Name: Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a inducir hipoxia en embriones de Xenopus y Danio rerio usando una cámara hipóxica simple y económica. Este método permite estudiar efectos del oxígeno en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio de Apoyo Wellcome Trust SIA 100329 / Z / 12 / Z a WAH y la beca de DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Cambridge. 1. Mantenimiento de animales <ol><li> Embriones de rana NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales. <ol><li> Preparar solución de solución de Barth (MBS) modificada 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 μM, NaHCO3 24 μM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 3,3 μM y CaCl2 4,1 μM, pH 7,6 . </li><li> Obtener embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro. <ol><li> Inducir la ovulación en ranas adultas africanas ( Xenopus laevis) por inyección con gonadotropina sérica de yegua preñada una semana (60 UI) y 12 h (500 UI) antes de la puesta. </li><li> Recoger los ovocitos y fertilizarlos in vitro con testículo masculino homogeneizado. </li><li> RaiSe embriones en 0.1x MBS a 16-18 ° C. Etapa de los embriones de acuerdo con la tabla Normal de Xenopus laevis [ 14] . Tenga cuidado en la selección de embriones enteros y vivos para el experimento. </li></ol></li></ol></li><li> Embriones de pez cebra NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales. <ol><li> Preparar medio de embrión: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl _ { 2 } 0,33 mM, MgSO _ { 4 } 0,33 mM y azul de metileno al 0,00001%. </li><li> Mantener y cultivar la cepa WT AB Danio rerio a 26.5 ° C. </li><li> Recoger los embriones en la mañana de la fertilización, levantar hasta 4 d post fertilización (dpf) a 28 ° C en medio embrionario preparado como se describe anteriormente, seleccionar y poner en escena como se describe anteriormente [ 15] . </li></ol></li></ol> 2. Inducción de la hipoxia in vivo <li> Construcción de la cámara de incubación de gas <ol><li> Utilice un tanque acuático de cría ( Figura 1A ) que se utiliza normalmente en la instalación de peces para la construcción de cámara hipóxica. Este tanque debe encajar en una placa de 24 pocillos. </li><li> Preparar una placa de 24 pocillos de fondo de malla como se muestra en la Figura 1 . Quitar la parte inferior de plástico de la placa de 24 pocillos ( figura 1B ), por ejemplo , utilizando una fresadora para este fin. </li><li> Llenar el espacio entre el plástico de los pozos y las paredes de la placa con resina epoxi. Conecte un filtro de nylon ( Figura 1C ) con un diámetro de malla de 0,1-0,2 mm al plástico recubierto de resina y deje que la placa esté completamente seca. </li><li> Una vez seco, taladre tres o cuatro túneles ( Figura 1D ) de 10 mm de longitud y 5 mm de diámetro en las paredes de la placa recubierta de resina y malla. Sujete varillas de plástico o de Teflón( Figura 1E ) de diámetro apropiado y 30 mm de longitud a los túneles y colocar la placa en el tanque de elección. </li><li> Coloque la placa de 24 pocillos de fondo de malla en el tanque acuático de elección. Utilizando un tubo de silicona ( Figura 1F ), conecte un tanque de gas ( Figura 1G ) con la mezcla de O 2 / N 2 deseada u otra mezcla de gases de elección a una válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando un regulador de gas apropiado (I) (BOC 200 bar). En este caso, utilice tanques de gas que contengan una mezcla de 5% de oxígeno y 95% de N 2 en los experimentos de hipoxia presentados aquí. </li><li> Ajuste el caudal de oxígeno en el medio de la cámara a 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Bajo este caudal de gas, no debe observarse perturbación del medio en los pocillos de la placa. <ol><li> Utilice el regulador de gas de dos etapas de alta pureza para este propósito. Ajuste el regulador para reducir la presión interna del(1000 - 2500 PSI) a una presión de suministro de 10 PSI durante todo el experimento. Por lo tanto, de acuerdo con las especificaciones de este regulador de gas, se logró un caudal de 0,00189 metros cúbicos por segundo durante todo el experimento. </li></ol></li><li> Conecte la tubería de silicona y la válvula distribuidora a un difusor de disco de cerámica ( figura 1J ) dentro del tanque acuático. Cierre el tanque acuático y cierre cuidadosamente la tapa, cubriéndola con grasa de silicona ( Figura 1K ) (compare con la Figura 1 ). Si se requiere una temperatura no ambiente específica, coloque la cámara hipóxica en una incubadora de laboratorio de la temperatura requerida. </li><li> Dependiendo del tipo de embriones utilizados en el experimento, llene el tanque de cámara hipóxica con el medio embrionario apropiado y comience a difundir la mezcla de gases a través del difusor de disco de cerámica. Equilibrar durante 10-15 min. </li><li> Después del equilibrio con thE la mezcla de oxígeno deseada, mida la concentración de oxígeno en el agua usando un oxímetro o una sonda de oxígeno. Aquí, utilice un oxímetro con el sensor de fibra óptica disuelto de oxígeno y temperatura para este propósito. </li></ol></li><li> Inducción de hipoxia en embriones <ol><li> Selección cuidadosa de los embriones para el experimento, el uso de embriones enteros y vivos para la incubación de hipoxia. Aquí, nos embriones de rana de etapa 38 o embriones de pez cebra 4 dpf en los experimentos presentados aquí. </li><li> Colocar los platos de embrión en la incubadora ( Figura 1K ) que contiene la cámara de incubación de gas y dejarlos equilibrar a la temperatura de la incubadora. </li><li> Transferir cuidadosamente los embriones en los pocillos de la placa de 24 pocillos en malla ( Figura 1B ) de la cámara de incubación de gas, usando una pipeta de plástico. Utilice siempre una pipeta de plástico para la transferencia de embriones a través del protocolo. NOTA: Cada pozo de esta placa puede contener hastaA 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra de 4 dpf. Etiquetar cuidadosamente los pozos si se utilizan diferentes genotipos. </li><li> Mantener la cámara de incubación de gas bajo una infusión constante con la mezcla gaseosa de elección durante 5 h o durante un tiempo más largo que se adapte al experimento. Utilizar aquí una mezcla de 5% de O $ ₂ $ y 95% de N $ ₂ $. </li><li> Con cuidado, transferir los embriones de la cámara de incubación de gas de nuevo al medio normoxic correspondiente al tipo de embrión e inmediatamente proceder con los pasos 3 o 4. </li><li> Si se requiere un tratamiento normoxico adicional, transfiera cuidadosamente los embriones al medio normoxico correspondiente al tipo embrionario. </li></ol></li></ol> 3. Control de la inducción exitosa de la hipoxia mediante el seguimiento de los niveles de HIF-1α <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar 0,4 mg / mL MS222 solución en 0,1x MBS. </li><li> Preparar el tampón de homogeneización: Comprar Radioimmunoprecipitation Tampón de ensayo (RIPA bUffer) para homogeneización de tejido y suplementar la cantidad de tampón necesaria para su experimento con inhibidor de proteasa hasta una concentración final 1: 100 v / v. </li><li> Preparar soluciones para Western blot. <ol><li> Preparar 4 x tampón de carga de gel Laemmli: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS al 8% v / v, beta-mercaptoetanol al 4% v / v, azul Bromofenol al 0,5% p / v volumen total ddH2 O. </li><li> Preparar 5x tampón de funcionamiento: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, 1 l de volumen total de ddH 2 O. </li><li> Preparar tampón de transferencia: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 ml de metanol al 100%, 1 l de volumen total de ddH 2 O. </li><li> Preparar 10 x TBST: 5 ml Tris 1 M pH 8,0, 30 ml 5 M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L volumen total H 2 O. </li><li> Preparar la solución de bloqueo: 4% p / v de leche desnatada en polvo en 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Colección de tejido <ol><li> Anestesiar los embriones bañándose en una solución de 0,4 mg / ml de MS22216 , 17 y transferirlos a un tubo de reacción de plástico lleno de tampón de homogeneización usando una pipeta de plástico. Utilizar 20 μ l de buffer por embrión. Obsérvese que al menos 5 embriones de rana de etapa 38 ó 7 embriones de pez cebra de 4 dpf son necesarios para determinar un cambio significativo en los niveles de proteína HIF1α. </li><li> Homogeneizar el tejido utilizando un homogeneizador tisular apropiado o un sonicador. Eliminar los residuos por centrifugación (15 min, 13.000 xg, 4 ° C). <ol><li> Alternativamente, disecar las retinas de los embriones de rana anestesiados 17 y homogeneizar como se ha indicado anteriormente. Utilizar 20 μl de tampón de homogeneización por 10 retinas. </li></ol></li><li> Tomar el sobrenadante usando una pipeta, desnaturalizar a 85 ° C durante 5 min y suplementar con tampón de carga de gel de Laemmli hasta una concentración final de 1x v / v ( por ejemplo , añadir 5 μl de tampón Laemmli 4x a 15 μl de homogeneizado). Utilice este sobrenadante para los WesTern blot o congelar las muestras a -20 ° C. </li></ol></li><li> Mancha occidental <ol><li> Cargar las muestras preparadas como se describe en el Paso 3.2 sobre un gel prefabricado al 12% en un sistema de electroforesis usando tampón de funcionamiento 1x v / v. Use una escalera de proteína para determinar el tamaño de la proteína. Transferir las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa (membrana de 0,45 μm) en tampón de transferencia durante 1 h envasado en hielo a 4 ° C, según el protocolo del fabricante. </li><li> Bloquear sitios de unión inespecíficos que incuban la membrana en tampón de bloqueo durante 60 minutos. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST. </li><li> Incubar la membrana en soluciones de anticuerpo anti-HIF-1α de conejo y anti-α-tubulina de ratón diluidas 1: 100 v / v y 1: 5000 v / v, respectivamente, en solución de bloqueo, durante 2,5 h a TA. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST. </li><li> Para la detección, incubar en cabra anti-conejo y cabra anti-ratón HRP conjugado anticuerpos diluido 1: 1000 v / v en solución de bloqueo durante 1 h.Seguir con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST y visualizar la tinción HRP usando un kit comercial y una máquina de revelado de elección. </li><li> Cuantificar la cantidad de proteína HIF1α utilizando la cuantificación digital. </li></ol></li></ol> 4. Control de la proliferación celular en la hipoxia <ol><li> Preparativos <ol><li> Preparar solución de EDU 5 mM en el medio de embrión de elección. La solución se puede utilizar inmediatamente o alicuotar y almacenarse a -20 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) o comprar PBS a partir de recursos comerciales. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C. </li><li> Preparar soluciones para la detección de la incorporación de EdU. <ol><li> Preparar la solución de fijación: 4% v / v de solución madre de formaldehído al 16% en PBS. </li><li> Preparar solución de sacarosa: sacarosa al 30% p / v en PBS. </li><li> Preparar PBST: 0,1% v / v de Triton X-100 en PBS. </li><li> Preparar Solución de bloqueo: 10% v / v Suero de cabra inactivado por calor (HIGS) en PBST. </li><li> Preparar la solución DAPI: 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - fenilindol 1: 1000 v / v (DAPI) en PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubación de embriones en hipoxia para la incorporación de EDU <ol><li> Llenar la cámara de incubación de gas con 400-500 mL de solución EDU 5 mM suplementada con 1% v / v de DMSO. Pre-equilibrar la solución con la misma mezcla de gases utilizada en el experimento durante 15 min antes del experimento. Obsérvese que el volumen de la solución de incubación puede minimizarse fijando barras más cortas ( Figura 1E ) a la placa de fondo de malla. </li><li> Conectar la tubería de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla gaseosa de 5% de O 2 y 95% de N 2 . Incubar la solución durante 15 min. </li><li> Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pozos e incubar durante 2 h. Cada pozo puede caber hasta 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra 4 dpf. </li><li> Analizar el embriónS para la incorporación de EdU. </li></ol></li><li> Tiempo de incubación de embriones en hipoxia e incorporación de EDU <ol><li> Llene la cámara de incubación de gas con 500 ml de medio de embrión de elección. Conectar el tubo de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla de gas de 5% de O 2 y 95% de N 2 y equilibrar el medio con la mezcla de gases durante 15 min. </li><li> Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pocillos e incubar durante un período de tiempo deseado hasta 48 h. Durante las últimas 1 h, sustituir el medio embrionario con 5 mM EDU solución suplementada con 1% v / v DMSO. </li><li> Transferir los embriones de nuevo a la placa normoxic y analizar para la incorporación EdU. </li></ol></li><li> Detección y análisis de la incorporación de EDU <ol><li> Anestesiar los embriones bañándolos en una solución de 0,4 mg / ml de MS222. </li><li> Transferir los embriones a un vial de vidrio adecuado y fijar mediante la incubación en solución de fijación de 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguir con 3 x 10 min de lavado en PBS. Con cuidado, transfiera los embriones a la solución de sacarosa para la crioprotección del tejido. Incubar durante 4 h o hasta que los embriones se hundan en el fondo del vial de vidrio. </li><li> Incruste los embriones en el medio de incrustación (compuesto óptimo de temperatura de corte). La criosección bloquea inmediatamente con embriones o almacena hasta 14 d a -80 ° C. </li><li> Cryosection los bloques que contienen embriones usando un criostato. Recoja secciones de espesor de 12 μm (embriones de pez cebra) o 16 μm (embriones de rana) en portaobjetos de microscopio y deje secar. Procese cryosections inmediatamente o guarde a -20 ° C por hasta 3 meses. </li><li> Detectar la incorporación de EdU mediante tinción inmunofluorescente usando un kit de química comercial. Preparar la cantidad de Mezcla de Reacción EdU necesaria para el número de criosecciones en el experimento, según lo descrito por el fabricante. <ol><li> Para 500 μL de Mezcla de Reacción EdU, use 430 μl de tampón de reacción EdU 1X, 20 mu l de CuSO _ { 4} , 1,2 mu l de azida Alexa Fluor, 50 mu l de aditivo de tampón 1X EdU. </li></ol></li><li> Lavar las criosecciones una vez con PBS para eliminar el medio de incrustación y 3 x 5 min con PBST para permeabilizar el tejido. Incubar las criosecciones en solución de bloqueo durante 30 min. </li><li> Incubar las criosecciones con la Mezcla de Reacción de EdU durante 1 h y seguidas de 3 x 10 min de lavados en PBST. Se cubren las criosecciones con solución DAPI durante 15 min, seguidas de 3 x 10 min lavados en PBST. Montar las diapositivas con criogénicas teñidas en el medio de montaje, cubrir con cubreobjetos y dejar secar antes de analizar bajo un microscopio fluorescente o almacenar a 4 ° C hasta 1 año. </li><li> Analizar las criosecciones con tinción anti-EdU bajo un microscopio confocal invertido y determinar el número de células EdU-positivas utilizando cuantificación digital. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí hemos presentado un nuevo pero fácil método robusto para inducir hipoxia que se ajusta para su uso con los embriones de sapo y pez cebra, pero también puede ser adecuado para otros organismos acuáticos. La principal ventaja de este método reside en su simplicidad y rentabilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos con este método son muy robustos. Hemos demostrado que la hipoxia puede ser inducida eficientemente en la cámara tanto en embriones enteros como en tejido específico - aquí, retinas. Para determinar la ...

La investigación de la hipóxia tiene numerosas aplicaciones. Estos incluyen la investigación de la patogénesis y el desarrollo de tratamientos para condiciones médicas que se caracterizan por la hipoxia 1 y la enfermedad de alta altitud aguda 2 . El estrés hipóxico causa importantes cambios metabólicos en todos los organismos que requieren oxígeno. Estrés hipóxico también influye en el crecimiento fetal y el desarrollo y la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluida la restricción de crecimiento intrauterino [ 3] . El estrés hipóxico puede no sólo conducir a la reducción del peso al nacer, la mortalidad fetal y neonatal, sino que también puede dar lugar a muchas complicaciones en la vida adulta, como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo 2, la obesidad y la hipertensión 4 . El estrés hipóxico también se observa a menudo durante el desarrollo del tumor sólido, cuando el tejido tumoral supera su suministro de sangre. Por lo tanto, es crucial para poder estudiar los efectos de la hipoxia in vivo y directamente durante el embrión<html> Desarrollo yónico. Entre los métodos más conocidos que se han empleado para estudiar los efectos de la hipoxia durante el desarrollo es el uso de cloruro de cobalto en el medio de crecimiento o la incubación del organismo en una cámara hipóxica. El cloruro de cobalto induce artificialmente una respuesta hipóxica bajo concentración normal de oxígeno, debido a su papel en la estabilización del factor-1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) al prevenir su degradación proteosómica 5 , 6 , 7 . Sin embargo, siendo un método conveniente 8 , el uso de cloruro de cobalto así como otros similares miméticos de hipoxia química pueden tener un efecto deletéreo inespecífico en células y tejidos, por ejemplo , apoptosis 9 . Por lo tanto, las cámaras hipóxicas son un mejor método para la inducción de &quot;hipoxia natural&quot; en organismos vivos a través del desarrollo normal. Ntent &quot;&gt; Nos hemos centrado en el desarrollo de un sistema para la inducción de la hipoxia en los embriones de animales acuáticos.Las ranas y el pez cebra se han convertido en organismos informativos modelo de vertebrados para los estudios de numerosos procesos biológicos, así como los modelos de diversas enfermedades humanas. Además, un desarrollo rápido permite manipular factores ambientales y observar los cambios fenotípicos en la formación de órganos en tiempo real. Además, muchos componentes de las principales vías de transducción de señales están altamente conservados en Estos organismos modelo y se han caracterizado en detalle por un gran cuerpo de la literatura.La principal ventaja en el uso de ranas y embriones de pez cebra para estudiar los efectos de la hipoxia en el desarrollo de vertebrados es que todos los procesos pueden ser controlados directamente, ya que el oxígeno penetra rápidamente en los embriones. Así, en las ranas y el pez cebra, como en contraste con otros organismos modelo tales comoEmbriones de ratón, se puede estudiar la influencia de una concentración específica de oxígeno en el tejido de interés, sin tener en cuenta la presencia o ausencia de vasculatura funcional. La mayoría de las configuraciones comercialmente disponibles para la incubación hipóxica tienen la desventaja de ser comparativamente grandes y tener costes de funcionamiento correspondientemente altos. Aparte de su alto costo inicial y consumo de gas, el equilibrio y el mantenimiento de las cámaras comunes de hipoxia requiere el mantenimiento de una atmósfera hipóxica constante contra el gradiente de gas que ocurre naturalmente en estas cámaras debido a su mayor tamaño y / o respiración del organismo. Esto requiere el empleo de ventiladores de gas y un sistema de refrigeración, lo que aumenta la cantidad de equipo adicional necesario, impide la destreza del investigador y en general disminuye la simplicidad del procedimiento experimental. En contraste, la configuración que presentamos aquí es comparativamente robusta pero muy rentable, pequeña, fácil de establecer y permite fEquilibrio de gases, una atmósfera hipóxica estable y un simple intercambio de materiales y soluciones dentro de la cámara. Nuestro sistema puede emplearse para su uso con cualquier organismo modelo acuático de interés. Hemos construido una cámara hipóxica que es convenientemente pequeña y por lo tanto se puede colocar dentro de una incubadora de laboratorio común, lo que permite fácilmente procedimientos experimentales a cualquier temperatura específica. Proporcionando un control conveniente de la temperatura así como la concentración de oxígeno en el medio, la ventaja de nuestro sistema frente a las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles reside en su pequeño tamaño y rentabilidad. Por lo tanto, nuestra configuración puede establecerse utilizando suministros generales de laboratorio disponibles para la mayoría de los laboratorios de investigación y no requiere materiales caros. Además, nuestra instalación no genera calor, a diferencia de las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles, y permite su uso a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente que se colocan en una incubadora. El laSt es especialmente crítico para el trabajo con organismos de sangre fría tales como ranas y peces donde las tasas de desarrollo y metabólicas son fuertemente dependientes de la temperatura. Al ser muy rentable y de fácil construcción, nuestra cámara de incubación de gas es sin embargo muy versátil en el establecimiento de diversas condiciones hipóxicas o hiperóxicas, así como permite la administración rápida y fácil de diferentes medios y soluciones para un gran número de condiciones experimentales. Además, empleando una placa de 24 pocillos en lugar de platos de uso común o tanques de laboratorio 10 , 11 , 12 , nuestro sistema permite la observación y el tratamiento experimental de varias condiciones mutantes a la vez. Para controlar la correcta inducción de la hipoxia, hemos monitorizado los niveles de la proteína HIF-1 α por Western blot detección. Además, el número de células que proliferan antes y después de la incubaciónN en la cámara hipóxica se puede utilizar para determinar si se ha inducido hipoxia en el tejido. Este método se basa en nuestros resultados previamente publicados 13 , que muestran que la proliferación en el nicho embrionario de células madre retina disminuye a la inducción de la hipoxia. Por lo tanto, hemos monitoreado el nivel de proliferación de células madre retinianas añadiendo 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) al medio embrionario y midiendo su incorporación en el ADN de células que proliferan recientemente.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Medio embrionario, 10x TBST</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embrión mediu,Bicarbonato</td></tr> <tr><td>de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3/0.1x</td></tr><tr><td>MBS HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO4/0.1x MBS, Medio embrionario</td></tr><tr><td>Nitrato de calcio</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO3)2/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl2/0.1x MBS, Medio embrionario</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Medio embrionario</td></tr><tr><td>Yegua preñada gonadotropina sérica (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Fertilización de ranas</td></tr><tr><td>Tanque de cría de pez cebra</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Construcción de cámaras</td></tr><tr><td>de gas Placa de 24 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, para la construcción de cámaras de gas</td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Válvula distribuidora de gas</td><td>WPI Luer Valves Kit 14011</td><td></td><td>Accesorio de tanque acuático (Esquema 1, <fuerte>H</fuerte>)</td></tr><tr><td>Válvula de gas de alta precisión</td><td>BOC&nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Accesorio de depósito de gas (Esquema 1, <fuerte>I</fuerte>)</td></tr><tr><td>5% de oxígeno y 95% N2 depósito de gas</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Mezcla de gases hipóxicos</td></tr><tr><td>difusor de disco cerámico</td><td>CO2 Art&nbsp;</td><td>Difusor de vidrio CO2 Nano Aquarium, DG005DG005</td><td>Esquema 1, grasa <fuerte>J</fuerte></td></tr><tr><td>silicona</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>VAC1100</td><td>Esquema 1, <fuerte>K</fuerte></td></tr><tr><td>oxímetro</td><td>Oxford Optronix&nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Configuración de cámara hipóxica</td></tr><tr><td>sensor de oxígeno disuelto de fibra óptica</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Configuración de cámara hipóxica</td></tr><tr><td>pipeta pasteur de plástico</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>para la transferencia de embriones</td></tr><tr><td>MS222&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Tampón anestésico para embriones</td></tr><tr><td>RIPA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Tampón de carga Laemmli, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Tampón de carga Laemmli</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Tampón de carga Laemmli, 5x Tampón de funcionamiento</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Tampón de carga Laemmli</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Tampón de carga Laemmli</td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Tampón de ejecución, Tampón de transferencia</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Tampón de ejecución, Tampón de transferencia</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Tampón de transferencia</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Tubo</td> <td>de microcentrífuga EppendorfHomogeneizador de tejidos Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Motor de mortero de pellets Kontes</td><td>Z359971</td><td>Morteros de pellets de homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>prefabricado 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>escalera de proteínas</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>membrana de nitrocelulosa (0,45 y micro; m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1 y alfa; anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&alfa;-tubulina</td><td>anticuerpo Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-conejo en cabra</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-ratón en cabra</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Reactivo Pierce ECL 2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Películas ECL Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&prime;-deoxyuridine &nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS&nbsp; 61135-33-9</td><td>EdU, Incorporación de EdU</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>formaldehído</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Solución de fijación</td></tr><tr><td></td><td>Sacarosa Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solución</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Suero de cabra inactivado por calor (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Solución de bloqueo (incorporación de EdU)</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporación</td></tr><tr><td>de dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sondas moleculares</td><td>C10338</td><td>Incorporación de EdU</td></tr><tr><td>vial de vidrio</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>análisis de incorporación de EdU</td></tr><tr><td>Compuesto de temperatura de corte óptima Tissue-Plus&nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Medio de incrustación, EdU análisis de incorporación</td></tr><tr><td>criostato Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>análisis de incorporación de EdU</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio Super-Frost plus Menzel</td><td>vidrio Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU análisis de incorporación</td></tr><tr><td>EdU kit de química Click-iT Sondas</td><td>moleculares</td><td>C10338</td><td>Análisis de incorporación de EdU</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Medio de montaje, cubreobjetos de análisis de incorporación</td></tr><tr><td>EdU</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU análisis de incorporación</td></tr><tr><td>microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU análisis de incorporación</td></tr><tr><td>microscopio de barrido confocal</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU análisis de incorporación</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU análisis de incorporación</td></tr></tbody></table>

inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Aquí, introducimos un nuevo sistema para la inducción de hipoxia, que desarrollamos para estudiar los efectos de la hipoxia en organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema comprende una cámara con una instalación sencilla pero que es, sin embargo, robusta para inducir y mantener una concentración específica de oxígeno y temperatura en cualquier solución experimental de elección. El sistema presentado es muy rentable pero altamente funcional, permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia para experimentos directos in vivo y durante varios periodos de tiempo de hasta 48 h. Para monitorear y estudiar los efectos de la hipoxia, se han empleado dos métodos - la medición de los niveles de hipoxia inducible factor 1alfa (HIF-1α) en embriones enteros o tejidos específicos y la determinación de la proliferación de células madre retinianas por 5-etinil-2&#39;- Desoxiuridina (EdU) en el ADN. Los niveles de HIF-1 alpha pueden servir como un marcador general de hipoxia en todo el embrión o tejidoDe elección, aquí la retina embrionaria. La incorporación de EDU en las células proliferantes de la retina embrionaria es un resultado específico de la inducción de hipoxia. Por lo tanto, hemos demostrado que hypoxic progenitores de la retina embrionaria disminuir la proliferación dentro de 1 h de incubación en el 5% de oxígeno de la rana y el pez cebra embriones. Una vez dominado, nuestro sistema se puede emplear para el uso con micro organismos acuáticos pequeños, para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo concentración de oxígeno normal, hipóxico o hiperóxico o bajo cualquier otra mezcla de gases dada.

El empleo del sistema de cámara hipóxica que aquí se presenta permite estudiar los efectos de la hipoxia individualmente e in vivo en animales vivos enteros. La hipoxia puede ser inducida colocando embriones enteros de sapo o pez cebra en la cámara hipóxica ( Figura 1 ), y realizarse en diferentes combinaciones de condiciones. En la Figura 2 se muestra una imagen de nuestra instalación completa de la cámara de gas. Hemo...

Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

El objetivo general de esta invención es estudiar los efectos de la hipoxia o la hiperoxia sobre los tejidos embrionarios de cualquier organismo acuático de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo y la biología celular, como la restricción del crecimiento embrionario, la hipoxia fetal, la adaptación a gran altitud, la obesidad y el desarrollo de tumores sólidos. Las principales ventajas de esta técnica son su simplicidad, bajo costo y robustez.Permite la inducción y el mantenimiento de hipoxia in vivo durante largos períodos de tiempo. Después de recolectar y criar embriones de Xenopus y de pez cebra, prepare una placa de 24 pocillos con fondo de malla según el protocolo descrito en el texto. Fije varillas de plástico a la placa de 24 pocillos con fondo de malla y colóquela dentro del tanque acuático de su elección; luego, utilizando tubo de silicona, conecte un tanque de gas con la mezcla deseada de oxígeno y nitrógeno, u otra mezcla de gas de su elección, a una válvula distribuidora mediante un regulador de gas adecuado.A continuación, conecte el tubo de silicona y la válvula distribuidora a un difusor de disco cerámico dentro del tanque acuático. Dependiendo del tipo de embriones utilizados en el experimento, llene el tanque de la cámara hipóxica con el medio embrionario adecuado, luego cierre el tanque acuático y utilice grasa de silicona para recubrir la tapa y sellarla cuidadosamente. Comience a difundir la mezcla de gas a través del difusor de disco cerámico.Deje que el sistema se equilibre durante 10 a 15 minutos. Ajuste la velocidad de flujo de oxígeno en el medio de la cámara a entre 0,0017 y 0,0019 metros cúbicos por segundo. Con esta velocidad de flujo de gas, no se debe observar ninguna perturbación del medio en los pocillos de la placa.La velocidad del flujo de oxígeno depende de la presión interna del tanque de gas y de la presión de salida del regulador de gas. Ambos parámetros deben ajustarse según el monitor del regulador de gas. Después de la equilibración, utilice un oxímetro o una sonda de oxígeno para medir la concentración de oxígeno en el agua.Si se requiere una temperatura específica que no sea la temperatura ambiente, coloque la cámara hipóxica en un incubador de laboratorio con la temperatura deseada. Seleccione cuidadosamente los embriones para el experimento utilizando embriones completos y viables para la incubación en condiciones de hipoxia. Coloque las placas con embriones en el incubador que contiene la cámara de incubación gaseosa y déjelas equilibrar a la temperatura del incubador.Luego, utilice una pipeta de plástico para transferir cuidadosamente los embriones a los pocillos de la placa de 24 pocillos con malla de la cámara de incubación gaseosa. Etiquete cuidadosamente los pocillos con diferentes genotipos. Asegúrese de que haya una reoxigenación mínima de la cámara mientras coloca los embriones en los pocillos.Transfiera la muestra rápidamente y vuelva a sellar la cámara de inmediato. Mantenga la cámara de incubación gaseosa bajo una infusión constante con la mezcla de gases elegida durante cinco horas, o durante un tiempo más prolongado según lo requiera el experimento. Aquí se utiliza una mezcla de 5% de oxígeno y 95% de nitrógeno.Transfiera cuidadosamente los embriones desde la cámara de incubación con gas de vuelta al medio normóxico correspondiente al tipo de embrión. Después de preparar los tampones y medios, y anestesiar los embriones según el protocolo descrito, utilice un homogenizador de tejidos o un sonicador para homogeneizar el tejido embrionario. Luego, centrifugue los homogeneizados para eliminar los residuos.Recolecte el sobrenadante y desnature la muestra a 85 grados Celsius durante cinco minutos, luego agregue tampón de carga para geles Laemmli hasta un volumen final de una X en volumen/volumen. Utilice el sobrenadante para el análisis por inmunotransferencia, o congele las muestras a menos 20 grados Celsius. Para incorporar EdU en los embriones, llene la cámara de incubación gaseosa con 400 a 500 mililitros de una solución de EuD cinco milimolar suplementada con DMSO al 1% en volumen/volumen.Conecte el tubo de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla de 5% de oxígeno y 95% de nitrógeno. Incube la solución durante 15 minutos. Pre-equilibre la solución con la misma mezcla de gas utilizada en el experimento durante 15 minutos antes del experimento.Transfiera los embriones a la cámara hipóxica, distribuyéndolos uniformemente entre los pocillos, e incube los embriones durante dos horas. Finalmente, analice la incorporación de EdU en los embriones según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra en esta tabla, las concentraciones de oxígeno deseadas en el medio de incubación se indujeron en diferentes puntos temporales a lo largo de los experimentos, tal como se monitoreó mediante un sensor de oxígeno de fibra óptica.En este experimento, se midió la HIF-1 alfa, que se estabiliza bajo bajas concentraciones de oxígeno, en lisados de embriones completos de rana mantenidos bajo concentraciones normales de oxígeno o sometidos a hipoxia al 5 %, y en lisados de sus retinas aisladas. En ambas muestras, la HIF-1 alfa se estabilizó bajo condiciones de hipoxia. Aquí, embriones de rana y de pez cebra se incubaron en una cámara hipóxica mantenida al 5 % de oxígeno, y la proliferación retiniana se evaluó mediante el seguimiento de la incorporación de EdU.Como era de esperar, las retinas de control norm&oacute;xicas de embriones de rana y pez cebra mostraron una tinci&oacute;n intensa en la CMZ, donde se localizan los progenitores en proliferaci&oacute;n. Tras la incubaci&oacute;n en ox&iacute;geno en la c&aacute;mara hip&oacute;xica, se observ&oacute; una disminuci&oacute;n marcada de la proliferaci&oacute;n de progenitores en la CMZ tanto en embriones de rana como de pez cebra. Al realizar un curso temporal, se pudo demostrar que la reducci&oacute;n en la proliferaci&oacute;n de progenitores retinianos fue aguda, m&aacute;xima dentro de las dos primeras horas, y persisti&oacute; durante muchas horas mientras los embriones se desarrollaban normalmente seg&uacute;n su etapa de desarrollo.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar garantizar una velocidad adecuada del flujo de gas y evitar reaperturas innecesarias y excesivamente prolongadas de la cámara. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la QPCR para responder preguntas adicionales, como la activación o la regulación negativa de ciertos genes diana de HIF-1 alfa y de hipoxia, o hiperoxia, respectivamente.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la proliferación celular retiniana, así como la hipoxia y la nutrición restringida en embriones de rana y pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir hipoxia o hiperoxia en cualquier organismo acuático, y cómo estudiar sus efectos sobre el tejido y el fenómeno de interés, como la proliferación celular retiniana. No olvide que trabajar con mezclas de gases de oxígeno puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como asegurar el uso correcto y la conexión adecuada de los reguladores de gas, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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