Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo
2 de abril de 2017
El modelo de oreja del ratón sin pelo SKH1-Hr hr permite microscopía de fluorescencia intravital de la microcirculación y la inducción de trombos fototóxico sin preparación quirúrgica previa en el lecho microvascular examinado. Por lo tanto, la oreja del ratón sin pelo es un excelente modelo in vivo para estudiar las interacciones complejas durante la formación de trombos microvasculares, la evolución de trombos, y la trombólisis.
El objetivo general de este experimento es estudiar la influencia de posibles fármacos vasoactivos sobre la formación de trombos microvasculares in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la formación de trombos, como la identificación de nuevas sustancias antitrombóticas que podrían prevenir la formación de trombos microvasculares, una de las principales complicaciones en la sepsis y durante el trasplante de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que el modelo de oreja del ratón sin pelo permite la microscopía de fluorescencia intravital y la inducción fototóxica de trombos sin necesidad de preparación quirúrgica previa en el lecho microvascular examinado.
Comience pesando y registrando el peso del ratón. Luego cargue el volumen apropiado de la sustancia de prueba en una jeringa de insulina. Administre el fármaco 30 minutos antes de la inducción del trombo.
Después de anestesiar el ratón 15 minutos antes de la inducción del trombo, coloque al ratón nuevamente en la jaula hasta que comience la anestesia. Para verificar una anestesia suficiente, pellizque la cola con pinzas y observe la ausencia de reacción. A continuación, coloque 0,05 ml de Dextran 50 descongelado en una jeringa de insulina.
Después de llenar la jeringa, asegúrese de que no queden burbujas de aire, ya que incluso las pequeñas burbujas de aire administradas por vía intravenosa pueden ser letales para el animal. Coloque el ratón anestesiado sobre una placa de acroglass con una placa calefactora integrada en posición prona. Ajuste la placa calefactora a 37 grados Celsius.
Cubra las córneas de los ojos del ratón con pomada oftálmica. Luego, coloque dos suturas de polipropileno 7.0 en los bordes craneal y caudal de la oreja derecha. Coloque las suturas lo más cerca posible del borde y lo más próximo posible a la base.
Coloque el ratón en posición dorsal. Fije todas las patas a la plataforma utilizando vendaje adhesivo. Pase una sutura por debajo de los dientes frontales y coloque la cabeza en dorsiflexión fijando la sutura a la plataforma con vendaje adhesivo.
Coloque el animal sobre la plataforma bajo el microscopio estereoscópico. Utilice un aumento de 10X. Para la microscopía de la oreja derecha, prepare la vena yugular izquierda creando primero una incisión de 5 mm en la piel del cuello en dirección craneocaudal.
Luego, utilice pinzas microquirúrgicas y tijeras microquirúrgicas para disecar el tejido subcutáneo. A continuación, libere la vena de su adventicia sin tocar el vaso. Ahora, use la jeringa de insulina previamente preparada para la inyección del colorante fluorescente.
Sujete cuidadosamente la pared del vaso con la microfórceps sin perforar la vena. Penetre la pared del vaso distendida con la aguja de la jeringa e inyecte 50 Dextran por vía intravenosa. Retire la aguja y detenga la hemorragia utilizando torundas de algodón.
Evite la contaminación de la oreja con sangre y colorante. Transfiera el animal sobre la placa calefactora a una estructura de vidrio acro con una ranura para la placa auditiva y una superficie plana de 0,5 cm de altura para posicionar la oreja. Fije el animal en posición prona sobre la placa calefactora utilizando una venda adhesiva.
Coloque el cartílago convexo en la base de la oreja junto al plano de la oreja para que la parte apical de la oreja pueda colocarse plana sobre el plano. Añada una gota de agua a temperatura ambiente sobre la placa de vidrio acro. Utilizando hisopos de algodón, absorba la gota de agua y deje que las fuerzas capilares fijen el plano de la oreja a la placa de vidrio acro.
La oreja debe colocarse lo más plana posible, aunque el cartílago le dé a la oreja una forma convexa. Por lo tanto, solo la parte distal más flexible de la oreja debe colocarse sobre la placa de vidrio acrílico. Para evitar daños en el tejido y extravasación de líquidos y colorante, toque la oreja lo menos posible con la pinza.
A continuación, agregue una gota de agua sobre la cara dorsal convexa de la oreja. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la oreja sin comprimir los vasos basales que entran en ella. Utilice bastoncillos de algodón para eliminar la mayor cantidad posible de agua de debajo del cubreobjetos, con el fin de minimizar la distancia entre el cubreobjetos y los vasos objetivo de la oreja.
Comience ajustando el microscopio de fluorescencia intravital para la visualización de Dextran 50. Transfiera el animal preparado a la platina del microscopio de fluorescencia intravital. Utilizando aumentos de 5X, 10X y 20X, e intensidad de luz del 20 %, busque un vaso venoso de 50 a 60 micrones de diámetro con flujo sanguíneo anterógrado.
Agregue una gota de agua a temperatura ambiente sobre el cubreobjetos para la inmersión en agua del objetivo de 63X de aumento. Inmediatamente después de aplicar la gota de agua, comience a grabar el vaso durante 20 segundos para la evaluación de línea base del diámetro y del flujo sanguíneo. Inicie la inducción del trombo cinco minutos después de la inyección de 50 Dextran.
Para este propósito, aumente la intensidad de la luz al 100 %. Durante la inducción de trombos por fototoxicidad, cierre la apertura del microscopio durante dos segundos dentro de un período de 30 segundos para verificar la oclusión del flujo sanguíneo. Si el flujo sanguíneo persiste, abra nuevamente la apertura. Se considera que el vaso está ocluido si el flujo permanece detenido durante 30 segundos o más, o si el flujo sanguíneo es retrógrado.
Seleccione y ocluya cinco vasos por oreja dentro de un período de una hora tras la inyección de 50 Dextran. Aquí, los animales fueron tratados con vehículo o con cannabinoides, anandamida, WIN 155,212-2 o cannabidiol antes de la inyección de 50 Dextran previa a la inducción del trombo. La anandamida, pero no el CBD, ni el WIN 155,212-2 aceleraron significativamente el crecimiento del trombo tras un tratamiento único en comparación con el control con vehículo.
En otro contexto, se combinó anandamida con indometacina para evaluar el impacto de los productos dependientes de la ciclooxigenasa en la formación de trombos mediante la anandamida. La administración conjunta con indometacina neutralizó el efecto protrombótico de la anandamida. Por lo tanto, la exposición aguda a la anandamida provoca un efecto protrombótico dependiente de la ciclooxigenasa in vivo.
Una vez dominada, la inducción de trombos en vasos estrechos puede realizarse en 90 minutos, incluida la preparación. Al intentar este procedimiento, es importante manipular la orejuela con mucha precaución cada vez que se toca, para evitar la extravasación de líquidos y colorante. Aunque este método puede proporcionar información sobre la formación de trombos, también puede aplicarse a otros sistemas, como la cicatrización de heridas, el fallo de colgajos y la angiogénesis.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la aplicación intravenosa de colorante fluorescente, la posición de la oreja y la iluminación de vasos específicos para realizar la inducción fototóxica de trombos en condiciones intravitales.
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Resumen
Este estudio utiliza el modelo de la oreja del ratón sin pelo SKH1-Hrhr para microscopía de fluorescencia intravital con el fin de investigar la formación de trombos microvasculares. El modelo permite la inducción fototóxica de trombos sin necesidad de preparación quirúrgica previa, lo que lo hace ideal para estudiar la evolución del trombo y la trombólisis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología microvascular
- Formación de trombos
Antecedentes
- La formación de trombos microvasculares es una complicación importante en la sepsis y en el trasplante de tejidos.
- El modelo de oreja proporciona un entorno único in vivo para estudiar la dinámica de los trombos.
- La microscopía de fluorescencia intravital permite la observación en tiempo real de la microcirculación.
- Se pueden probar fármacos vasoactivos potenciales para evaluar sus efectos sobre la formación de trombos.
Objetivo del estudio
- Evaluar la influencia de fármacos vasoactivos sobre la formación de trombos microvasculares in vivo.
- Identificar nuevas sustancias antitrombóticas que puedan prevenir la formación de trombos.
- Explorar los mecanismos de evolución del trombo y de trombólisis.
Métodos Utilizados
- Administración de sustancias de prueba mediante jeringa de insulina antes de la inducción del trombo.
- Uso de anestésicos y técnicas quirúrgicas para preparar el modelo de ratón.
- Microscopía de fluorescencia intravital para visualizar la formación del trombo.
- Inducción fototóxica del trombo y evaluación de la oclusión del flujo sanguíneo.
Resultados principales
- La anandamida aceleró el crecimiento del trombo en comparación con el control vehicular.
- La coadministración de indometacina neutralizó el efecto protrombótico de la anandamida.
- La inducción del trombo puede realizarse eficientemente en menos de 90 minutos.
- La técnica permite la observación detallada de la dinámica del trombo in vivo.
Conclusiones
- El modelo de oreja es efectivo para estudiar la formación de trombos microvasculares.
- Los fármacos vasoactivos pueden influir significativamente en la dinámica del trombo.
- Se necesita más investigación para explorar los mecanismos detrás de estos efectos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de microscopía intravital permite la evaluación en tiempo real de la formación de trombos microvasculares en un entorno in vivo fisiológicamente relevante, facilitando la evaluación temprana de compuestos vasoactivos por su potencial antitrombótico. Al eliminar la necesidad de preparación quirúrgica, el modelo de oreja de ratón sin pelo mejora el rendimiento y la reproducibilidad en la investigación preclínica de trombosis. El sistema proporciona información mecanicista sobre la dinámica del trombo, ayudando en la validación de dianas y en la identificación de compuestos prometedores para trastornos trombóticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas respecto a los efectos de fármacos vasoactivos sobre las vías de formación de trombos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la observación directa del crecimiento del trombo y la oclusión en microvasculatura intacta.
- Valor predictivo: Genera datos cuantitativos con resolución temporal sobre la evolución del trombo, mejorando la confianza en los resultados de la modulación de la diana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Produce lechos microvasculares estandarizados y reproducibles para cribados consistentes de compuestos entre diferentes laboratorios.
- Salida cuantitativa: Proporciona puntos finales medibles como el tiempo hasta la oclusión y el tamaño del trombo para el análisis de respuesta a la dosis.
- Escalabilidad: Permite la evaluación de múltiples vasos por animal dentro de un período de tiempo definido, facilitando el cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la trombosis microvascular relacionada con la sepsis y las complicaciones en trasplantes de tejidos.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con la fisiopatología in vivo mediante la visualización directa de la formación de trombos.
- Reducción de riesgos: Permite la identificación temprana de riesgos asociados a compuestos al detectar sus efectos pro-trombóticos antes de las pruebas preclínicas avanzadas.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco inicial, proporcionando lecturas funcionales que orientan las decisiones de continuar o descartar en programas centrados en la trombosis.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre las vías moleculares que regulan la formación de trombos mediante intervenciones farmacológicas o genéticas.
- Selección: Permite la evaluación cuantitativa y reproducible de los efectos de compuestos sobre la cinética del trombo en la microcirculación intacta.
- Análisis: Genera datos temporales y morfológicos sobre el desarrollo del trombo para apoyar el análisis comparativo entre grupos de tratamiento.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos clínicos de trombosis a través de la fisiopatología microvascular conservada.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversos agentes vasoactivos en múltiples proyectos preclínicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona claridad mecanicista sobre las vías de formación del trombo, reduciendo la ambigüedad en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de inducción del trombo y de obtención de imágenes, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del desarrollo al identificar riesgos protrombóticos en fases tempranas del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de compuestos basándose en perfiles de riesgo trombótico in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía intravital, canulación microquirúrgica de vasos y manejo de colorantes fluorescentes.
- Depende de equipo especializado que incluye platina calefactora, estereomicroscopio y sistema de imagenología de fluorescencia con intensidad de luz ajustable.
- Necesita protocolos estandarizados de anestesia y manejo de animales para minimizar la variabilidad en la formación de trombos.
- Requiere habilidad técnica en la inmovilización de la oreja y el enfoque óptico para mantener una visualización constante del vaso.
- Se limita a lechos microvasculares superficiales, restringiendo su aplicación a modelos vasculares cutáneos o accesibles.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Administration of Test Substance and Preparation of FITC-Dextran
2:42
Preparation of the Left Jugular Vein and Injection of FITC-Dextran
3:51
Positioning the Right Ear for Intravital Fluorescence Microscopy
5:24
Intravital Fluorescence Microscopy and Thrombus Induction of the Right Ear
7:01
Venular Thrombus Formation after Single Cannabinoid Treatment and Cyclooxygenase Inhibition
8:03
Conclusion
