Name: Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a aislar protoplastos de soja mediante digestión enzimática de hojas unifoliadas. Este método simple permite estudiar mecanismos reguladores y señalización celular en plantas vivas.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. crecimiento de las plantas
<ol><li>Sembrar semillas de soja de 5-10 (Williams 82) en una maceta de 13 cm en el invernadero bajo condiciones de día largo (16 h de luz en 1.500 μmol m-2 s-1) a 25 ° C en la mezcla de suelo personalizados para soja (el 1: relación 1:1 de arena de tierra, perlita y torpedo).</li>
</ol>2. preparación de plásmido ADN
<ol><li>Utilizando una pipeta estéril o palillo de dientes, elige una sola Colonia o stock de glicerol congelados de e.coli con el plásmido que contiene el gen de interés e inocular en medio líquido de 20 mL Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 mL.</li>
	<li>Incube el frasco a 37 ° C durante la noche en un agitador. Recoger las bacterias por centrifugación de la suspensión a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Extraer y purificar el plásmido siguiendo el procedimiento del fabricante de un kit de preparación de plásmido.</li>
</ol>3. aislamiento protoplasto
<ol><li>Cortar hojas unifolioladas recientemente ampliadas de plántulas de soja 10 - viejo (figura 1). Nota: Selección de hojas en una etapa de desarrollo apropiada es la clave del éxito para la preparación del protoplasto de soja. Utilice únicamente hojas sólo ampliados en las primeras etapas del desarrollo. Las hojas maduras, paredes celulares convertido en más difícil de digerir.</li>
	<li>Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de las hojas unifolioladas y luego corte los restos en 0.5-1 mm tiras. Nota: Dos hojas unifolioladas digeridos en 10 mL de solución de enzima dará suficientes protoplastos para transformaciones más de 10.</li>
	<li>Con un par de pinzas, transferencia de la hoja las tiras inmediatamente y con cuidado en 10 mL de solución recién preparada de la enzima (tabla 1) en un tubo de 15 mL. Vacío infiltra la hoja tiras durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube las tiras de la hoja en la solución de enzima con agitación suave (40 rpm) bajo condiciones de poca luz para 4-6 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de enzima convierte amarillo-verde protoplastos son liberados. Comprobar la solución de enzima/protoplastos bajo el microscopio (X10). Nota: El lanzado protoplastos son esféricos formado, mientras que las células sin digerir tienen forma oval o irregular.</li>
	<li>Transferir 10 mL de solución en un tubo de 50 mL de enzima/protoplasto vertiendo suavemente y añadir 10 mL de solución de W5 (tabla 1) a temperatura ambiente para detener la digestión. Invierta suavemente el tubo varias veces. Vierta suavemente la solución de enzima/protoplastos en una malla de nylon limpio 75 μm colocada encima de un tubo de 50 mL para remover los tejidos de la hoja sin digerir.</li>
	<li>Centrifugue la solución a través de flujo de enzima/protoplastos a 100 x g en el tubo de 50 mL durante 1-2 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL sin perturbar el pellet de protoplasto.</li>
	<li>Suspender los protoplastos y diluir a una concentración de 2 x 105 mL-1 en la solución de W5 refrigerada a 4 ° C por conteo de protoplasto en un hemacitómetro bajo el microscopio (x10). Mantenga los protoplastos en el hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 100 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente y suavemente Retire la solución de W5 con una pipeta de 1 mL sin perturbar el pellet de protoplasto. Resuspender los protoplastos en la solución MMG (tabla 1) en una concentración de 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.</li>
</ol>4. transformación de protoplasto
<ol><li>Hacer 100 alícuotas de μl de protoplastos (2 x 104 protoplastos en 2 x 105 mL-1) en tubos de microcentrífuga de adherencia baja 1,5 mL utilizando sin cortar puntas de la pipeta de 200 μl. Poner una alícuota a un lado para servir como control negativo. Añadir 10 μl del plásmido (10-20 μg) en cada uno de la alícuota del resto de protoplastos.</li>
	<li>Lentamente agregar 110 μl de solución recién preparada de PEG (tabla 1) en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego invierta suavemente y gire el tubo hasta que la solución sea homogénea.</li>
	<li>Incubar la mezcla de transformación a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Para detener la transformación, poco a poco añadir 400 μL de solución de W5 con el tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar el tubo a 100 g durante 1-2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución de WI (tabla 1) en el tubo y resuspender mediante pipeteo suave 1 - 2 veces. Añadir 1 mL de suero de ternera estéril (vol/vol) de 5% en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6 a capa de la superficie y evitar que los protoplastos se adhiera a la placa.</li>
	<li>Después de unos segundos, desechar el suero con una pipeta. Transferencia de los protoplastos resuspendidos en un pocillo de la placa de cultivo. Cubra la placa con una tapa.</li>
</ol>5. protoplasto incubación y cosecha
<ol><li>Incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante 1-2 días en la oscuridad. Nota: Hemos encontrado que dos días de incubación produce una señal más fuerte de la proteína fluorescente en general comparada con un día incubación, y que la señal de la proteína fluorescente puede durar hasta 3-4 días.</li>
	<li>Transferir la solución del protoplasto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja de la adherencia. Centrifugar el tubo a 100 x g por 1-2 min a temperatura ambiente para cosechar protoplastos. Quite el sobrenadante con una pipeta y transferir 10 protoplastos μl sobre un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Observar la señal fluorescente bajo fluorescencia o microscopía confocal. Uso no transforman protoplastos como control negativo (no hay señal debe observarse).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36,</s...

Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.
El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.
Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasa Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELULASA "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>ICN Biomédica</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td> BSA NEB R3535S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>malla de nylon</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr> placas <tr><td>de cultivo de tejidos USA</td><td>Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacitómetro</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen</td><td></td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET</td><td>Centrífuga Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>5810 Centrífuga</td><td>5811000827</td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Controlador de pipetas</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga antiadherentes, sin RNasa, 1,5 mL</td> Tubos de centrífuga <td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Denville</td><td></td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Serum para terneros recién nacidos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 16010159 <td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Vivero de Ingram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlita</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Arena</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Lennox (Polvo)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un método simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.

Diferentes órganos de soja 10 - viejo fueron probados para la preparación del protoplasto (figura 1) y rendimientos fueron observados bajo el microscopio (figura 2). Las paredes celulares de hipocótilo y epicotyl apenas fueron digeridas, y algunas células se quedaron conectadas entre sí (figura 2B, 2C). En el cotiledón (Figura 2D) y raíz (<strong class="...

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

El objetivo general de este método es obtener células de protoplasto de alta calidad a partir de la soja para examinar los mecanismos de regulación y señalización en células vivas de soja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las redes reguladoras, como cuál es su gen objetivo inmediato, el factor de transfusión abierto, y cuál es su compañero de interacción, la apertura de una proteína. La principal ventaja de esta técnica es el arte.Produce grandes cantidades de células uniformes de protoplasto de soja, y es simple y fácil. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es muy difícil obtener buenos protoplastos de las hojas de soja a menos que se unifolien en una etapa específica. La selección de las hojas en una etapa de desarrollo adecuada es la clave para una preparación exitosa del protoplasto de soja.Corte hojas unifoliadas recién expandidas de plántulas de soja de 10 días. Para asegurarse de que cuando una muestra dé un alto rendimiento de protoplastos, recoja al menos tres muestras de hojas unifoliadas en etapas de desarrollo ligeramente diferentes. Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de cada ho

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.

El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em

Se presenta un método para la introducción, el seguimiento y el análisis cuantitativo de la expresión de GFP en las células vegetales. Este método utiliza un sistema diseñado a la robótica para la colección de imágenes semi-permanente de un gran número de muestras, con el tiempo. También demostrar el uso de ImageJ e ImageReady para el análisis de series de imágenes.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que...

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Los métodos existentes para la modificación de plantas tienen una aplicabilidad limitada. La novedosa tecnología derivada de péptidos propuesta aquí promete simplicidad y eficiencia en la introducción de proteínas o genes exógenos en los compartimentos intracelulares deseados de plantas intactas.

Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para transfectar transitoriamente millones de protoplastos de maíz para probar grandes bibliotecas de plásmidos en células de mesófilo de maíz.

Transfección escalable de protoplastos de mesófilo de maíz

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

Aprenda a aislar protoplastos de soja mediante digestión enzimática de hojas unifoliadas. Este método simple permite estudiar mecanismos reguladores y señalización celular en plantas vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

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