Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

El objetivo general de este experimento es estudiar la influencia de potenciales fármacos vasoactivos en la formación de trombos microvasculares in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la formación de trombos, como la identificación de nuevas sustancias antitrombóticas que podrían ayudar a prevenir la formación de trombos microvasculares, que es una de las principales complicaciones en la sepsis y durante el trasplante de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que el modelo de oreja del ratón sin pelo permite la microscopía de fluorescencia intravital y la inducción de trombos fototóxicos sin preparación quirúrgica previa en el lecho microvascular examinado.

Comience pesando y registrando el peso del mouse. A continuación, cargue el volumen adecuado de la sustancia problema en una jeringa de insulina. Administrar el fármaco 30 minutos antes de la inducción del trombo.

Después de anestesiar al ratón 15 minutos antes de la inducción del trombo, vuelva a colocar al ratón en la jaula hasta el inicio de la anestesia. Para verificar que haya suficiente anestesia, pellizque la cola con pinzas y observe la ausencia de una reacción. A continuación, 0,05 ml de 50 Dextran descongelado en una jeringa de insulina.

Después de llenar la jeringa, asegúrese de que no queden burbujas de aire, ya que incluso las pequeñas burbujas de aire administradas por vía intravenosa pueden ser letales para el animal. Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla de acroglass con una placa calefactora integrada en la posición boca abajo. Ajuste la placa calefactora a 37 grados centígrados.

Cubra las córneas del ojo del ratón con ungüento oftálmico. A continuación, sutura dos suturas de polipropileno 7.0 en el borde craneal y caudal de la oreja derecha. Coloca los puntos lo más cerca posible del borde y lo más proximales posible a la base.

Coloque el ratón en posición dorsal. Fije todas las patas a la plataforma con un vendaje adhesivo. Enganche una sutura debajo de los dientes frontales y coloque la cabeza en dorsiflexión fijando la sutura a la plataforma con un vendaje adhesivo.

Coloque al animal en la plataforma bajo el microscopio estereoscópico. Utilice un aumento de 10X. Para la microscopía de la oreja derecha, prepare la vena yugular izquierda creando primero una incisión de 5 mm en la piel del cuello en dirección craneocaudal.

A continuación, utilice micropinzas y microtijeras para diseccionar el tejido subcutáneo. Luego, libere la vena de sus adventia sin tocar el vaso. Ahora, use la jeringa de insulina previamente preparada para la inyección del tinte fluoroscente.

Agarre con cuidado la pared del vaso con las micropinzas sin perforar la vena. Penetrar en la pared del vaso distendido con la aguja de la jeringa e inyectar 50 Dextran por vía intravenosa. Retire la aguja y detenga el sangrado con hisopos de algodón.

Evite la contaminación del oído con sangre y tintes. Transfiera el animal en la placa calefactora a una construcción de vidrio acrobático con un listón para la placa auditiva y un plano de 0,5 cm de altura para colocar la oreja. Fije al animal en posición prona sobre la placa calefactora con un vendaje adhesivo.

Coloque el cartílago convexo en la base de la oreja al lado del plano de la oreja, de modo que la parte apical de la oreja pueda colocarse plana en el plano. Agregue una gota de agua a temperatura ambiente a la placa de vidrio acrobático. Con hisopos de algodón, absorba la gota de agua y deje que las fuerzas capilares unan el plano de la oreja al vidrio acrobático.

La aurícula debe colocarse lo más plana posible, aunque el cartílago le da una forma convexa. Por lo tanto, solo la parte distal más flexible de la aurícula debe colocarse en la placa de vidrio acrílico. Para evitar el daño tisular y la extravasación de líquidos y tintes, toque la oreja lo menos posible con las pinzas.

A continuación, añade una gota de aqua en la parte dorsal convexa de la oreja. Coloque con cuidado una cubierta en la oreja sin comprimir los vasos basales que ingresan a la oreja. Use hisopos de algodón para eliminar la mayor cantidad posible de agua de debajo del cubreobjetos Para minimizar la distancia entre el cubreobjetos y los vasos objetivo de la oreja.

Comience ajustando el microscopio de fluorescencia intravital para la visualización de 50 Dextran. Transfiera el animal preparado a la cubierta del microscopio de fluorescencia intravital. Con un aumento de 5X, 10X y 20X, y una intensidad de luz del 20%, busque un vaso venoso de 50 a 60 micras de diámetro y con un flujo sanguíneo anterógrado.

Agregue una gota de agua a temperatura ambiente al cubreobjetos para sumergir en agua el objetivo de aumento de 63X. Inmediatamente después de la aplicación de la gota de agua, comience a registrar el recipiente durante 20 segundos para la evaluación inicial del diámetro y el flujo sanguíneo. Iniciar la inducción del trombo cinco minutos después de la inyección de 50 Dextran.

Para ello, aumente la intensidad de la luz al 100%Durante la inducción de trombos fototóxicos, cierre la apertura del microscopio durante dos segundos en un período de 30 segundos para comprobar la oclusión del flujo sanguíneo. Si el flujo sanguíneo persiste, vuelva a abrir la abertura. El vaso se clasifica como ocluido si el flujo permanece inmóvil durante 30 segundos o más, o si el flujo sanguíneo es retrógrado.

Seleccione y ocluya cinco vasos por oído dentro de un período de una hora después de la inyección de 50 Dextran. Aquí, los animales fueron tratados con vehículo o con un cannabinoide, anandamida, WIN 155, 212-2 o cannabidiol antes de la inyección de 50 Dextan antes de la inducción del trombo. La anandamida, pero no el CBD, y WIN 155, 212-2 aceleraron significativamente el crecimiento de trombos después de un tratamiento único en comparación con el control del vehículo.

En otro contexto, la anandamida se combinó con indometacina para evaluar el impacto de los productos dependientes de la ciclooxigenasa en la formación de trombos a través de la anandamida. La coadministración con indometacina neutralizó el efecto protrombótico de la anandamida. Por lo tanto, la exposición aguda a la anandamida provoca un efecto protrombótico dependiente de la ciclooxigenasa in vivo.

Una vez dominado, la inducción del trombo en vasos estrechos se puede realizar en 90 minutos, incluida la preparación. Al intentar este procedimiento, es importante manipular la aurícula con mucho cuidado cada vez que se toque para evitar la extravasación de los líquidos y el tinte. Aunque este método puede proporcionar información sobre la formación de trombos, también se puede aplicar a otros sistemas, como la cicatrización de heridas, la insuficiencia del colgajo y la angiogénesis.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la aplicación de tinte de fluorescencia intravenosa, la posición del pabellón auricular y la iluminación de vasos específicos para realizar la inducción de trombos fototóxicos intravitales.