Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

El objetivo general de este método es obtener células de protoplasto de alta calidad a partir de la soja para examinar los mecanismos de regulación y señalización en células vivas de soja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las redes reguladoras, como cuál es su gen objetivo inmediato, el factor de transfusión abierto, y cuál es su compañero de interacción, la apertura de una proteína. La principal ventaja de esta técnica es el arte.

Produce grandes cantidades de células uniformes de protoplasto de soja, y es simple y fácil. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es muy difícil obtener buenos protoplastos de las hojas de soja a menos que se unifolien en una etapa específica. La selección de las hojas en una etapa de desarrollo adecuada es la clave para una preparación exitosa del protoplasto de soja.

Corte hojas unifoliadas recién expandidas de plántulas de soja de 10 días. Para asegurarse de que cuando una muestra dé un alto rendimiento de protoplastos, recoja al menos tres muestras de hojas unifoliadas en etapas de desarrollo ligeramente diferentes. Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de cada hoja unifoliada y luego corte los restos en tiras de 0,5 a un milímetro.

Con un par de pinzas, transfiera suavemente las tiras de hojas inmediatamente a 10 mililitros de solución enzimática recién preparada en un tubo de 15 mililitros. Aspire las tiras de hojas al vacío durante 15 minutos a temperatura ambiente. Incubar las tiras de hojas en la solución enzimática con una agitación suave con poca luz durante cuatro a seis horas a temperatura ambiente.

A medida que se liberan los protoplastos, la solución enzimática se volverá de color amarillo verdoso. Compruebe la solución de protoplasto enzimático bajo el microscopio con un aumento de 10x para seleccionar la muestra con la mejor digestión del protoplasto. Los protoplastos liberados tienen forma esférica, mientras que las células no digeridas tienen formas irregulares u ovaladas.

Para detener la digestión, vierta suavemente los 10 mililitros de la solución de enzima protoplast con la mejor digestión de protoplast en un tubo de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de solución W5 a temperatura ambiente. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces. Luego, vierta suavemente la solución de enzima protoplast en una malla de nailon limpia de 75 micras colocada encima de un tubo de 50 mililitros para eliminar los tejidos de las hojas no digeridos.

A continuación, centrifugue el flujo a través de la solución de protoplasto enzimático a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar suavemente el sobrenadante sin alterar la pastilla de protoplasto. Vuelva a suspender el protoplast en una solución W5 refrigerada y mantenga el tubo de 50 mililitros en hielo.

Después de contar el número de protoplastos en un hemocitómetro bajo el microscopio, diluya a una concentración de dos veces 10 a la quinta cantidad de protoplastos por mililitro en una solución W5 refrigerada. Mantenga el protoplast en hielo durante 30 minutos. Centrifugar la suspensión a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.

A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para retirar suavemente la solución W5 sin alterar el pellet de protoplasto. Vuelva a suspender el protoplasto en solución de MMG a temperatura ambiente a una concentración de dos veces 10 al quinto protoplastos por mililitro. Para preparar el protoplasto para la transformación, utilice puntas de pipeta de 200 microlitros sin cortar para hacer alícuotas de 100 microlitros de protoplastos en tubos de microcentrífuga de baja adherencia de 1,5 mililitros.

Apartar una alícuota para que sirva de control negativo. A la alícuota restante de protoplastos, agregue 10 microlitros de ADN plasmídico. Agregue lentamente 110 microlitros de solución de clavija recién preparada en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, invierta y gire suavemente el tubo hasta que la solución se vuelva homogénea. Incubar las mezclas de transformación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para detener la transformación, agregue lentamente 400 microlitros de solución W5 a cada tubo de 1,5 mililitros a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución se vuelva homogénea.

Centrifugar los tubos a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Agregue un mililitro de solución de WI a cada tubo.

Cubra la superficie de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos para evitar que los protoplastos se adhieran a la placa. Agregue un mililitro de suero estéril para terneros al cinco por ciento a cada pocillo y, después de unos segundos, retire el suero para terneros con una pipeta. Transfiera los protoplastos resuspendidos a los pocillos de la placa de cultivo y cubra la placa con una tapa.

Antes de la cosecha, incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante dos días en la oscuridad. Después de dos días, transfiera la solución de protoplast a un tubo de microcentrífuga de baja adherencia de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.

Retire el sobrenadante con una pipeta. Transfiera 10 microlitros de protoplasto a un portaobjetos de vidrio. Observe las señales fluorescentes bajo microscopía de fluorescencia o confocal utilizando protoplastos no transformados como control negativo.

Se prepararon células de Protoplast a partir de diferentes órganos de soja de 10 días de edad y se observaron bajo el microscopio. Las paredes celulares de la hipocaudal y la epicaudal apenas fueron digeridas. Y algunas células permanecieron unidas unas a otras.

En el plomo caudal y la raíz, las paredes celulares se eliminaron solo en una pequeña porción de las células. Por el contrario, se observó un gran número de protoplastos cuando se utilizó unifoliado. Las plántulas en esta foto de izquierda a derecha ilustran hojas unifoliadas que no están expandidas, solo expandidas o completamente expandidas.

Si bien tanto las hojas unifoliadas no expandidas como las recién expandidas dieron como resultado altos rendimientos de protoplastos, el tamaño de los protoplastos del unifoliado recién expandido fue más uniforme que el del unifoliado no expandido. Para el unifoliado completamente expandido, las paredes celulares seguían intactas en la mayoría de las células. Las pruebas de una variedad de diferentes cantidades de ADN plasmídico sugirieron que cantidades más grandes de ADN resultaron en una mayor eficiencia de transformación.

Las imágenes confocales de protoplastos de soja transformados con el constructo que expresa GFP fusionado con el gen E1 específico de la leguminosa, mostraron la localización nuclear de la proteína de fusión E1 GFP, en consonancia con el estudio previo utilizando el sistema de protoplastos Arabidopsis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar empíricamente cada condición experimental, como la selección de la etapa correcta del material foliar, la duración del tiempo de digestión de la pared celular, la edad de concentración y la cantidad de ADN plasmídico para la transformación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la replicación de ARN y proteínas, para responder a preguntas adicionales como ¿qué genes o qué proteínas están regulados o no regulados?

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener células de protoplasto de soja de alta calidad.