Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

El objetivo general de esta técnica de citometría espectral es distinguir diferentes fluorocromos utilizando sus espectros completos de emisión. Además, este protocolo permite implementar la autofluorescencia como un parámetro independiente, lo que posibilita un análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y el desarrollo de la biología de células madre, como cómo identificar poblaciones celulares raras.

La principal ventaja de esta técnica es su capacidad única para analizar simultáneamente un gran número de parámetros y para manejar la autofluorescencia de tejidos sólidos. Aunque este método se utiliza para la preparación de una suspensión de células individuales derivada del intestino y del corazón, también puede aplicarse a otros órganos, como el pulmón, el músculo esquelético, el hígado, la grasa y el riñón. Para comenzar, aísle y lave el intestino delgado de un ratón adulto.

Luego, coloque el tejido sobre una toalla de papel y, utilizando tijeras afiladas, retire cuidadosamente las placas de Peyer. Abra el intestino cortándolo longitudinalmente y divídalo en fragmentos de un centímetro. A continuación, transfiera el tejido a un vaso de precipitados con 30 mililitros de HBSS suplementado con un 10 por ciento de suero de ternera fetal (FCS) e incube a 37 grados Celsius con agitación constante durante 30 minutos.

Una vez finalizada la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo plástico de 15 mililitros y vortexee vigorosamente durante cinco minutos. A continuación, incube la suspensión en hielo durante diez minutos para permitir que los fragmentos grandes, no disociados, sedimenten. Posteriormente, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugue las células a 120 ×g durante siete minutos.

Una vez pelotadas, suspendemos las células en diez mililitros de HBSS con un uno por ciento de FCS y las contamos utilizando una cámara de Neubauer. Antes de la tinción celular, transfiera un por diez a la sexta de células intestinales a un tubo de cinco mililitros para preparar un control negativo. Para preparar una muestra, agregue un por diez a la sexta de células intestinales, seguido de dos mililitros de HBSS con un uno por ciento de FCS, en un tubo nuevo de cinco mililitros y centrifugue la suspensión a 120 ×g, a cuatro grados Celsius, durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, suspendemos las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos. Envuelva el tubo con papel de aluminio e incube las células a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, agregue dos mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS a la muestra y centrifugue a 120 veces G, a cuatro grados Celsius, durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 200 microlitros de solución de yoduro de propidio a 0,5 microgramos por mililitro. Después de decapitar un embrión de ratón, sumerja su cuerpo en una placa de Petri forrada con una toalla de papel previamente humedecida y que contenga 50 mililitros de HBSS con un uno por ciento de FCS. Bajo un microscopio estereoscópico, realice una incisión en el lado derecho del tórax del embrión y abra cuidadosamente la cavidad torácica, evitando dañar el corazón.

Aproveche los grandes vasos y extraiga el corazón conectado a los pulmones y al timo. Transfiera los órganos a una placa de Petri de 35 mililitros llena con dos mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS. Luego, aísle el corazón de los órganos circundantes y del tejido conectivo.

Después de lavar el corazón, sumérjalo en un mililitro de solución enzimática precalentada y, utilizando fórceps finos y un escalpelo, triture el órgano en trozos de un milímetro cúbico bajo un estereomicroscopio. Añada un mililitro adicional de solución enzimática precalentada y transfiera el tejido fragmentado a un tubo de cinco mililitros con tapa. Incube la muestra en posición horizontal a 37 grados Celsius durante 15 minutos.

Una vez finalizada la incubación, homogenice el tejido mediante pipeteo repetitivo de la suspensión con una pipeta P1000. Luego, coloque las muestras, en posición vertical, a un lado hasta que los fragmentos de tejido no digerido sedimenten. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros.

Agregue dos mililitros de FCS al diez por ciento en HBSS y mantenga las células aisladas en hielo. A continuación, agregue dos mililitros de solución enzimática precalentada al tubo de cinco mililitros que contiene el sedimento del tejido no digerido, y continúe la digestión del tejido como se mostró anteriormente hasta que no se observe tejido residual. Centrifugue la suspensión celular obtenida a 120 ×g durante diez minutos.

Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de FCS al uno por ciento en HBSS, libre de cationes de calcio y magnesio. Para teñir las células cardíacas, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a los pocillos de una placa redonda de 96 pocillos. Centrifugue la placa a 480 ×g durante un minuto y deseche el sobrenadante.

A continuación, resuspenda las células cardíacas en 100 microlitros de la solución de anticuerpo. Envuelva la placa con papel de aluminio e incúbela a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, lave las células cardíacas con 200 microlitros de HBSS sin calcio ni magnesio que contenga FCS al uno por ciento, y centrifugue la suspensión a 480 ×g durante un minuto.

Luego, resuspenda las células en 200 microlitros de FCS al uno por ciento en HBSS libre de iones de calcio y magnesio, y transfiera la suspensión a un tubo de cinco mililitros previamente llenado con 200 microlitros de FCS al uno por ciento en HBSS libre de calcio y magnesio. Finalmente, agregue 400 microlitros de FCS al uno por ciento en HBSS libre de cationes de calcio y magnesio, que contenga 0,5 microgramos por mililitro de yoduro de propidio, y filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 70 micro. Para visualizar las células, cargue la muestra teñida en un citómetro de flujo y haga clic en vista previa; luego registre hasta dos veces diez a la sexta eventos en la muestra haciendo clic en adquirir.

En la pestaña de análisis, abra la ventana de paleta de colores y registre todos los parámetros estudiados agregando el fluorocromo junto con su marcador correspondiente. Asegúrese de incluir los parámetros de autofluorescencia y viabilidad. En la ventana de control, dentro de la lista de tubos, analice la primera muestra teñida individualmente que contiene perlas de compensación.

Luego, en la hoja de trabajo, haga clic en la herramienta de diseño de polígonos y delimite la población de microesferas en el gráfico FSC-SSC. Haga doble clic sobre la compuerta para crear un gráfico derivado de las microesferas seleccionadas. A continuación, delimite las microesferas positivas y negativas por separado.

Verifique la población hija seleccionada mediante la aplicación sucesiva de compuertas y la eliminación de valores atípicos en cada fracción positiva y negativa. Luego, cargue las compuertas negativas y positivas en la ventana de separación. A continuación, seleccione la muestra de células no teñidas en la lista de tubos y diseñe compuertas separadas para células autofluorescentes y no autofluorescentes.

Una vez definidas las compuertas negativas y positivas para todos los parámetros, incluida la autofluorescencia y la viabilidad, haga clic en calcular. Luego, aplique la separación de señales a las muestras analizadas. Para analizar los datos, seleccione las células en un gráfico de SSC frente a FSC y excluya las células muertas teñidas con yoduro de propidio.

Finalmente, determine las puertas para todas las poblaciones de interés. Aquí se presentan los resultados de los análisis de citometría de flujo y citometría espectral de las células aisladas del corazón fetal y marcadas con los anticuerpos anti-TER119, anti-CD45 y anti-Sca-1. Un subconjunto de células autofluorescentes fue detectado por dos citómetros convencionales, mientras que en la citometría espectral estas células no se definieron como autofluorescentes y se incluyeron en la población negativa para CD45 y TER119.

Las células identificadas mediante citometría de flujo convencional como autofluorescentes, pero no positivas para CD31, se analizaron posteriormente para la expresión de transcritos específicos de cardiomiocitos. Se encontraron altos niveles de troponina cardíaca y transcritos similares a los de miocitos atriales en la población de células autofluorescentes, lo que confirma que un gran subconjunto de cardiomiocitos se pasa por alto en la citometría de flujo convencional. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente ocho horas, si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que todos los pasos deben realizarse en hielo y de manera oportuna para asegurar que las células permanezcan viables. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar análisis de proteínas intracelulares y de marcadores superficiales adicionales para responder preguntas sobre vías moleculares específicas. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología y la biología del desarrollo o de células madre explorenolos y aíslen poblaciones raras de diferentes órganos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y teñir células procedentes de tejidos celulares, y cómo analizar la expresión de marcadores de superficie mediante citometría espectral de flujo, que supera las limitaciones derivadas de la autofluorescencia celular. No olvide que el trabajo con yoduro de propidio puede ser extremadamente peligroso, y que siempre deben tomarse precauciones, como el uso de EPP, al realizar este procedimiento.