Luego, retire el aire de la jeringa y aplique un vacío cubriendo la abertura de la jeringa con un dedo, antes de tirar del émbolo. Suelte suavemente el émbolo para evitar dañar la sección de la hoja.

Luego repita la eliminación del aire dos o tres veces, o hasta que el aire haya sido eliminado y la hoja aparezca de color verde oscuro. Añada una gota de agua a un portaobjetos y coloque el trozo de hoja sobre la gota. A continuación, añada otra gota de agua sobre la hoja y coloque una cubreobjetos.

Si hay burbujas de aire, golpee suavemente la cubreobjetos hasta eliminarlas. Con luz transmitida y un objetivo de 20x, enfoque un campo de visión cerca del centro de la sección de la hoja, visualizando múltiples cloroplastos simultáneamente. Guarde una imagen con luz transmitida para que los tipos de células puedan distinguirse posteriormente si es necesario.

Luego cambie a la iluminación con láser utilizando los filtros de excitación y emisión adecuados para el fluoróforo que se esté usando, y guarde otra imagen. Mediante el software del microscopio, seleccione el canal GFP y haga clic para ajustar la abertura del diafragma a una unidad airy. Seleccione el escaneo con láser para comenzar a visualizar la muestra, y luego haga clic en el canal GFP y la ganancia del detector para minimizar la potencia del láser mientras sigue visualizando claramente las estromulas.

A continuación, prepare un experimento de apilamiento Z que recopilará la serie de imágenes a través del epidermis de la hoja en el campo de visión. Ajuste la velocidad de escaneo y la resolución de la imagen según sea necesario para asegurarse de que el apilamiento Z se realice rápidamente. Luego, guarde el apilamiento Z para su análisis posterior.

Mediante ImageJ, combine la pila Z en una sola imagen utilizando la intensidad máxima en el software. Luego, identifique y cuente manualmente todos los cloroplastos en la imagen. Para cada cloroplasto, determine visualmente si se observan una o más estromulas extendiéndose desde el cloroplasto en la imagen combinada de la pila Z.

Para extraer cloroplastos intactos, prepare un tampón de extracción frío utilizando los siguientes reactivos. Luego, con NaOH y HCl, ajuste el pH a 6,9 y refrigere antes de usar. Prepare el tampón de aislamiento y ajuste el pH a 7,6.

Si las hojas no expresan un estromofluoróforo codificado genéticamente, prepare una solución de diacetato de carboxifluoresceína, o CFDA. Para aislar cloroplastos, retire aproximadamente de 5 a 10 gramos de hojas de varias plantas y enjuáguelas brevemente con agua fría. Luego transfiera inmediatamente las hojas a 50 mililitros de tampón de extracción frío.

Usando una licuadora con varios pulsos cortos, triture las hojas y luego filtre la mezcla a través de dos o tres capas de gasa para eliminar los restos de hojas. Divida los cloroplastos extraídos en dos tubos centrífugos de 50 mililitros y centrifugue durante un minuto a 750 × g. Deseche el sobrenadante y use 10 mililitros de tampón de aislamiento para resuspender los cloroplastos verdes.

Luego, centrifugue nuevamente durante un minuto a 750 x g, deseche el sobrenadante y use el tampón de aislamiento para resuspender los cloroplastos hasta un volumen final de cinco mililitros. Si los cloroplastos provienen de plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes dirigidas al plastidio, transfiera 20 microlitros de los cloroplastos a un portaobjetos y agregue un cubreobjetos. Luego, realice la microscopía.

Para teñir cloroplastos de plantas que no expresan proteínas fluorescentes dirigidas al plastidio, agregue cinco microlitros de la solución stock de CFDA 50 milimolar a cinco mililitros de cloroplastos en tampón de aislamiento. Después de permitir que los cloroplastos se incuben durante cinco minutos, transfiera una pequeña alícuota a un portaobjetos, agregue un cubreobjetos y realice la microscopía. Finalmente, utilice un conjunto de filtros para FITC o GFP y un objetivo de 20x para visualizar múltiples cloroplastos simultáneamente.

O un objetivo más alto para visualizar un cloroplasto aislado individual. Aquí se muestra una pila fusionada que indica la frecuencia de estomatopodos en la cofolicencia de plántulas jóvenes de N. benthamiana. En este panel, la imagen fue desaturada e invertida de modo que el estroma aparezca negro.

Los cloroplastos se etiquetaron ya sea como sin estromulas o como teniendo al menos una estromula. De los 87 cloroplastos epidermicos visualizados, 33 presentan estromulas, lo que representa una frecuencia del 37,9 por ciento en esta hoja. Este gráfico representa el análisis de más de 23.000 cloroplastos y de varias centenas de células de una sola hoja procedente de 21 plantas diferentes.

La frecuencia promedio de estromulias durante el día fue de 20,8 ± 1,8 por ciento, y la frecuencia promedio nocturna fue de 12,8 ± 0,9 por ciento, lo que indica una frecuencia significativamente mayor durante el día, según se determinó mediante la prueba T de Welch. En esta figura, las estromulias de cloroplastos se observaron in vitro tras el aislamiento de N. benthamiana que expresaba GFP dirigido a plastidios, o tras usar CFDA para teñir cloroplastos de N. benthamiana o de Spinachia oleracea. Al realizar imágenes en células vivas de estromulias, es importante trabajar rápidamente y manipular el tejido vegetal lo menos posible.

Después de seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la silenciación génica o tratamientos químicos para descubrir otros actores moleculares o vías adicionales implicados en la formación y función de las estromulas. Investigadores en biología celular vegetal e inmunidad vegetal han utilizado esta técnica para estudiar el papel de las estromulas en las vías de señalización celular y en las respuestas de las plantas a patógenos. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo calcular la frecuencia de estromulas en una hoja y cómo observar estromulas en cloroplastos aislados.

Y recuerde que los láseres y el voltaje eléctrico que alimentan un microscopio confocal de electrones de barrido pueden ser extremadamente peligrosos, y es importante comprender los requisitos del sistema para utilizar este equipo.