Name: Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda a detectar complejos proteicos de reparación de ADN en cultivos de células en suspensión mediante ensayo de ligación de proximidad. Este método visualiza interacciones ATM-p53 bajo estrés genotóxico.

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La investigación en el laboratorio de Guikema está financiada por el Programa de Incentivos a la Investigación Innovadora de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (VIDI grant 016126355) y el proyecto &quot;Stichting Kinderen Kankervrij&quot; KiKA (proyecto 252).

1. Tratamiento de las células y la inducción de daños en el ADN <ol><li> Cultivo de las líneas de células linfoblásticas agudas BCR-ABL + de células B BV173 o SUP-B15 en IMDM suplementadas con FCS al 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL y estreptomicina 100 μg / 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 . Contar las células y la placa a 2 x 106 células / ml en placas de 6 pocillos, a 5 ml / pocillo. NOTA: Opcionalmente, pueden usarse líneas celulares de suspensión de diversos orígenes. </li><li> Para detener las células BCR-ABL + B-ALL en la fase G1 del ciclo celular, añadir 5 μM de metanosulfonato de imatinib (STI571) e incubar durante la noche. <ol><li> Opcionalmente, omita este paso cuando se estudian las interacciones proteína-proteína a lo largo del ciclo celular o en tipos de células BCR-ABL-negativas. </li></ol></li><li> Inducir el daño del ADN añadiendo 50 ng / ml de neocarzinostatina (NCS) al cultivo, e incubar durante 2 h. <ol><li> Alternativamente,Inducen daño al ADN irradiando las células utilizando una fuente radiactiva [ 137 Cs] a 0,5 Gy / min, a una dosis de 5 Gy. Después de la irradiación, deje que la célula se recupere durante 2 h a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Opcionalmente, para evaluar la participación de la actividad de la cinasa ATM en respuesta al daño del ADN, añadir 5 μM del inhibidor de la cinasa ATM KU55933 antes de la adición de NCS o el tratamiento de irradiación. </li><li> Preparar 1x PBS + BSA al 10% por capas de 5 g de BSA de fracción-V sobre 50 ml de 1x PBS en un vaso de precipitados o un matraz Erlenmeyer, y dejar reposar a TA hasta que se disuelva la BSA. No agite ni agite ya que esto causará espuma extensa. Filtrar lentamente a través de un filtro de 0,22 μm y mantenerlo en hielo. </li><li> Se cosecha las células y se lava dos veces con 1x PBS enfriado con hielo. Contar las células y resuspender a 2 x 10 6 / mL en 1x PBS + 10% BSA. Mantenga las células en hielo. </li></ol> 2. Cytocentrifugation, la fijación y Permeabilization <ol><li> Prepara laSolución de paraformaldehído al 4% en 1x PBS recién. Añadir 2 g de PFA a 50 ml de 1x PBS e incubar en un baño de agua templado a 55 ° C hasta que la solución sea transparente. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a RT hasta su uso. NOTA: Opcionalmente, el fijador de PFA al 4% se puede almacenar congelado a -20 ° C. Después de congelar, descongelar sólo una vez para su uso. De lo contrario, la solución de PFA al 4% en PBS se puede comprar directamente. </li><li> Cuidadosamente pulir los portaobjetos de microscopía de 76 mm x 26 mm con tejido libre de pelusas y desengrase colocándolos en etanol al 96% en un frasco de Coplin durante 5 min. Deje que los portaobjetos de microscopia se sequen al aire durante 10 min. </li><li> Reúna los portaobjetos de microscopía en los embudos cytospin / citología con un área de 6 mm. Las placas de pre-capa se pipetean 50 μl de 1x PBS + BSA al 10% en cada embudo y se centrifuga durante 1 min a 500 rpm. </li><li> Añadir 100 μl de la suspensión celular (que equivale a 0,2 x 10 6 células) a cada embudo y centrifugar durante 5 min a 500 rpm. Para cada combinación de anticuerpos, alSe requieren 4 preparaciones (experimento de doble anticuerpo, dos controles de anticuerpo único, sin control de anticuerpos). </li><li> Desmonte cuidadosamente los embudos y asegúrese de no tocar los puntos. Proceder a la fijación de la muestra inmediatamente. <ol><li> Opcionalmente, deje que los portaobjetos se sequen al aire durante al menos 30 min. Después del secado al aire, envolver los portaobjetos individualmente en papel de aluminio y almacenar a -20 ° C hasta su uso. Cuando use preparaciones congeladas, asegúrese de descongelar las diapositivas envueltas en una toalla de papel para evitar la condensación manifiesta sobre las diapositivas. </li></ol></li><li> Dibuje un círculo (diámetro aproximado 15-20 mm) alrededor del punto usando un bloqueador de líquido de pluma PAP (punta de 5 mm). </li><li> Añadir 50 μl de solución de fijación de PFA al 4% a cada punto e incubar durante 30 min a TA. </li><li> Lavar las células 3 veces durante 5 min con 1x PBS en un frasco de Coplin a RT con agitación suave. </li><li> Seque las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusas y retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible utilizando un piMasaje sin tocar el punto, o inclinando la diapositiva. Añadir 50 μl de Triton-X al 0,25% en 1x PBS a cada punto e incubar durante 10 min a TA sin agitación. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces durante 5 min en ~ 50-60 mL de Tween-20 al 0,05% en TBS (TBS-T) en un recipiente Coplin a RT con agitación suave. 10 diapositivas se pueden procesar simultáneamente de esta manera. </li></ol> 3. Bloqueo e incubación de anticuerpos primarios <ol><li> Toque TBS-T y seque las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible usando una pipeta sin tocar el punto, o por inclinación de la diapositiva. Vórtice brevemente la solución de bloqueo y agregue una gota (~ 40 μL) a cada punto. Incubar durante 1 h a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada. </li><li> Preparar el cóctel de anticuerpos mezclando el cabra-anti-ATM a 1: 1.000 y el conejo-anti-fosfo-Ser15-p53 a 1: 100 en diluyente de anticuerpo comercial, diluyente de anticuerpo vortex antes de su uso. Para el control experimenSt, preparan diluciones de anticuerpos que contienen sólo el anticuerpo cabra-anti-ATM y solo el anticuerpo anti-fosfo-Ser15-p53 de conejo (controles de anticuerpo único). </li><li> Baje la solución de bloqueo, pero tenga cuidado de no dejar que las células se sequen antes de agregar las diluciones del anticuerpo. Añadir 30 μL de cada dilución de coctel de anticuerpos e incubar en una cámara humidificada durante la noche a 4 ° C. </li><li> Preparar el tampón de lavado A in situ y el tampón de lavado B disolviendo el contenido de una bolsa de tampón A y mezcla de tampón B en un volumen final de 1.000 ml de agua cada uno. <ol><li> Alternativamente, preparar el tampón de lavado A disolviendo 8,8 g de NaCl, 1,2 g de Tris-base y 0,5 ml de Tween-20 en 800 ml de agua. Ajustar el pH a 7,4 usando HCl y agregar a un volumen final de 1.000 mL. </li><li> Alternativamente, preparar el Tampón de lavado B disolviendo 5,84 g de NaCl, 4,24 de Tris-base y 26,0 g de Tris-HCl en 500 ml de agua. Ajustar el pH a 7,5 usando HCl. Añadir agua hasta un volumen final de 1.000 ml. </li><li> FiltrarAmbas soluciones a través de un filtro de 0,22 μm. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con 1x tampón de lavado in situ A en un recipiente Coplin a RT con agitación suave. </li></ol> 4. Sondas PLA, Ligación y Amplificación <ol><li> Preparar las sondas PLA diluyendo el anti-cabra PLUS y anti-conejo MINUS tanto 1: 5 en el diluyente de anticuerpos comerciales. Apriete 1x tampón de lavado in situ A de los portaobjetos y añada 30 μL de la sonda-mezcla de PLA a cada punto. Incubar 1 h a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada. NOTA: Se puede utilizar cualquier combinación de anticuerpos secundarios PLUS y MINUS PLA sondas (anti-ratón, anti-conejo, anti-cabra), siempre y cuando los anticuerpos primarios aplicados se planteen en diferentes especies, y la combinación de sondas PLA siempre debe ser Contienen una sonda PLUS y una sonda MINUS. </li><li> Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con ~ 50-60 mL 1x tampón de lavado in situ A en un frasco de Coplin a RT con agitación suave &lt;Li <li> Preparar la solución de Ligación-Ligasa en hielo añadiendo 1 μl de Ligasa a 39 μL de solución de Ligación y añadir 40 μl de solución Ligación-Ligasa a cada punto. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada previamente calentada. </li><li> Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con ~ 50-60 mL 1x tampón de lavado in situ A en un frasco de Coplin a RT con agitación suave. </li><li> Preparar la mezcla de Amplificación-Polimerasa en hielo, diluyendo la solución madre de Amplificación 1: 5 en agua. A continuación, añadir 0,5 μ l de polimerasa a 39,5 μ l de 1x solución de amplificación para cada punto. NOTA: Los reactivos de amplificación son sensibles a la luz y deben estar protegidos contra la exposición directa a la luz. El reactivo de amplificación viene en cuatro colores diferentes (ROJO: excitación 594 nm, emisión 624 nm, FarRED: excitación 644 nm, emisión 669 nm, ORANGE: excitación 554 nm, emisión 576 nm, VERDE: excitación 501 nm, emisión 523 nm), Asegúrese de que la configuración de microscopía disponible tenga sPropiedades de excitación y filtros para la imagen de estos colores. </li><li> Tapar el tampón de lavado A in situ 1x y agregar 40 μl de mezcla de Amplificación-Polimerasa por mancha. Incubar durante 100 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada. </li></ol> 5. Montaje e imágenes <ol><li> Preparar 0,01 x tampón de lavado in situ B añadiendo 1 mL de 1x Tampón de lavado B a 99 mL de agua. </li><li> Tapar la mezcla de Amplificación-Polimerasa y lavar los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos con 1x tampón de lavado in situ B en una jarra de Coplin a RT con agitación suave. </li><li> Lavar las diapositivas 1 min en tampón de lavado 0,01x B. </li><li> Tapar el exceso de tampón de lavado 0,01x B y secar las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible usando una pipeta sin tocar el punto, o por inclinación de la diapositiva. </li><li> Diluir el medio de montaje que contiene DAPI 1: 5 en medio de montaje sin DAPI para evitar la sobrecarga de los núcleos. </li><li> Añadir 25-30 μL de medio de montaje que contenga DAPI 1: 5 a un cubreobjetos de 24 mm x 24 mm y recoger el resbalón de la cubierta con la corredera, aplicar una ligera presión para asegurar que no haya burbujas de aire atrapadas. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y espere al menos 15 minutos antes de tomar imágenes. </li><li> Analizar las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia (confocal). <ol><li> Contar el número de señales puntuales de PLA por célula en al menos 4 campos de imagen adquiridos (objetivo 20x, contar al menos 20 células por condición o combinación de anticuerpos, basándose en un cálculo de potencia utilizando una media anticipada de 7 ± 5 señales en las células tratadas, Y 2 ± 2 señales en las células no tratadas, con una probabilidad de un error de tipo I de 0,05, y una potencia del 80%, como se informó anteriormente 15 ). NOTA: La mejor resolución se logra mediante la adquisición de una pila Z y la deconvolución utilizando paquetes de software ( por ejemplo , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). La señalLs debe ser fácilmente discernible dentro del perímetro nuclear, como se define por la tinción DAPI. </li><li> No cuente señales que aparezcan claramente fuera de los núcleos. Típicamente, el tratamiento con NCS o irradiación γ da como resultado aproximadamente 5 - 10 señales de PLA de phosho - p53 / ATM por célula. Los controles de &quot;solo anticuerpo&quot; pueden dar alguna señal de fondo, pero esto no debe exceder 1-2 señales de PLA por 1 de cada 20 células. </li><li> Para propósitos de publicación y presentación, capture imágenes usando un objetivo de aceite de inmersión 40X o 63X. Las diapositivas se pueden almacenar a 4 ° C y deben protegerse de la exposición a la luz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maréchal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).</li>
<li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li>
<li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li>
<li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li>
<li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li>
<li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sense+of+closeness%3A+protein+detection+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li>
<li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin%27s+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685(2014).</li>
<li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1%2F2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li>
<li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este informe, se demuestra que PLA se puede utilizar para determinar y visualizar la interacción específica entre proteínas en cultivos de células en suspensión. Es de notar que el protocolo descrito aquí no se limita al estudio de los complejos de reparación del ADN sino que también se aplica para visualizar y cuantificar otras interacciones proteína-proteína en cultivos de células en suspensión. Se muestra que la cinasa ATM interactúa con p53 fosforilada en células BCR-ABL + B-ALL bloqueadas con G1 cuando se expone...

El daño del ADN desencadena una serie altamente regulada de eventos que implican interacciones proteína-proteína y modificaciones postraduccionales que garantizan la rápida y eficiente reparación del ADN, salvaguardando así la integridad genómica 1 . Típicamente, la reparación del ADN se estudia en las células expuestas a la radiación ionizante mediante el control de la formación de los llamados focos inducidos por la radiación ionizante (IRIF) mediante microscopía de fluorescencia (confocal). Muchas proteínas de ADN de detección de daños y el ADN de ADN forman IRIFs, que representan complejos de proteínas que se nuclean en sitios de cromatina que sufren daño del ADN 2 , 3 . La localización y resolución de los IRIF a lo largo del tiempo proporciona una visión importante de la organización espaciotemporal de la reparación del ADN y puede indicar la participación de diferentes vías de reparación del ADN. La naturaleza del daño del ADN y la etapa del ciclo celular en la que se produce el daño determina qué vía de reparación del ADN está activada. Para<html> R, en las células que participan activamente en la replicación del ADN (fase S), la recombinación homóloga (HR) es la vía dominante de reparación del ADN, mientras que en las células en la fase G1 o G2 / M del ciclo celular, Predomina la vía de reparación homóloga de unión final (NHEJ). Uno de los eventos más tempranos después del daño en el ADN es la activación de las cinasas sensibles al daño del ADN Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que es principalmente activa en las fases G1 y G2 / M del ciclo celular y regula NHEJ, Y Ataxia Telangiectasia y proteína relacionada con Rad3 (ATR), que actúa en la fase S mediante la activación de la FC. Ambos ATM y ATR son muy pleiotrópicos quinasas que phosphorylate muchas proteínas que están involucrados en la reparación del ADN, la muerte celular y la supervivencia [ 4] . Se ha demostrado que ambas quinasas fosforilan y activan la proteína supresora de tumores p53 después de la exposición al estrés genotóxico, lo que indica que estas quinasas son mediadores aguas arriba de un eje pivotante de señalización supresora de tumores&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . La formación y composición de los IRIF se evalúa típicamente determinando la co-localización de diferentes proteínas usando tinción de inmunofluorescencia de doble color y microscopía, sin embargo, no todas las proteínas que forman parte de los complejos de proteínas de reparación forman IRIFs, lo que limita la aplicabilidad de este enfoque. Por otra parte, la microscopía de inmunofluorescencia (confocal) está limitada por las propiedades de difracción de la luz, dando como resultado una resolución espacial bastante pobre de aproximadamente 200-300 nm, que excede el tamaño de la mayoría de las estructuras subcelulares, lo que esencialmente prohíbe la interrogación directa de interacciones proteína-proteína en El nivel molecular. Como tal, la co-localización de patrones de tinción de inmunofluorescencia como detectado por microscopía de fluorescencia (confocal) no es necesariamente indicativo de interacciones directas proteína-proteína. Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías de super-resolución, tales como estructuras tridimensionales(3D-SIM) 7 , que se utilizó con éxito para estudiar la formación de 53BP1 y BRCA1 IRIF a escala nanométrica, revelando las características de distribución espacial de estas proteínas que no pudieron ser detectadas por microscopía confocal de barrido láser 8 . Varios otros métodos se pueden utilizar para detectar interacciones proteína-proteína in vivo , tales como co-immunoprecipitation, pull-down métodos y la levadura dos híbridos enfoques de selección. Sin embargo, estas técnicas son bastante engorrosas, requieren grandes cantidades de células o proteínas o implican sobreexpresión de proteínas, lo que introduce artefactos experimentales. Más recientemente, se ha desarrollado una técnica novedosa que permite la visualización y cuantificación de interacciones proteína-proteína in situ ( es decir, en células y en tejidos), que se denomina Ensayo de Ligación de Proximidad (PLA) 9,10. PrLos anticuerpos inmunes que reconocen dos proteínas de interés se detectan mediante anticuerpos secundarios que están conjugados con oligonucleótidos (denominadas sondas PLA). Si los dos anticuerpos secundarios diferentes están suficientemente cerca debido a interacciones entre las proteínas reconocidas por los anticuerpos primarios, los oligonucleótidos conjugados hibridan y pueden ligarse para formar un sustrato de ADN circular cerrado. Este sustrato circular se amplifica posteriormente mediante amplificación en círculo rodante y se visualiza con oligonucleótidos complementarios conjugados con fluorocromo. Utilizando PLA, la localización subcelular de la interacción proteína-proteína se conserva como el producto de amplificación de círculo rodante rotulado fluorescentemente sigue unido a las sondas PLA. La resolución de este ensayo es &lt;50 nm, basada en el hallazgo de que el diámetro de un anticuerpo es de aproximadamente 7-10 nm 11 . La amplificación del círculo rodante sólo puede tener lugar en caso de que dos pares de anticuerpos (primario + seconDario) interactúan físicamente dentro del perímetro que se define por su tamaño (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La etapa de amplificación de señal aumenta la sensibilidad del ensayo de PLA y permite la detección de interacciones de proteínas apenas expresadas. El PLA genera patrones puntuales de señales semejantes a focos que pueden ser cuantificados en una base por célula, por lo que se puede evaluar la variación intra e intercelular en las interacciones proteína-proteína. La formación y composición de complejos de reparación de ADN y IRIFs se estudia principalmente en líneas celulares adherentes tales como la línea de células epiteliales de osteosarcoma de hueso humano U2OS, la línea de células de riñón embrionario humano HEK293 y la línea de células epiteliales de pigmento retiniano RPE-1, Creciente y fácil de transfectar. Los cultivos de células en suspensión, tales linfocitos linfoides y mieloides, se usan menos frecuentemente, ya que son menos susceptibles de transfección y generalmente no se adhieren a cubreobjetos, lo queEps para imágenes. La resolución del daño del ADN es sin embargo muy relevante en el contexto de malignidades linfoides y mieloides, ya que la respuesta de daño del ADN es frecuentemente afectada por aberraciones genómicas (conductor) en estos tumores, desempeñando un papel fundamental en la transformación maligna de linfoides y mieloides normales Progenitor) 12 , 13 , 14 . Este protocolo describe cómo PLA se puede utilizar para evaluar y cuantificar las interacciones proteína-proteína después de la inducción del daño del ADN en cultivos celulares en suspensión. En este caso, el PLA se realiza para determinar y visualizar las interacciones entre ATM y p53 sobre el daño del ADN en células de leucemia de células B humanas que se induce a someterse a una fase G1-ciclo de detención del ciclo. De nota, el protocolo presentado aquí no se limita a estudiar ATM y p53 interacciones en G1-detenido leucemia células, pero también se puede utilizar para visualizar otros proteína interacción proteínaEn varios tipos de células y cultivos de células en suspensión.

<table><tbody><tr><td>Línea celular BV173</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ Línea celular B-ALL</td></tr><tr><td>Línea celular SUP-B15</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ Línea celular B-ALL</td></tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lote #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco (Vida Tecnologías)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib metanosulfonato</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Disolver en DMSO, preparar 10 mM solución madre</td></tr><tr><td>neocarzinostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagénico/teratogénico, manejar con cuidado</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Disolver en DMSO, preparar 5 mM de solución madre</td></tr><tr><td>Starfrost Portaobjetos de microscopía</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo PAP bloqueador de líquidos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Embudo Cytospin</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Cabra/Conejo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Disponible para diferentes especies/combinaciones, también disponible en FarRED, Naranja y Verde</td></tr><tr><td>cabra-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; Utilizamos con éxito el lote #A300-136A-1 en nuestros estudios</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>Utilizamos con éxito el lote #9284-4 en nuestros estudios</td></tr><tr><td>Medio de montaje antidecoloración Vectashield con DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medio de montaje antidecoloración</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído en PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>También disponible de varios otros proveedores</td></tr></tbody></table>

detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de adn en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

La respuesta al daño del ADN orquesta la reparación de las lesiones del ADN que se producen espontáneamente, son causadas por el estrés genotóxico, o aparecen en el contexto de las rupturas programadas de ADN en los linfocitos. La cinasa mutada (ATM), cinasa relacionada con ATM y Rad3 (ATR) y la subunidad catalítica de la Proteína Quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) están entre las primeras que se activan tras la inducción de daño al ADN, y son Reguladores centrales de una red que controla la reparación del ADN, la apoptosis y la supervivencia celular. Como parte de una vía supresora de tumor, ATM y ATR activar p53 a través de la fosforilación, por lo tanto, la regulación de la actividad transcripcional de p53. El daño del ADN también da lugar a la formación de los llamados focos inducidos por la radiación ionizante (IRIF) que representan complejos de sensor de daño del ADN y proteínas de reparación que se acumulan en los sitios de daño del ADN, que se visualizan mediante microscopía de fluorescencia. Co-localización de las proteínas en IRIFs, sin embargo, no implica necesariamente dInteracciones directas proteína-proteína, ya que la resolución de la microscopía de fluorescencia es limitada. El Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) es una técnica novedosa que permite la visualización directa de interacciones proteína-proteína en células y tejidos con una especificidad y sensibilidad sin precedentes. Esta técnica se basa en la proximidad espacial de los anticuerpos específicos que se unen a las proteínas de interés. Cuando las proteínas interrogadas están dentro de ~ 40 nm, una reacción de amplificación es desencadenada por oligonucleótidos que están conjugados con los anticuerpos, y el producto de amplificación se visualiza por marcaje fluorescente, produciendo una señal que corresponde a la localización subcelular de las proteínas que interactúan. Utilizando la interacción funcional establecida entre ATM y p53 como ejemplo, se demuestra aquí cómo PLA puede usarse en cultivos de células en suspensión para estudiar las interacciones directas entre proteínas que son partes integrales de la respuesta de daño del ADN.

Se demostró que la fosforilación de p53 en el resto Ser15 era dependiente de la actividad de cinasa ATM 16 . Para demostrar y confirmar la especificidad de la técnica de PLA en preparaciones de citospin de cultivos de células en suspensión, se muestra que la inducción del daño del ADN por 2 h de tratamiento con NCS de células BCR-ABL + B-ALL detenidas en la fase G1 del ciclo celular Resultó en la interacción específica entre ATM y fosfo-Ser15-p53, como se esperaba...

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

El objetivo general de este experimento de ensayo de ligación por proximidad es visualizar y cuantificar la formación de complejos de proteínas de respuesta y reparación del daño al ADN tras la inducción de daño al ADN en cultivos celulares en suspensión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la reparación del daño al ADN, como la organización espaciotemporal y regulación, y cómo diversas vías de reparación responden a diferentes tipos de daño al ADN. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente sencilla, requiere un bajo número de células y no necesita un procesamiento extenso, lo cual podría interrumpir o alterar las interacciones proteína-proteína.Aunque este método puede proporcionar información sobre la reparación del ADN y la formación de complejos proteicos en células en suspensión de cultivo, también puede aplicarse en células adherentes cultivadas, tejidos congelados o incluidos en parafina, e incluso en animales enteros. En este estudio se utiliza la línea celular de leucemia linfoblástica B positiva para BCR, BV-173, que se cultiva en IMDM con suplementos a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5 %CO2. Siembre las células a dos veces 10 a la sexta por mililitro en una placa de seis pocillos con cinco mililitros por pocillo.Para detener las células en la fase G1 del ciclo celular, agregue cinco micromolares de metanosulfonato de amonio a cada pocillo e incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5 %CO2. Al día siguiente, agregue cinco micromolares de un inhibidor de ATM a cada uno de dos pocillos y regrese la placa al incubador durante 30 minutos. A continuación, induzca daño en el ADN agregando 50 nanogramos por mililitro de NCS a uno de los pocillos que fue pretratado con el inhibidor de ATM y a otro pocillo que no fue pretratado.Incubar durante dos horas. Prepare PBS 1X más BSA al 10 % colocando cinco gramos de BSA fracción 5 encima de 50 mililitros de PBS 1X en un vaso de precipitados y déjelo reposar a temperatura ambiente sin agitar ni mezclar hasta que la BSA se disuelva. Filtre lentamente la solución de PBS más BSA al 10 % a través de un filtro de 0,22 micrómetros y manténgala sobre hielo.Recoger las células transfiriendo el contenido de cada pocillo a un tubo de 15 mililitros. Lavar las células dos veces con 1X BPS frío con hielo. Después de contar las células, resuspender a dos veces 10 a la sexta células por mililitro en 1X BPS más 10 % BSA.Mantenga las células en hielo. Prepare las láminas de microscopía para este procedimiento puliéndolas cuidadosamente con un tejido libre de pelusas y desengrasándolas colocando etanol al 96 % en un frasco de Coplin durante cinco minutos. Deje secar las láminas al aire durante 10 minutos.Monte las laminillas de microscopía en los embudos de citocentrifugación con una capacidad de seis mililitros. Recubra previamente las laminillas pipeteando 50 microlitros de PBS 1X más 10% de BSA en cada embudo y centrifugue durante un minuto a 500 RPM. Añada 100 microlitros de la suspensión celular a cada embudo y centrifugue a 500 RPM durante cinco minutos.Desarme cuidadosamente los embudos y asegúrese de no tocar las manchas en las laminillas. Utilice un bloqueador líquido con bolígrafo Pap con punta de cinco milímetros para dibujar un círculo alrededor de cada mancha. Luego agregue 50 microlitros de solución fijadora al 4% PFA a cada mancha.Y incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lavar las células con PBS 1X en un frasco Coplin a temperatura ambiente con agitación suave. Lavar tres veces de esta manera durante cinco minutos cada vez.Seque las laminillas alrededor de los puntos con un tejido libre de pelusas y elimine la mayor cantidad posible de líquido de los puntos inclinando la laminilla y secando con un tejido libre de pelusas. Añada 50 microlitros de Triton X al 0,25 % en PBS 1X a cada punto e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Lave las laminillas en 50 a 60 mililitros de TBS-T en un frasco de Coplin a temperatura ambiente con agitación suave.Tres veces durante cinco minutos cada vez. Antes del bloqueo, elimine el TBS-T golpeando suavemente y seque las laminillas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusa. Retire tanto líquido como sea posible de la mancha.Vortexe brevemente la solución bloqueadora y luego agregue una gota de aproximadamente 40 microlitros a cada punto. Coloque los portaobjetos en una cámara humedecida previamente calentada e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Prepare los cócteles de anticuerpos.Vortex y luego pipetee diluyente comercial de anticuerpos en cada tubo de microcentrífuga. Añada el anticuerpo de cabra anti-ATM en una dilución de 1:1000 y el anticuerpo de conejo anti-fosfoserina-15 p53 en una dilución de 1:100.Para los experimentos de control con un solo anticuerpo, prepare diluciones de anticuerpos que contengan únicamente el anticuerpo de cabra anti-ATM y únicamente el anticuerpo de conejo anti-fosfoserina-15 p53. Al finalizar la incubación de una hora, retire la solución de bloqueo teniendo cuidado de no dejar que las células se sequen. Añada 30 microlitros de cada dilución del cóctel de anticuerpos e incube en una cámara humedecida a cuatro grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, lave las laminillas con tampón de lavado A 1X NC2 en un frasco Coplin a temperatura ambiente con agitación suave, dos veces durante cinco minutos cada vez. Después de haber lavado las laminillas dos veces con el tampón de lavado A, elimine el tampón golpeando suavemente las laminillas y agregue 30 microlitros de la mezcla de sondas del ensayo de ligación por proximidad a cada punto. Incube a 37 grados Celsius en una cámara humedecida previamente calentada durante una hora.Lave las laminillas con 50 a 60 mililitros de tampón de lavado A en un frasco Coplin a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, prepare la solución de ligasa de ligación en hielo añadiendo un microlitro de ligasa a 39 microlitros de solución de ligación por cada punto. Añada 40 microlitros de la solución de ligasa de ligación a cada punto.Incubar a 37 grados Celsius en una cámara humedecida precalentada durante 30 minutos. Lavar las laminillas con tampón de lavado A en un frasco de Coplin a temperatura ambiente con agitación suave. Preparar la mezcla de polimerasa de amplificación sobre hielo.Primero, diluya la solución stock de amplificación de uno a cinco en agua. Añada 0,5 microlitros de polimerasa a 39,5 microlitros de solución de amplificación 1X por cada punto. Elimine el tampón de lavado y añada 40 microlitros de la mezcla de polimerasa de amplificación por cada punto.Incubar a 37 grados Celsius en una cámara humedecida y precalentada durante 100 minutos. Al finalizar la incubación de 100 minutos, desechar la mezcla de polimerasa de amplificación y lavar los portaobjetos con tampón de lavado B al 1X NC2 en un frasco de Coplin. Realizar dos lavados a temperatura ambiente con agitación suave, durante 10 minutos cada uno.A continuación, lave las laminillas en tampón de lavado B 0,01x durante un minuto. Elimine el exceso de tampón de lavado B y seque las laminillas alrededor de los puntos con un tejido libre de pelusas. Retire tanto líquido como sea posible del punto.Prepare un medio de montaje que contenga DAPI y que no sobreteña los núcleos diluyendo el medio de montaje con DAPI en una proporción de 1:5 en medio de montaje sin DAPI. Añada de 25 a 30 microlitros del medio de montaje diluido con DAPI sobre un cubreobjetos de 24 milímetros por 24 milímetros. Tome el cubreobjetos con el portaobjetos y aplique una ligera presión para asegurarse de que no queden burbujas de aire atrapadas.Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y espere al menos 15 minutos antes de realizar la imagen. Finalmente, obtenga imágenes y analice los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia confocal. El ensayo de ligación por proximidad se utilizó para investigar la interacción entre ATM y fosfoserina 15 p53 en células humanas BV 173 positivas para BCR-abl arrestadas en fase G1.En contraste con las células que no fueron tratadas con NCS para inducir daño en el ADN, la mayoría de las células tratadas con NCS presentaron señales punteadas exclusivamente en el núcleo, con un promedio de siete señales por célula. Esto indica que la inducción de daño en el ADN provoca la interacción entre ATM y p53 fosforilada en el residuo serina 15. El pretratamiento de las células con un inhibidor específico de la quinasa ATM antes de inducir el daño en el ADN reduce el número de señales a un promedio de dos por célula, lo que confirma que la fosforilación de p53 en el residuo serina 15 depende de la actividad de la quinasa ATM.Los experimentos de control con un solo anticuerpo, en los que se omitió ya sea el anticuerpo anti-ATM o el anticuerpo anti-fosfoserina 15 p53, no produjeron ninguna señal, tal como se esperaba. Esta figura presenta la cuantificación y el análisis estadístico de los resultados, que demuestran y confirman la especificidad de la técnica de ensayo de ligación por proximidad en preparaciones de citocentrifugado de cultivos celulares en suspensión. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco horas tras una incubación nocturna con un anticuerpo primario, siempre que se realice adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar titular cuidadosamente el anticuerpo mediante tinción de inmunofluorescencia de las células de su interés antes de realizar el ensayo de ligación por proximidad. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en biología celular exploraran interacciones transitorias entre proteínas que son difíciles de evaluar utilizando métodos estándar, como las inmunoprecipitaciones y la imagen basada en FRET, lo que a menudo genera artefactos técnicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de ligación por proximidad en cultivos celulares en suspensión para visualizar y cuantificar la interacción entre proteínas in situ.

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Research

Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

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Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

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Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

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Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

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Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Aprenda a detectar complejos proteicos de reparación de ADN en cultivos de células en suspensión mediante ensayo de ligación de proximidad. Este método visualiza interacciones ATM-p53 bajo estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad (Video) | JoVE Journal

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

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