Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

El objetivo general de este procedimiento bioquímico es aislar fracciones enriquecidas con filamentos intermedios de múltiples tejidos de ratón con el fin de estudiar las modificaciones postraduccionales de las diferentes proteínas de filamentos intermedios específicos de tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los filamentos intermedios, como por ejemplo, cómo se ve afectada la función y la regulación de estas importantes proteínas del citoesqueleto que protegen contra el estrés durante el envejecimiento de los mamíferos. La principal ventaja de esta técnica es que la incorporación de un paso automatizado de lisis de tejidos permite a los usuarios procesar múltiples muestras de tejido de forma rápida y eficiente.

Para comenzar, agregue un mililitro de tampón Triton X-100 helado complementado con inhibidores de la proteasa en un homogeneizador de tubo de vidrio y colóquelo sobre hielo. Retire un pequeño trozo de tejido del almacenamiento de nitrógeno líquido y colóquelo directamente en el homogeneizador de vidrio. Luego, mientras mantiene el homogeneizador y la muestra en hielo en todo momento, use aproximadamente 50 golpes de una pastilla de politetrafluoroetileno para homogeneizar la muestra y minimizar la formación de burbujas.

Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros en hielo y centrifugue la muestra a 20.000 veces G en cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, recoja la fracción sobrenadante soluble Triton X en un tubo separado. Esta fracción se puede utilizar para la inmunoprecipitación y el análisis de la reserva soluble de detergente de proteínas de FI.

A continuación, añada al pellet de tejido un mililitro de tampón con alto contenido de sal suplementado con inhibidores de la proteasa. Transfiéralo a un homogeneizador limpio y rebote 100 golpes. Transfiera el homogeneizado de nuevo al tubo de microcentrífuga y coloque el tubo en un agitador giratorio en la cámara frigorífica durante una hora.

Centrifugar los homogeneizados a 20.000 veces G en cuatro grados centígrados durante 20 minutos y desechar el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón PBS EDTA helado al pellet y transfiéralo a un homogeneizador limpio como paso final de limpieza. Después de la homogeneización, transfiera la muestra a un nuevo tubo y centrifugue a 20.000 veces G en cuatro grados Celsius durante 10 minutos para obtener el extracto alto en sal rico en proteínas de FI, o HSC.

Deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 300 microlitros de tampón de muestra SDS precalentado no reductor. Rompa el pellet inicialmente mediante pipeteo y vórtice. Y luego calentar las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Vórtice y pipetee según sea necesario, para asegurarse de que el pellet se disuelva por completo, lo que puede tardar varios minutos. Almacene todas las muestras a 20 grados centígrados negativos hasta el análisis. Para llevar a cabo la extracción de ARN, agregue tampón de lisis en un tubo que contenga matriz de lisina D, luego agregue el tejido de muestra al lisador de tejido y pulse dos veces durante 25 segundos cada uno.

Separe el lisado de la matriz por centrifugación a 20.000 veces G. Para la extracción de proteínas, agregue Triton X-100 o tampón de muestra SDS si prepara el lisado total. En un tubo de lisina con matriz de lisina SS. A continuación, añada el tejido de muestra. Pulse la muestra brevemente para mezclarla.

Para preparar HSC, use un imán para quitar la perla de acero inoxidable del tubo y centrifugue los tubos a 20,000 veces G en cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Separe las fracciones del sobrenadante y de los gránulos y proceda como se demostró anteriormente en el video. Prepare el tampón PBST agregando 10 microlitros de T20 a 50 mililitros de PBS pH 7.4.

A continuación, prepare la solución de anticuerpos PTM añadiendo de uno a 10 microgramos de anticuerpo a 200 microlitros de PBST. Alícuota 50 microlitros de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga. Colóquelo en el imán y aspire la solución de almacenamiento de cuentas.

Conjugar las perlas con el anticuerpo de inmunoprecipitación resuspendiendo las perlas en la solución de anticuerpo e incubando la muestra en un rotador a temperatura ambiente durante 20 minutos. Coloque los tubos en el imán y aspire la solución de anticuerpos. A continuación, utilice 200 microlitros de PBST para enjuagar las perlas conjugadas con anticuerpos una vez y retire la solución.

Agregue de 0,6 a un mililitro del lisado de tejido a las perlas. Mezcle pipeteando suavemente e incube la solución en un rotador en una cámara fría durante tres horas. Coloque los tubos en el imán y retire el lisado, luego use 200 microlitros de PBST para lavar las cuentas cinco veces.

Después del último paso de lavado, recoja las perlas y 100 microlitros de PBS y transfiera las perlas a un tubo nuevo y limpio. Coloque el tubo en el imán y, a continuación, aspire el PBS. Retire el tubo del imán y agregue 100 microlitros de tampón de muestra no reductor.

Aliquot 50 microlitros del tubo, y combínalo con 5%2ME para hacer muestras reductoras. Caliente las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Con el tubo en el imán, recoja la fracción IP de las cuentas y transfiérala a un tubo nuevo.

Almacene las muestras a 20 grados centígrados negativos hasta el análisis. Para evitar la contaminación de las muestras de proteínas para el análisis de espectrometría de masas, utilice guantes limpios para manipular todos los geles e incubarlos en recipientes limpios que solo se hayan lavado con DD H2O. Ejecute de 20 a 50 microlitros de la muestra de HSE en un gel de página SDS de acuerdo con las condiciones estándar.

Después de teñir el gel de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el gel entre protectores de láminas de plástico. A continuación, escanee y marque las bandas que se extirparán. Utilice una navaja de afeitar nueva y limpia para extirpar las bandas de proteína IF y coloque las bandas en tubos de microcentrífuga limpios sobre hielo antes de enviarlas para el análisis de espectrometría de masas.

Esta figura muestra un resultado típico de HSEs de nueve tejidos de ratón aislados utilizando el método rápido. Tenga en cuenta que este método no funciona bien en el páncreas y el bazo, y produce bandas adicionales en una muestra de intestino grueso. Este análisis de expresión génica muestra que la queratina 8 está regulada al alza durante el envejecimiento.

Además, las transferencias occidentales muestran que la queratina 8 está fuertemente regulada en los hígados de los ratones viejos. Aquí, un HSE hepático obtenido utilizando el protocolo automatizado demuestra el fuerte enriquecimiento de queratinas 8 y 18 en el gel. El análisis de espectrometría de masas muestra que K8 y K18 en el hígado de un ratón viejo tienen múltiples sitios de fosforilación y acetilación que no están presentes en el hígado del ratón joven.

De manera similar a los cambios de queratina en el hígado, el análisis del tejido cerebral por QPCR revela una inducción cinco veces mayor de ARNm de GFAP en los cerebros de ratones de 24 meses de edad en comparación con los de tres meses de edad. Por último, el análisis de proteínas de los extractos con alto contenido de sal mediante tinción de Coomassie y las inmunotransferencias de fracciones totales y enriquecidas con acetil lisina revelan que la proteína GFAP está regulada al alza y acetilada en el cerebro del ratón envejecido. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la proteomezcla basada en espectrometría de masas, para responder a preguntas adicionales, como cuáles son las modificaciones postraduccionales importantes y los socios de unión de las proteínas de filamento intermedio durante diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar proteínas de filamentos intermedios de diferentes tejidos de mamíferos.