Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

El objetivo general de este experimento de ensayo de ligadura de proximidad es visualizar y cuantificar la formación de complejos de proteínas de reparación y respuesta al daño del ADN después de la inducción del daño en el ADN en cultivos celulares en suspensión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la reparación del daño del ADN, como la organización y regulación espacio-temporal y cómo las diversas vías de reparación responden a los diferentes tipos de daño del ADN. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente simple, requiere un número bajo de células y no requiere un procesamiento extenso, lo que puede interrumpir o alterar las interacciones proteína-proteína.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la reparación del ADN, la formación de complejos proteicos en células de suspensión de cultivo, también se puede aplicar en células adherentes cultivadas, tejidos congelados o incluidos en parafina, e incluso en animales enteros. En este estudio se utiliza la línea celular linfoblástica aguda de células b BCR humanas positivas, BV-173, y se cultiva en IMDM con suplementos a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de CO2. Coloque las células a dos veces 10 al sexto por mililitro en una placa de seis pocillos a cinco mililitros por pocillo.

Para detener las células en la fase G1 del ciclo celular, agregue cinco micromolares de metanosulfonato de amonio a cada pocillo e incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5% de CO2. Al día siguiente, agregue cinco micromolares de un inhibidor de ATM a cada uno de los dos pocillos y devuelva la placa a la incubadora durante 30 minutos. A continuación, inducir el daño en el ADN añadiendo 50 nanogramos por mililitro de NCS a uno de los pocillos que fue pretratado con el inhibidor de ATM y a otro pocillo que no fue pretratado.

Incubar durante dos horas. Prepare 1XPBS más 10%BSA colocando cinco gramos de fracción 5 de BSA encima de 50 mililitros de 1XPBS en un vaso de precipitados y déjelo reposar a temperatura ambiente sin agitar ni revolver hasta que el BSA se disuelva. Filtre lentamente la solución PBS más 10% BSA a través de un filtro de 0,22 micrómetros y manténgala en hielo.

Cosecha las células transfiriendo el contenido de cada pocillo a un tubo de 15 mililitros. Lave las celdas dos veces con 1XBPS helado. Después de contar las celdas, vuelva a suspender dos veces 10 a la sexta celdas por mililitro en 1XBPS más 10%BSA.

Mantén las células en hielo. Prepare los portaobjetos de microscopía para este procedimiento puliéndolos cuidadosamente con un pañuelo sin pelusa y desengrasándolos colocando un etanol al 96% en un frasco Coplin durante cinco minutos. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante 10 minutos.

Ensamble los portaobjetos de microscopía en los embudos de citología cytospin con un área de seis mililitros. Precubra los portaobjetos pipeteando 50 microlitros de 1XPBS más 10%BSA en cada embudo y centrífuga durante un minuto a 500 RPM. A cada embudo, agregue 100 microlitros de la suspensión celular y centrifugue a 500 RPM durante cinco minutos.

Desmonte con cuidado los embudos y asegúrese de no tocar los puntos de las correderas. Usa un bloqueador de líquidos con una punta de cinco milímetros para dibujar un círculo alrededor de cada punto. A continuación, añada 50 microlitros de solución de fijación de PFA al 4% en cada punto.

E incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lave las celdas con 1XPBS en un frasco Coplin a temperatura ambiente con una agitación suave. Lávese tres veces de esta manera durante cinco minutos cada vez.

Seque los portaobjetos alrededor de las manchas con un pañuelo sin pelusa y elimine la mayor cantidad de líquido posible de las manchas inclinando el portaobjetos y secando con un pañuelo sin pelusa. Añadir 50 microlitros de 0,25%Triton X en 1XPBS a cada punto e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitar. Lave los portaobjetos en 50 a 60 mililitros de TBS-T en un frasco Coplin a temperatura ambiente con agitación suave.

Tres veces durante cinco minutos cada vez. Antes de bloquear, retire el TBS-T y seque los portaobjetos alrededor de las manchas con un pañuelo sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido posible de la mancha.

Agite brevemente la solución de bloqueo y luego agregue una gota de aproximadamente 40 microlitros a cada punto. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada precalentada e incube durante una hora a 37 grados centígrados. Prepara los cócteles de anticuerpos.

Vierta en vórtice y luego pipetee el diluyente de anticuerpos comerciales en cada tubo de microfuga. Agregue el anticuerpo anti ATM de cabra a 1:1000. Y el anticuerpo antifosfoserina-15 p53 de conejo a 1:100.

Para los experimentos de control de anticuerpos individuales, prepare diluciones de anticuerpos que contengan solo el anticuerpo anti-ATM de cabra y solo el anticuerpo anti-fosfoserina-15 p53 de conejo. Al finalizar la incubación de una hora, golpee la solución de bloqueo, pero tenga cuidado de no dejar que las células se sequen. Agregue 30 microlitros de cada dilución de cóctel de anticuerpos e incube en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, lave los portaobjetos con 1X NC2 wash buffer A en un frasco Coplin a temperatura ambiente con una suave agitación dos veces durante cinco minutos cada vez. Después de lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado, retire el tampón de lavado de los portaobjetos y añada 30 microlitros de la mezcla de la sonda de ensayo de ligadura de proximidad en cada punto. Incubar a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada durante una hora.

Lave los portaobjetos con 50 a 60 mililitros de tampón de lavado A en un frasco Coplin a temperatura ambiente con una agitación suave. A continuación, prepare la solución de ligasa de ligadura en hielo añadiendo un microlitro de ligasa a 39 microlitros de solución de ligadura para cada punto. Agregue 40 microlitros de la solución de ligasa de ligadura a cada punto.

Incubar a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada durante 30 minutos. Lave los portaobjetos con tampón de lavado A en un frasco Coplin a temperatura ambiente con una agitación suave. Prepare la mezcla de polimerasa de amplificación en hielo.

Primero diluya la solución madre de amplificación de uno a cinco en agua. Y agregue 0,5 microlitros de polimerasa a 39,5 microlitros de solución de amplificación 1X para cada punto. Retire el tampón de lavado y agregue 40 microlitros de mezcla de polimerasa de amplificación por punto.

Incubar a 37 grados centígrados en una cámara humidificada precalentada durante 100 minutos. Al finalizar la incubación de 100 minutos, golpee la mezcla de polimerasa de amplificación y lave los portaobjetos con 1X NC2 wash buffer B en un frasco Coplin. A temperatura ambiente con agitación suave dos veces durante 10 minutos cada una.

Después de eso, lave los portaobjetos en el tampón de lavado B de 0.01x durante un minuto. Retire el exceso de tampón de lavado B y seque los portaobjetos alrededor de las manchas con un pañuelo sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido posible de la mancha.

Prepare el medio de montaje que contenga DAPI que no manche demasiado los núcleos diluyendo el medio de montaje que contiene DAPI 1:5 en el medio de montaje sin DAPI. Agregue de 25 a 30 microlitros del medio de montaje diluido que contiene DAPI a un cubreobjetos de 24 milímetros por 24 milímetros. Recoja el cubreobjetos con la corredera y aplique una ligera presión para asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas.

Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y espere al menos 15 minutos antes de tomar imágenes. Por último, tome imágenes y analice los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. El ensayo de ligadura de proximidad se utilizó para investigar la interacción entre ATM y fosfoserina 15 p53 en células positivas para BCR BV 173 humanas detenidas en la fase G1.

A diferencia de las células que no fueron tratadas con NCS para inducir daño en el ADN, la mayoría de las células tratadas con NCS tenían señales punteadas exclusivamente en el núcleo con un promedio de siete señales por célula. Esto indica que la inducción de daño en el ADN da lugar a la interacción entre ATM y fosfoserina 15 p53. El tratamiento previo de las células con un inhibidor específico de la quinasa ATM antes de la inducción del daño en el ADN disminuyó el número de señales a un promedio de dos señales por célula, lo que confirma que la fosforilación de p53 en el residuo serina 15 dependía de la actividad de la quinasa ATM.

Los experimentos de control de un solo anticuerpo en los que se emitió el anticuerpo anti ATM o el antifosfoserina 15 p53 no arrojaron ninguna señal como se esperaba. En esta figura se presenta la cuantificación y el análisis estadístico de los resultados que demuestran y confirman la especificidad de la técnica de ensayo de ligadura de proximidad en preparaciones de citospin de cultivos celulares en suspensión. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas cinco horas después de una incubación nocturna con un anticuerpo primario si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe valorar cuidadosamente el anticuerpo mediante tinción de inmunofluorescencia de las células de su interés antes de realizar el ensayo de ligadura de proximidad. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biología celular exploraran las interacciones transitorias entre proteínas y proteínas que son difíciles de evaluar utilizando métodos estándar como las inmunoprecipitaciones y las imágenes basadas en FRET, que a menudo dan lugar a artefactos técnicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo de ligadura de proximidad en cultivos celulares en suspensión para visualizar y cuantificar la interacción proteína-proteína in situ.