Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

El objetivo general de esta técnica de citometría espectral es distinguir diferentes fluorocromos utilizando todos sus espectros de emisión. Además, este protocolo permite la implementación de la autofluorescencia como un parámetro independiente, lo que permite un análisis adecuado de las células aisladas de órganos sólidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología y el desarrollo de la biología de las células madre, como la forma de identificar poblaciones de células raras.

La principal ventaja de esta técnica es su capacidad única para analizar simultáneamente un gran número de parámetros y gestionar la autofluorescencia de tejidos sólidos. Aunque este método se utiliza para la preparación de una suspensión de una sola célula derivada del intestino y el corazón, también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón, el esqueleto, el músculo, el hígado, la grasa y el riñón. Para empezar, aísle y lave el intestino delgado de un ratón adulto.

Luego, coloque el pañuelo sobre una toalla de papel y, con unas tijeras afiladas, retire con cuidado los parches de Peyer. Abre el intestino cortándolo longitudinalmente y divídelo en trozos de un centímetro. Luego, transfiera el tejido a un vaso de precipitados lleno de 30 mililitros de HBSS suplementado con un diez por ciento de FCS, e incube a 37 grados centígrados con agitación constante durante 30 minutos.

Una vez completada la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de plástico de 15 mililitros y vórtela vigorosamente durante cinco minutos. Luego, incube la suspensión en hielo durante diez minutos para permitir que los fragmentos grandes no disociados se sedimenten. Después, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y haga girar las células a 120 veces G durante siete minutos.

Una vez peletizadas, suspendemos las celdas en diez mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS y las contamos utilizando una cámara de Neubauer. Antes de la tinción celular, transfiera una vez diez a la sexta célula intestinal a un tubo de cinco mililitros para preparar un control negativo. Para preparar una muestra, agregue una vez diez a la sexta de células intestinales, seguida de dos mililitros de HBSS con uno por ciento de FCS a un nuevo tubo de cinco mililitros y centrifugar la suspensión a 120 veces G, a cuatro grados Celsius, durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, suspendemos las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos. Envuelva el tubo con papel de aluminio e incube las células a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, añadir dos mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS a la muestra y centrifugarla a 120 veces G, cuatro grados centígrados, durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de 0,5 microgramos por mililitros de solución de yoduro de propidio. Después de decapitar un embrión de ratón, sumerja su cuerpo en una placa de Petri, forrada con una toalla de papel prehumedecida y rellénela con 50 mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS. Bajo un microscopio estereoscópico hacer una incisión en el lado derecho del pecho del embrión y abrir cuidadosamente el tórax, evitando dañar el corazón.

Agarra los grandes vasos y saca el corazón conectado a los pulmones y al timo. Transfiera los órganos a una placa de Petri de 35 mililitros llena de dos mililitros de FCS al uno por ciento en HBSS. Luego, aísle el corazón de los órganos circundantes y del tejido conectivo.

Después de lavar el corazón, sumérjalo en un mililitro de solución enzimática precalentada y, con pinzas finas y un bisturí, triture el órgano en trozos de un milímetro cúbico bajo un microscopio estereoscópico. Agregue un mililitro adicional de solución enzimática precalentada y transfiera el tejido fragmentado a un tubo tapado de cinco mililitros. Incubar la muestra en posición horizontal a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Una vez finalizada la incubación, homogeneizar el tejido mediante pipeteo repetitivo de la suspensión con una pipeta P1000. A continuación, coloque las muestras, colocadas verticalmente, a un lado hasta que los fragmentos de los tejidos no digeridos se sedimenten. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros.

Agregue dos mililitros de FCS al diez por ciento en HBSS y mantenga las células aisladas en hielo. A continuación, agregue dos mililitros de solución enzimática precalentada al tubo de cinco mililitros que contiene el sedimento de tejido no digerido y continúe digiriendo el tejido como se muestra anteriormente hasta que no se observe ningún tejido restante. Centrifugar la suspensión celular obtenida a 120 veces G durante diez minutos.

Luego, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de FCS al uno por ciento en HBSS, libre de cationes de calcio y magnesio. Para teñir las células cardíacas, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Centrifugar la placa a 480 veces G durante un minuto y desechar el sobrenadante.

A continuación, vuelva a suspender las células cardíacas en 100 microlitros de la solución de anticuerpos. Envuelva la placa en papel de aluminio e incube a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Una vez completada la incubación, lavar las células cardíacas con 200 microlitros de FCS al uno por ciento en HBSS libre de calcio y magnesio, y centrifugar la suspensión a 480 veces G durante un minuto.

Luego, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de uno por ciento de FCS en HBSS libre de iones de calcio y magnesio, y transfiera la suspensión a un tubo de cinco mililitros prellenado con 200 microlitros de uno por ciento de FCS en HBSS libre de calcio y magnesio. Por último, añadir 400 microlitros de FCS al uno por ciento en HBSS libre de cationes de calcio y magnesio, que contienen 0,5 microgramos por mililitro de yoduro de propidio y filtrar la suspensión celular a través de una malla de nylon de 70 micro. Para visualizar las celdas, cargue la muestra teñida en una citometría de flujo y haga clic en vista previa, luego registre hasta dos veces diez hasta el sexto evento en la muestra haciendo clic en adquirir.

En la pestaña de análisis, abra la ventana de la paleta de colores y registre todos los parámetros estudiados agregando el fluorocromo junto con su marcador correspondiente. Asegúrese de incluir parámetros de autofluorescencia y viabilidad. En la ventana de control, dentro de la lista de tubos, analice la primera muestra teñida que contenga perlas de compensación.

Luego, en la hoja de trabajo, haga clic en la herramienta de diseño de polígonos y controle la población de cuentas en el gráfico FSC SSC. Haga doble clic en la puerta para crear un gráfico secundario de las cuentas cerradas. Y luego compuerta cuentas positivas y negativas por separado.

Verifique la población hija seleccionada mediante la activación sucesiva y la eliminación de valores atípicos en cada fracción positiva y negativa. A continuación, cargue las puertas negativa y positiva en la ventana de desmezcla. A continuación, seleccione la muestra de células sin teñir en la lista de tubos y diseñe puertas separadas para células autofluorescentes y no autofluorescentes.

Una vez que las puertas negativa y positiva estén definidas para todos los parámetros, incluida la autofluorescencia y la viabilidad, haga clic en calcular. A continuación, aplique la desmezcla a las muestras analizadas. Para analizar los datos, controle las células en un gráfico de SSC frente a FSC y excluya las células muertas teñidas con yoduro de propidio.

Por último, determine las puertas para todas las poblaciones de interés. Aquí se presentan los resultados de los análisis de citometría de flujo y citometría espectral de las células aisladas del corazón fetal y teñidas con anticuerpos anti-TER119, anti-CD45 y anti-Sca-1. Dos citómetros convencionales detectaron un subconjunto de células de autofluorescencia, mientras que en la citometría espectral estas células no se definieron como autofluorescentes y se incluyeron en la población CD45 TER119 negativa.

A continuación, se analizaron las células identificadas por citometría de flujo convencional como autofluorescentes, pero no las células positivas para CD31, para determinar la expresión de los transcritos específicos de los cardiomiocitos. Se encontraron altos niveles de troponina cardíaca y miocitos auriculares como transcripciones de tren en la población de células autofluorescentes, lo que confirma que un gran subconjunto de miocitos cardiovasculares se pasa por alto en la citometría de flujo convencional. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente ocho horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todos los pasos deben realizarse en hielo y de manera oportuna para garantizar que las células permanezcan viables. Siguiendo estos procedimientos, se pueden preparar proteínas intracelulares y análisis de marcadores de superficie adicionales para responder preguntas sobre vías moleculares específicas. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología y la biología del desarrollo o de células madre exploraran y aislaran poblaciones raras de diferentes órganos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y teñir células de tejidos celulares, y cómo analizar la expresión de marcadores de superficie mediante citometría de flujo espectral que supera las limitaciones resultantes de la autofluorescencia celular. No olvide que trabajar con yoduro de propidio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP mientras se realiza este procedimiento.