Name: Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a aislar protoplastos de soja mediante digestión enzimática de hojas unifoliadas. Este método simple permite estudiar mecanismos reguladores y señalización celular en plantas vivas.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. crecimiento de las plantas
<ol><li>Sembrar semillas de soja de 5-10 (Williams 82) en una maceta de 13 cm en el invernadero bajo condiciones de día largo (16 h de luz en 1.500 μmol m-2 s-1) a 25 ° C en la mezcla de suelo personalizados para soja (el 1: relación 1:1 de arena de tierra, perlita y torpedo).</li>
</ol>2. preparación de plásmido ADN
<ol><li>Utilizando una pipeta estéril o palillo de dientes, elige una sola Colonia o stock de glicerol congelados de e.coli con el plásmido que contiene el gen de interés e inocular en medio líquido de 20 mL Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 mL.</li>
	<li>Incube el frasco a 37 ° C durante la noche en un agitador. Recoger las bacterias por centrifugación de la suspensión a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Extraer y purificar el plásmido siguiendo el procedimiento del fabricante de un kit de preparación de plásmido.</li>
</ol>3. aislamiento protoplasto
<ol><li>Cortar hojas unifolioladas recientemente ampliadas de plántulas de soja 10 - viejo (figura 1). Nota: Selección de hojas en una etapa de desarrollo apropiada es la clave del éxito para la preparación del protoplasto de soja. Utilice únicamente hojas sólo ampliados en las primeras etapas del desarrollo. Las hojas maduras, paredes celulares convertido en más difícil de digerir.</li>
	<li>Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de las hojas unifolioladas y luego corte los restos en 0.5-1 mm tiras. Nota: Dos hojas unifolioladas digeridos en 10 mL de solución de enzima dará suficientes protoplastos para transformaciones más de 10.</li>
	<li>Con un par de pinzas, transferencia de la hoja las tiras inmediatamente y con cuidado en 10 mL de solución recién preparada de la enzima (tabla 1) en un tubo de 15 mL. Vacío infiltra la hoja tiras durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube las tiras de la hoja en la solución de enzima con agitación suave (40 rpm) bajo condiciones de poca luz para 4-6 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de enzima convierte amarillo-verde protoplastos son liberados. Comprobar la solución de enzima/protoplastos bajo el microscopio (X10). Nota: El lanzado protoplastos son esféricos formado, mientras que las células sin digerir tienen forma oval o irregular.</li>
	<li>Transferir 10 mL de solución en un tubo de 50 mL de enzima/protoplasto vertiendo suavemente y añadir 10 mL de solución de W5 (tabla 1) a temperatura ambiente para detener la digestión. Invierta suavemente el tubo varias veces. Vierta suavemente la solución de enzima/protoplastos en una malla de nylon limpio 75 μm colocada encima de un tubo de 50 mL para remover los tejidos de la hoja sin digerir.</li>
	<li>Centrifugue la solución a través de flujo de enzima/protoplastos a 100 x g en el tubo de 50 mL durante 1-2 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL sin perturbar el pellet de protoplasto.</li>
	<li>Suspender los protoplastos y diluir a una concentración de 2 x 105 mL-1 en la solución de W5 refrigerada a 4 ° C por conteo de protoplasto en un hemacitómetro bajo el microscopio (x10). Mantenga los protoplastos en el hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 100 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente y suavemente Retire la solución de W5 con una pipeta de 1 mL sin perturbar el pellet de protoplasto. Resuspender los protoplastos en la solución MMG (tabla 1) en una concentración de 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.</li>
</ol>4. transformación de protoplasto
<ol><li>Hacer 100 alícuotas de μl de protoplastos (2 x 104 protoplastos en 2 x 105 mL-1) en tubos de microcentrífuga de adherencia baja 1,5 mL utilizando sin cortar puntas de la pipeta de 200 μl. Poner una alícuota a un lado para servir como control negativo. Añadir 10 μl del plásmido (10-20 μg) en cada uno de la alícuota del resto de protoplastos.</li>
	<li>Lentamente agregar 110 μl de solución recién preparada de PEG (tabla 1) en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego invierta suavemente y gire el tubo hasta que la solución sea homogénea.</li>
	<li>Incubar la mezcla de transformación a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Para detener la transformación, poco a poco añadir 400 μL de solución de W5 con el tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar el tubo a 100 g durante 1-2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución de WI (tabla 1) en el tubo y resuspender mediante pipeteo suave 1 - 2 veces. Añadir 1 mL de suero de ternera estéril (vol/vol) de 5% en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6 a capa de la superficie y evitar que los protoplastos se adhiera a la placa.</li>
	<li>Después de unos segundos, desechar el suero con una pipeta. Transferencia de los protoplastos resuspendidos en un pocillo de la placa de cultivo. Cubra la placa con una tapa.</li>
</ol>5. protoplasto incubación y cosecha
<ol><li>Incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante 1-2 días en la oscuridad. Nota: Hemos encontrado que dos días de incubación produce una señal más fuerte de la proteína fluorescente en general comparada con un día incubación, y que la señal de la proteína fluorescente puede durar hasta 3-4 días.</li>
	<li>Transferir la solución del protoplasto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja de la adherencia. Centrifugar el tubo a 100 x g por 1-2 min a temperatura ambiente para cosechar protoplastos. Quite el sobrenadante con una pipeta y transferir 10 protoplastos μl sobre un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Observar la señal fluorescente bajo fluorescencia o microscopía confocal. Uso no transforman protoplastos como control negativo (no hay señal debe observarse).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36,</s...

Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.
El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.
Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasa Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELULASA "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>ICN Biomédica</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td> BSA NEB R3535S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>malla de nylon</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr> placas <tr><td>de cultivo de tejidos USA</td><td>Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacitómetro</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen</td><td></td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET</td><td>Centrífuga Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>5810 Centrífuga</td><td>5811000827</td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Controlador de pipetas</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga antiadherentes, sin RNasa, 1,5 mL</td> Tubos de centrífuga <td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Denville</td><td></td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Serum para terneros recién nacidos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 16010159 <td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Vivero de Ingram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlita</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Arena</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Lennox (Polvo)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un método simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.

Diferentes órganos de soja 10 - viejo fueron probados para la preparación del protoplasto (figura 1) y rendimientos fueron observados bajo el microscopio (figura 2). Las paredes celulares de hipocótilo y epicotyl apenas fueron digeridas, y algunas células se quedaron conectadas entre sí (figura 2B, 2C). En el cotiledón (Figura 2D) y raíz (<strong class="...

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

El objetivo general de este método es obtener células de protoplasto de alta calidad a partir de la soja para examinar los mecanismos de regulación y señalización en células vivas de soja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las redes reguladoras, como cuál es su gen objetivo inmediato, el factor de transfusión abierto, y cuál es su compañero de interacción, la apertura de una proteína. La principal ventaja de esta técnica es el arte.Produce grandes cantidades de células uniformes de protoplasto de soja, y es simple y fácil. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es muy difícil obtener buenos protoplastos de las hojas de soja a menos que se unifolien en una etapa específica. La selección de las hojas en una etapa de desarrollo adecuada es la clave para una preparación exitosa del protoplasto de soja.Corte hojas unifoliadas recién expandidas de plántulas de soja de 10 días. Para asegurarse de que cuando una muestra dé un alto rendimiento de protoplastos, recoja al menos tres muestras de hojas unifoliadas en etapas de desarrollo ligeramente diferentes. Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de cada hoja unifoliada y luego corte los restos en tiras de 0,5 a un milímetro.Con un par de pinzas, transfiera suavemente las tiras de hojas inmediatamente a 10 mililitros de solución enzimática recién preparada en un tubo de 15 mililitros. Aspire las tiras de hojas al vacío durante 15 minutos a temperatura ambiente. Incubar las tiras de hojas en la solución enzimática con una agitación suave con poca luz durante cuatro a seis horas a temperatura ambiente.A medida que se liberan los protoplastos, la solución enzimática se volverá de color amarillo verdoso. Compruebe la solución de protoplasto enzimático bajo el microscopio con un aumento de 10x para seleccionar la muestra con la mejor digestión del protoplasto. Los protoplastos liberados tienen forma esférica, mientras que las células no digeridas tienen formas irregulares u ovaladas.Para detener la digestión, vierta suavemente los 10 mililitros de la solución de enzima protoplast con la mejor digestión de protoplast en un tubo de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de solución W5 a temperatura ambiente. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces. Luego, vierta suavemente la solución de enzima protoplast en una malla de nailon limpia de 75 micras colocada encima de un tubo de 50 mililitros para eliminar los tejidos de las hojas no digeridos.A continuación, centrifugue el flujo a través de la solución de protoplasto enzimático a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar suavemente el sobrenadante sin alterar la pastilla de protoplasto. Vuelva a suspender el protoplast en una solución W5 refrigerada y mantenga el tubo de 50 mililitros en hielo.Después de contar el número de protoplastos en un hemocitómetro bajo el microscopio, diluya a una concentración de dos veces 10 a la quinta cantidad de protoplastos por mililitro en una solución W5 refrigerada. Mantenga el protoplast en hielo durante 30 minutos. Centrifugar la suspensión a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para retirar suavemente la solución W5 sin alterar el pellet de protoplasto. Vuelva a suspender el protoplasto en solución de MMG a temperatura ambiente a una concentración de dos veces 10 al quinto protoplastos por mililitro. Para preparar el protoplasto para la transformación, utilice puntas de pipeta de 200 microlitros sin cortar para hacer alícuotas de 100 microlitros de protoplastos en tubos de microcentrífuga de baja adherencia de 1,5 mililitros.Apartar una alícuota para que sirva de control negativo. A la alícuota restante de protoplastos, agregue 10 microlitros de ADN plasmídico. Agregue lentamente 110 microlitros de solución de clavija recién preparada en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.A continuación, invierta y gire suavemente el tubo hasta que la solución se vuelva homogénea. Incubar las mezclas de transformación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para detener la transformación, agregue lentamente 400 microlitros de solución W5 a cada tubo de 1,5 mililitros a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución se vuelva homogénea.Centrifugar los tubos a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Agregue un mililitro de solución de WI a cada tubo.Cubra la superficie de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos para evitar que los protoplastos se adhieran a la placa. Agregue un mililitro de suero estéril para terneros al cinco por ciento a cada pocillo y, después de unos segundos, retire el suero para terneros con una pipeta. Transfiera los protoplastos resuspendidos a los pocillos de la placa de cultivo y cubra la placa con una tapa.Antes de la cosecha, incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante dos días en la oscuridad. Después de dos días, transfiera la solución de protoplast a un tubo de microcentrífuga de baja adherencia de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 100 veces G durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.Retire el sobrenadante con una pipeta. Transfiera 10 microlitros de protoplasto a un portaobjetos de vidrio. Observe las señales fluorescentes bajo microscopía de fluorescencia o confocal utilizando protoplastos no transformados como control negativo.Se prepararon células de Protoplast a partir de diferentes órganos de soja de 10 días de edad y se observaron bajo el microscopio. Las paredes celulares de la hipocaudal y la epicaudal apenas fueron digeridas. Y algunas células permanecieron unidas unas a otras.En el plomo caudal y la raíz, las paredes celulares se eliminaron solo en una pequeña porción de las células. Por el contrario, se observó un gran número de protoplastos cuando se utilizó unifoliado. Las plántulas en esta foto de izquierda a derecha ilustran hojas unifoliadas que no están expandidas, solo expandidas o completamente expandidas.Si bien tanto las hojas unifoliadas no expandidas como las recién expandidas dieron como resultado altos rendimientos de protoplastos, el tamaño de los protoplastos del unifoliado recién expandido fue más uniforme que el del unifoliado no expandido. Para el unifoliado completamente expandido, las paredes celulares seguían intactas en la mayoría de las células. Las pruebas de una variedad de diferentes cantidades de ADN plasmídico sugirieron que cantidades más grandes de ADN resultaron en una mayor eficiencia de transformación.Las imágenes confocales de protoplastos de soja transformados con el constructo que expresa GFP fusionado con el gen E1 específico de la leguminosa, mostraron la localización nuclear de la proteína de fusión E1 GFP, en consonancia con el estudio previo utilizando el sistema de protoplastos Arabidopsis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar empíricamente cada condición experimental, como la selección de la etapa correcta del material foliar, la duración del tiempo de digestión de la pared celular, la edad de concentración y la cantidad de ADN plasmídico para la transformación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la replicación de ARN y proteínas, para responder a preguntas adicionales como ¿qué genes o qué proteínas están regulados o no regulados?Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener células de protoplasto de soja de alta calidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.

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Aprenda a aislar protoplastos de soja mediante digestión enzimática de hojas unifoliadas. Este método simple permite estudiar mecanismos reguladores y señalización celular en plantas vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

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