Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette AAVS1 Locus

El objetivo general de este procedimiento es realizar una edición genómica dirigida rápida y eficiente en el AAVS1 de células madre pluripotentes humanas, o PSC humanas, utilizando un enfoque de flippasa, intercambio de casetes mediado por recombinasa o RMCE. RMCE mejora la inserción de una secuencia en el locus AAVS1, lo que es de gran importancia para la biología de las células madre, ya que permite realizar pruebas rápidas de la función de una molécula por sobreexpresión o knockdown. La principal ventaja de esta técnica es que las líneas de PSC humanas libres de eventos de integración aleatoria, aún pluripotentes y cuando los cariotipos normales se pueden crear en tan solo 15 días.

Este método proporciona una herramienta útil para la transgénesis, en el locus AAVS1, pero también se puede aplicar a otros loci permisivos humanos. Para empezar, se cultivan líneas celulares maestras de PSC humano bajo procedimientos estándar con o sin fibroblastos embrionarios de ratón inactivados o iMEFs, en placas de seis pocillos. Cuando las células alcanzan el 60% al 70% de confluencia de placas, iMEFs resistentes a los medicamentos utilizando primero una solución de gelatina al 0,1% para cubrir los pocillos necesarios de una placa de 12 pocillos e incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, coloque 125.000 iDR4 por pocillo e incube los cultivos durante la noche con medio iMEF. Al día siguiente, preincube los cultivos humanos de PSC con medio fresco que incluya 10 inhibidores micromolares de ROCK a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras tanto, lleve la solución de transfección ESC humana y el agente de disociación celular a temperatura ambiente.

Prepare un mililitro de medio de recubrimiento de nucleofección por condición de nucleofección. Luego, retire el medio iDR4 de los pocillos, use un mililitro de PBS a temperatura ambiente para lavar las células y agregue el medio de recubrimiento de nucleofección. Transfiera 500 microlitros por muestra de medio de siembra a tubos estériles de 1,5 mililitros y almacene a 37 grados centígrados hasta el enchapado.

Para separar las PSC humanas en una suspensión de una sola célula, retire el medio, use PBS a temperatura ambiente para lavar las celdas y agregue un mililitro de tripsina al 0,05% o Accutase en cultivos de hPSC alimentadores o sin alimentador, respectivamente. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados. A continuación, retire con cuidado la placa de la incubadora y, sin permitir que las células se desprendan, aspire el agente de disociación y agregue 1 mililitro de medio PSC humano.

Disocie las células sueltas enjuagando suavemente el medio en la superficie de la placa evitando la formación de espuma. Recoja las células en una suspensión de una sola célula en un tubo limpio y estéril de 15 o 50 mililitros. A continuación, utilice 1 mililitro de medio hESC para lavar las células y recogerlas en el mismo tubo.

Tome una alícuota de 50 microlitros de suspensión celular para contar y centrifugar las celdas restantes a 300 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cuente las células con un dispositivo de conteo de células mientras la suspensión está en centrifugación. Retire el sobrenadante y use PBS a temperatura ambiente para resuspender suavemente el color de la celda a 10 a la sexta celda por mililitro.

A continuación, transfiera dos mililitros por condición experimental a tubos estériles limpios de 15 mililitros y repita la centrifugación. Mientras las muestras están girando, prepare mezclas de plásmidos en tres tubos limpios de 1,5 mililitros con proporciones moleculares de flippasa donante 0:1, 2:1 y 2:0 utilizando 2,5 microgramos de plásmido flippasa. Para proceder con la nucleofección, retire la placa iDR4 y el tubo de 1,5 mililitros con medio de recubrimiento de la incubadora.

Un tubo a la vez, sin alterar el pellet, pipetee cuidadosamente el PBS, eliminando la mayor cantidad posible de tampón. Utilice 100 microlitros de solución de transfección para resuspender el pellet pipeteando suavemente. A continuación, transfiera la suspensión celular al tubo de 1,5 mililitros que contiene las mezclas de plásmidos y mezcle suavemente.

Transfiera la mezcla de ADN celular a la cubeta transmisora, prestando atención a no introducir burbujas. Inserte la cubeta en el dispositivo nucleofector y ejecute el programa A13 para células cultivadas en alimentadores o F16 para la transfección sin alimentador. Retire la cubeta y utilice las pipetas de transferencia desechables del kit para añadir 0,5 mililitros de medio de recubrimiento en la cubeta de forma suave, rápida y con un solo movimiento.

Luego, recupere el volumen de la misma manera y póngalo gota a gota en la placa de 12 pocillos que contiene el iDR4 y el medio de recubrimiento. Coloque la placa de cultivo en un estante de la incubadora y muévala lentamente hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente la suspensión celular. Incubar la placa durante 24 horas antes de cambiar el medio.

Dos o tres días después de la transfección, iniciar la selección. Aspire el medio, use 1 mililitro de PBS para lavar las células, luego agregue medio ESC humano con 100 nanogramos por mililitro de puromicina. Observar el crecimiento celular y aumentar la concentración de puromicina en consecuencia hasta un máximo de 250 nanogramos por mililitro, continuando la selección de puromicina durante siete días.

Después de tres a cuatro días de selección de puromicina, comience la selección con fialuridina de 0,5 micromolares o FIAU. Cambie el medio diariamente y mantenga la FIAU por no más de siete días continuos. Después de completar la selección, alrededor de los días 14 a 15, las colonias de RMCE resistentes estarán presentes y constituirán la nueva línea de RMCE.

Divida las celdas en una proporción de 1:2 siguiendo los procedimientos estándar. Cuando los pocillos de la Llave 1 estén listos para dividirse, disocie el pocillo para su caracterización en una suspensión de una sola celda como se describe anteriormente en el video y recoja las celdas en un tubo de 15 mililitros. Gire las celdas a 300 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego, use un mililitro de PBS para resuspender las células y divida la muestra en dos. Uno filtrado mediante un colador celular para realizar la citometría de flujo y el otro para el análisis de ADN según el protocolo de texto. Después de la transfección con flippasa recombinasa y el donante de tdT RMCE, las hPSC formaron pequeños grupos de células distribuidas uniformemente sobre la capa de MEF iDR4 y expresaron GFP constitutiva y tdT transitoria.

La selección positiva con puromicina favorece la inserción del donante RMCE, mientras que la selección negativa con FIAU selecciona solo para eventos de recombinación mediados por FRT que carecen de TK. Alrededor del sexto día después de la transfección, se pueden identificar pequeños grupos de células RMCE GFP negativas y tdT positivas. Como se ha demostrado aquí, las colonias de RMCE negativas para GFP y tdT positivas están presentes solo cuando se utilizan tanto el donante de RMCE como la flippasa, mientras que la RMCE no ocurre en ausencia de flippasa. La caracterización por citometría de flujo de las líneas RMCE recién generadas, que son las colonias de RMCE resistentes a puromicina y FIAU, combinadas en una población celular no clonal, confirma que el 100% de las células representan el fenotipo RMCE GFP negativo, tdT positivo.

Cuando se utilizan donantes de RMCE sin actividad registradora en hPSC, el 100% de las células son GFP negativas. La caracterización por PCR de la línea RMCE no clonal, demuestra el intercambio completo de casetes y que el programa de selección utilizado genera líneas libres de integración aleatorias, tanto del donante RMCE como del vector expresor de flippasa. En resumen, este método RMCE simplifica significativamente la edición de genes en hPSC para un locus definido en comparación con las nucleasas dirigidas.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 15 días. Por lo tanto, RMCE es una herramienta de edición génica muy rápida que permitirá realizar estudios comparativos en un entorno isogénico. Al utilizar este procedimiento, es importante tener eficiencias de transfección superiores al 30% y preformar el agente de selección de almacenamiento de núcleo adecuado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar RMCE en el locus AAVS1 de las PSC humanas y cómo caracterizar la línea recombinante.