Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

El objetivo general de este procedimiento es producir modelos moleculares de alta precisión de virus o complejos macromoleculares mediante la aplicación de análisis de una sola partícula a imágenes de superresolución de estructuras con componentes marcados con fluorescencia. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la virología, incluida la arquitectura proteica de los virus complejos y cómo cambia durante el curso de la infección. La principal ventaja de esta técnica es que al recopilar múltiples imágenes de la misma estructura se hace posible generar un mapa de alta precisión de sus componentes.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura de los virus, también se puede aplicar a otros sistemas, como otros patógenos y complejos macromoleculares dentro de las células de mamíferos. En primer lugar, obtenga imágenes de la muestra con microscopía de fluorescencia de superresolución. Adquiera imágenes de varios campos de visión que contienen cientos o miles de partículas bien separadas sin estructuras fluorescentes no deseadas.

Una vez que se hayan obtenido y procesado las imágenes, importe y concatene las imágenes en una pila con canales intercalados. Si es necesario, convierta la imagen concatenada de una hiperpila a una pila. A continuación, seleccione "Extraer estructuras virales" en el submenú VirusMapper y establezca la ruta del archivo para las partículas extraídas.

Rellene el número de canales de fluorescencia de los que se ha obtenido la imagen. Establezca el canal de referencia en el canal de fluorescencia en el que las partículas tienen el aspecto más consistente. Si esas partículas carecen de un máximo central, aplique un desenfoque gaussiano de detección previa para inducir la aparición de uno.

A continuación, estime el diámetro en píxeles de las partículas más grandes. Establezca el radio de ROI en un poco más de la mitad de ese valor. Calcule el número de ROI necesarios por fotograma.

No utilices más de cien ROI inicialmente. Establezca la superposición máxima de ROI en función de la separación de partículas. Obtenga una vista previa del retorno de la inversión de ese fotograma.

Ajusta el radio, el número de ROI y la superposición máxima para que cada partícula del fotograma quede encerrada en una sola ROI. Asegúrese de que el ROI sea al menos unos pocos píxeles más ancho que las partículas más grandes. Luego, haga clic en Aceptar" para ejecutar la segmentación.

Cierre la imagen de muestra en el administrador de ROI después de la extracción. No cambie el nombre de los conjuntos de partículas extraídos. Seleccione "Generar semillas" y abra la carpeta que contiene los datos de partículas extraídos.

Establezca el canal de referencia y seleccione todos los canales para los que se debe generar una semilla. Si es necesario para que coincida con los modelos anteriores, gire las semillas noventa grados. Para los canales en los que las partículas carecen de un máximo central, aumente el valor de desenfoque gaussiano de prealineación como antes.

Si los canales no están estrechamente alineados, habilite la corrección de desplazamiento para los canales que no son de referencia. Busque en la secuencia de partículas una estructura que aparezca de forma coherente. Identifique una partícula representativa e introduzca el número de fotograma correspondiente en el campo "Fotogramas a utilizar".

Revisa las semillas resultantes. La selección de semillas es una etapa crítica de este procedimiento. Observe los datos sin procesar cuidadosamente para identificar una o varias estructuras que se van a modelar.

La calidad del modelo depende en gran medida de la elección de semillas que reflejen con precisión estas estructuras. Ajuste el canal de referencia, el radio de desenfoque gaussiano y la corrección de desplazamiento según sea necesario para optimizar la identificación de fotogramas adicionales con valores de inicialización similares. Continúe agregando fotogramas y ajustando los parámetros de generación hasta que la estructura promedio represente mejor una estructura observada en los datos.

Introduzca el nombre de la carpeta y el prefijo de archivo para las semillas. Haga clic en Aceptar" para guardar las imágenes iniciales para su posterior modelado. Seleccione "Generar modelos basados en semillas" y abra la carpeta de partículas extraídas.

Cargue los promedios de inicialización para cada canal. Si realiza la detección de estructuras basadas en referencias, seleccione un canal de referencia para la alineación. La estructura de partícula conocida en un canal se puede utilizar como referencia para alinear un segundo canal desconocido.

Esto permite un mapeo imparcial de la estructura desconocida. Tenga en cuenta que el cambio cromático entre canales debe corregirse de antemano. Si el análisis busca pequeñas diferencias o características sutiles en el modelo, seleccione Intensidad de imagen cuadrada durante la coincidencia de plantillas.

Establezca la similitud mínima entre el sesenta y el ochenta por ciento, y el número de iteraciones en uno. Seleccione los modelos y las partículas que se mostrarán durante el cálculo y genere los modelos de vista previa. Inspeccione los modelos de vista previa.

Aumente la similitud mínima para incluir solo las partículas con la morfología deseada. Optimice otros parámetros de cálculo del modelo según sea necesario y seleccione elementos adicionales en el proceso de generación del modelo para mostrarlos si lo desea. Una vez que los modelos de vista previa sean satisfactorios, aumente el número de iteraciones a diez.

Establezca el nombre de la carpeta y el prefijo del archivo. Haga clic en Aceptar" para guardar las pilas de evolución del modelo que contienen todas las iteraciones del modelo final. Se obtuvieron imágenes de un virus Vaccinia recombinante con dos proteínas marcadas con proteínas fluorescentes verdes y rojas mediante microscopía de iluminación estructurada y se modelaron con el complemento VirusMapper.

Las semillas se generaron por separado para las orientaciones frontal y sagital, cada una promediada a partir de cinco partículas representativas. Dependiendo de la orientación del virus, se pueden distinguir uno o dos cuerpos laterales. Por lo tanto, se pueden generar modelos separados para las dos orientaciones.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los modelos depende en gran medida de la calidad de los datos sin procesar adquiridos. Si bien el análisis de una sola partícula puede aumentar la precisión, no puede compensar las imágenes de baja calidad. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar una cuantificación adicional o un ajuste del modelo en estos modelos.

Esto puede ayudar a responder preguntas adicionales específicamente en torno a, por ejemplo, los cambios a escala nanométrica en la arquitectura viral durante la infección. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el software de análisis de una sola partícula VirusMapper para generar modelos de arquitectura molecular a partir de imágenes de superresolución.