Name: Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a cultivar y registrar redes neuronales de tejido cerebral de ratón E17 en matrices de microelectrodos para estudiar dinámicas de aprendizaje y memoria con alta resolución espaciotemporal.

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Este trabajo fue financiado por la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias CMMI-1300007. Nos gustaría agradecer a los miembros anteriores del laboratorio, que han ayudado con el diseño de estos protocolos y con el mantenimiento de las culturas durante más de cinco años en la Universidad George Mason: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , El Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera y Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos descritos en este protocolo proporcionan suficiente detalle para que el principiante planifique sus propios cultivos neuronales en los AAM y registre la actividad de la red. Este protocolo ayudará a asegurar que los cultivos se adhieran correctamente, formando una capa de alfombra de células sobre las matrices de electrodos, y permanezcan saludables y libres de contaminantes durante meses. Aunque es mejor adherirse a todas las partes del protocolo, hay pasos a lo largo del proceso que son críticos para el resultado exitoso. El uso de la técnica aséptica a lo largo de todo el proceso es imprescindible para evitar que los cultivos se contaminen. Los nuevos MEA deben hacerse hidrófilos, como se describe en el protocolo, o bien se producirá una pobre adhesión celular. Evitar el pipeteado áspero y la formación de burbujas de aire durante la disociación reducirá el número de células dañadas plateadas y conducirá a un rendimiento más alto y más saludable. Cambiar de DMEM 5/5 a DMEM + después de la primeraLa alimentación también es importante. DMEM 5/5 contiene suero de caballo, lo que hará que las células gliales dominen el cultivo si se usan continuamente y resultará en una mala actividad neuronal, aunque los cultivos parezcan saludables 17 . La alimentación de los cultivos según lo programado y mantenerlos en condiciones de incubación adecuadas también es crucial. Plating culturas de células en AMAs implica muchas variables que pueden conducir a menos de lo óptimo resultados. Aunque el objetivo es una &quot;alfombra&quot; perfecta de las células, la falta de abordar los pasos críticos mencionados anteriormente dará lugar a la maduración celular pobres o en la contaminación. La mala adherencia celular, que es diferente de la maduración pobre de la célula, es también una preocupación. Esto puede ser causado por varios factores, incluyendo la preparación pobre de MEA antes de la galjanoplastia o el uso del medio viejo. Si el medio antiguo contiene una forma estabilizada de L-glutamina y un suplemento libre de suero para el cultivo de células neurales (véase Tabla de Materiales), Las células inicialmente se adhieren, pero luego se alejan después de aproximadamente dos semanas. Si la contaminación bacteriana es un problema persistente, puede agregarse al medio un antibiótico, tal como ampicilina o pen- strep. También hay fungicidas disponibles para tratar la contaminación por hongos. Estas son algunas de las variables más comunes que pueden afectar el resultado de los cultivos. Hay muchos otros que sólo se encontrará después de tiempo y experiencia. En comparación con el uso de microelectrodos de vidrio, esta técnica es excelente para estudiar la dinámica de la red y las respuestas farmacológicas. Permite el uso de muchos patrones de estimulación espacio-temporal diferentes y permite el registro de respuestas neuronales de múltiples áreas a la vez. Los grupos anteriores han demostrado interesantes resultados utilizando protocolos similares a los descritos aquí [ 18] . Dado que las culturas duran semanas o meses y las mismas culturas pueden reutilizarse, esta técnicaPara múltiples experimentos a lo largo del tiempo en la misma red. Sin embargo, hay limitaciones a esta técnica. Los AME no son invasivos. Por lo tanto, sólo pueden registrar la actividad extracelular, en oposición a la fijación de parche o registro intracelular con pipetas. Además, puesto que cada electrodo en una matriz está cubierto por varias células, no es posible resolver la actividad de una sola neurona. Por el contrario, debido a que estos son cultivos in vitro , no pueden reproducir plenamente las propiedades estructurales de las redes en el cerebro. Además, la actividad sólo se puede registrar durante menos de 30 minutos a la vez sin ningún mecanismo que proporcione una atmósfera de CO 2 para que las células mantengan su equilibrio de pH. Una vez que se domina esta técnica, se pueden explorar las manipulaciones farmacológicas con o sin estimulación eléctrica. También se pueden diseñar y probar nuevos protocolos para investigar el aprendizaje y la formación de memoria en redes neuronales, junto con pRotocolos para las redes del hipocampo o de la médula espinal. Se han publicado previamente protocolos para la estimulación y capacitación de redes, y algunos de ellos se han desarrollado en protocolos in vivo , como la &quot;adaptación selectiva&quot; propuesta por Eytan et al. 19 . Se probaron varios protocolos. Sin embargo, sólo los resultados de una modificación al procedimiento de tétanos propuesto por Ruaro en 2005 se presentan aquí 14 , 20 .

Micro-electrodo arrays (MEAs) se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos, los paradigmas de diseño para la próxima generación de medicina personalizada, y estudiar la dinámica de la red en culturas neuronales [ 1] . En contraste con métodos más tradicionales -como el patch-clamping, que sólo puede registrar la actividad de una sola célula, o grabación de campo con una pipeta de vidrio, que puede registrar las respuestas extracelulares de las neuronas que rodean el electrodo en un solo sitio-MEAs puede simultáneamente Registro de múltiples sitios en un cultivo celular sin requerir la ardua tarea de colocar cada electrodo individualmente. Esto permite el estudio de las interacciones dinámicas entre grupos de células que forman una red dentro de esa cultura. Además, los efectos de la estimulación eléctrica sobre los patrones de disparo de red 2 , 3 , 4 , 5 y el control de red 6 &lt;/ Sup&gt; en cultivos neuronales han sido bien documentados, y numerosas configuraciones de estimulación eléctrica y controles pueden aplicarse fácilmente dentro de la misma configuración experimental, permitiendo explorar una amplia gama de dinámicas espacio-temporales. Una de las dinámicas clave de interés en estos estudios in vitro ha sido la medida en que las redes cultivadas muestran propiedades indicativas de aprendizaje 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . El Laboratorio Peixoto examinó previamente los efectos de señales de entrenamiento de alta frecuencia, como se describe en Ruaro et al. 14 , en las redes de ratón neuronas plateado en microelectrode arrays [ 15] . En estos experimentos, las redes mostraron un aumento en la respuesta followinG de entrenamiento inducido por la estimulación eléctrica. El aumento de la respuesta se consideró una forma de aprendizaje a través del reconocimiento de estímulo, por lo que las redes respondieron de manera coherente a un cambio en el estímulo después de la aplicación de una estimulación específica ( es decir, el entrenamiento) del protocolo. Este protocolo demuestra cómo cultivar células neuronales en MEAs, registrar exitosamente de más del 95% de los platos chapados, establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a patrones de estimulación, clasificar una sola unidad de actividad, trazar histogramas e interpretar los resultados de Experimentos. Se demuestra el uso de un sistema patentado (véase la Tabla de Materiales ) para la estimulación y registro de cultivos neuronales, así como la aplicación de paquetes de software (ver Tabla de Materiales ) para ordenar unidades neuronales . Una interfaz de usuario gráfica diseñada a medida (consulte la Tabla de materiales ) se utiliza para visualizar los post-sTimulus, intervalos entre ráfagas y duración de ráfaga, así como para comparar la respuesta celular con la estimulación antes y después de un protocolo de entrenamiento.

<table><tbody><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Make 4 mg/mL alícuotas</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sin suero para el cultivo de células neuronales. Hacer alícuotas de 1 mL y congelar</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados - vidrio - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados - vidrio - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de pulgar con punta roma</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Frasco criogénico - estéril, 2</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Vial criogénico - estéril, 5</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con tecnología Glutamax</td><td>Gibco Life</td><td>10569-010</td><td>Medios de cultivo celular que contienen una forma estabilizada de L-glutamina</td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Worthington Etanol LK003172</td><td></td><td></td>bioquímico</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td> <td>de pulgar de punta finaWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Una forma estabilizada de L-glutamina utilizada como suplemento</td></tr><tr><td>Chip de hemocitómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB completo</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2</supMedios de almacenamiento de > celdas</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de filtro MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>cabecera/preamplificador MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>Mazo de microelectrodos MCS Sistema</td><td>multicanal</td><td>60MEA200/ Fuente de alimentación 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS Sistema</td><td>multicanal</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de señal MCS</td> Sistema <td>multicanal</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>Generador de estímulo MCS</td> Sistema <td>multicanal</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Botella de almacenamiento de medios - vidrio 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga para autoclave - 0,4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga para autoclave - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Puntas</td>de</tr><tr><td>micropipeta para autoclave - 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta para autoclave - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta para autoclave - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td> Micropipeta de <td>autoclave</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Micropipeta Thermo</td><td>Fisher 4641170N</td><td></td></tr><tr><td>- 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>Micropipeta Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N Papaína</td><td></td></tr><tr><td>- 0.22 Filtrado</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (Pen, Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri -100 mm Desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri -100 mm de vidrio</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS) (1x)</td><td>Sistema de limpieza por plasma Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico (centrífuga) de polietileno -15</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico (centrífuga) de polipropileno -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Mascarillas de procedimiento</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí World</td><td>Precision Instruments</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras - grandes</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras - pequeñas quirúrgicas</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica - estéril, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica estéril, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica estéril, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica - estéril, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>utiliza para analizar archivos .mat. Disponible de forma gratuita bajo petición. Póngase en contacto con npeixoto@gmu.edu para solicitar una copia.</td></tr><tr><td>Software: MCS MC_Rack</td><td>Sistema Multicanal</td><td>N/A</td><td>Utilizado para la adquisición de datos</td></tr><tr><td>Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Se utiliza para convertir archivos .nex a .mat</td></tr><tr><td>Software: Offline Sorter</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Se utiliza para ordenar picos neuronales y convertir archivos de datos a .plx y luego a .nex</td></tr><tr><td>Manual de software: MCS</td><td>MC_Rack Multichannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Manual de software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf Manual de software: Clasificador fuera de línea</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Espátula - pequeña World</td><td>Precision Instruments</td> de doble punta<td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 y micro; m filtro de poros - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia - diámetro grande&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia - diámetro pequeño&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>Cortar en 8 gajos de tarta y esterilizar en autoclave en una placa de Petri de vidrio</td></tr></tbody></table>

incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrodo arrays (MEAs) se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos, los paradigmas de diseño para la próxima generación de medicina personalizada, y estudiar la dinámica de la red en culturas neuronales. A diferencia de los métodos más tradicionales, como el patch-clamping, que sólo puede registrar la actividad de una sola célula, los MEA pueden grabar simultáneamente desde múltiples sitios en una red, sin requerir la ardua tarea de colocar cada electrodo individualmente. Además, numerosas configuraciones de control y estimulación pueden aplicarse fácilmente dentro de la misma configuración experimental, permitiendo explorar una amplia gama de dinámicas. Una de las dinámicas clave de interés en estos estudios in vitro ha sido la medida en que las redes cultivadas muestran propiedades indicativas de aprendizaje. Las células neuronales de ratón cultivadas en MEAs muestran un aumento en la respuesta después del entrenamiento inducido por estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar células neuronales en los AMUMA; Con éxitoCordón de más del 95% de los platos chapados; Establecer un protocolo para capacitar a las redes para responder a patrones de estimulación; Y clasificar, trazar e interpretar los resultados de tales experimentos. Se demuestra el uso de un sistema patentado para estimular y registrar cultivos neuronales. Los paquetes de software también se utilizan para clasificar las unidades neuronales. Se utiliza una interfaz gráfica de usuario personalizada para visualizar histogramas de tiempo post-estímulo, intervalos entre ráfagas y duración de ráfaga, así como para comparar la respuesta celular con la estimulación antes y después de un protocolo de entrenamiento. Finalmente, se discuten los resultados representativos y las direcciones futuras de este esfuerzo de investigación.

Las células neuronales de ratón cultivadas en matrices de múltiples electrodos muestran un aumento de la respuesta después de la estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar las neuronas, cómo registrar la actividad, y cómo establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a los patrones de estimulación.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y asociar tejido neuronal de ratón E17, con el fin de cultivar, registrar y estimular redes neuronales sobre matrices de microelectrodos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la dinámica de redes, en relación con los mecanismos básicos del aprendizaje y la memoria. La principal ventaja de esta técnica es que las matrices de microelectrodos pueden registrar simultáneamente desde múltiples sitios y, por lo tanto, ofrecen una mejor resolución espacial y temporal en comparación con el registro tradicional en un solo sitio mediante micropipetas de vidrio.Aunque este método puede proporcionar información sobre la dinámica de redes en el aprendizaje y la memoria, también puede utilizarse para investigar la toxicidad de fármacos o diseñar paradigmas para medicina personalizada de próxima generación. La demostración visual de este proceso es fundamental, ya que la manipulación del tejido durante el proceso de disección y disociación es difícil de aprender únicamente mediante la lectura de protocolos. Para preparar el arreglo, añada de 40 a 50 microlitros de laminina descongelada al centro de cada MEA y 0,2 mililitros de laminina a las placas de control, utilizando puntas de pipeta estériles.Cubra todas las MEA y las placas de control en la cabina de bioseguridad y transfiéralas a una incubadora a 37 grados Celsius durante una hora. Después de una hora, retire cuidadosamente el exceso de laminina del centro de las MEA mediante succión con pipetas Pasteur estériles y deje que la superficie se seque al aire antes del siembra. A continuación, vierta medio L-15 en cuatro placas de Petri de 100 milímetros, cúbralas y colóquelas en un congelador a menos 20 grados Celsius durante aproximadamente 40 a 60 minutos, hasta que el medio tenga una consistencia de pulpa, pero no esté completamente congelado.Para prepararse para la disección, coloque un recipiente de vidrio de Petri boca abajo en una bandeja llena de hielo. Ahora rocíe el abdomen inferior del animal con etanol al 70 %. Usando tijeras quirúrgicas pequeñas, realice un corte en forma de V a través de la piel y la grasa subcutánea del abdomen inferior, extendiendo el corte hasta los extremos distales de la cavidad torácica y exponiendo el útero.Utilizando pinzas, levante cuidadosamente el útero entre los embriones. Corte el tejido conectivo con tijeras de disección hasta que el útero quede completamente libre. Luego enjuague brevemente el útero con etanol al 70 % para eliminar cualquier rastro de sangre y colóquelo en uno de los cuatro platos de Petri llenos con L-15 frío.Posteriormente, libere cada embrión del útero y de la bolsa embrionaria interna utilizando dos pares de pinzas de punta fina. Coloque los embriones liberados en el segundo recipiente lleno de L-15 frío, luego transfiera las cabezas al tercer recipiente de Petri y los cuerpos al cuarto. En la cabina de flujo laminar, coloque un trozo de papel de filtro autoclaveado sobre la etapa de vidrio fría del recipiente de Petri y coloque una cabeza de embrión sobre el papel de filtro.A continuación, coloque el borde cortante de la hoja inferior de las tijeras de iris en la base del cráneo, manteniendo la hoja inferior contra la superficie interna del cráneo y alejada del cerebro; corte a través de la placa occipital y luego a lo largo de la línea media entre las placas parietales. Continúe cortando en dirección rostral entre las placas cartilaginosas del cráneo frontal. Luego, comenzando desde el centro de la placa occipital, realice un corte perpendicular hacia la izquierda y otro hacia la derecha del corte central.Después, deslice cuidadosamente una espátula pequeña entre la superficie ventral del cerebro y las placas óseas inferiores del cráneo, hasta que quede completamente debajo del cerebro. Luego, levante la espátula para extraer el cerebro. Utilizando una espátula limpia, primero retire el bulbo olfatorio y luego seccione el lóbulo frontal siguiendo un patrón trapezoidal.A continuación, transfiera el tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio de almacenamiento. En este procedimiento, utilice dos hojas de bisturí estériles para picar finamente el tejido. Luego agregue 2,5 mililitros de la mezcla de DNasa y papaína al tejido picado en la placa de Petri.Agite suavemente la placa de Petri para asegurar que todo el tejido esté libre en la solución y no adherido al fondo de la placa. Posteriormente, coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante 15 minutos. En la cabina de flujo laminar, utilice una pipeta de transferencia estéril de gran apertura para transferir todo el medio y el tejido a un tubo criogénico estéril de cinco mililitros.Coloque la punta de la misma pipeta de transferencia cerca del fondo del tubo y pase suavemente la mezcla de arriba abajo de 10 a 15 veces. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM 5/5 calentado a la mezcla de células disociadas y tape el tubo de centrífuga. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo y luego centrifugue a 573 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.En la cabina de seguridad biológica, deseche todo el sobrenadante sin romper el botón celular. Posteriormente, agregue un mililitro de DMEM 5/5 calentado al botón celular en el tubo para resuspender las células. Utilice una pipeta de transferencia estéril de pequeño diámetro para desagregar el botón celular, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea homogénea.Luego, transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrifugado. Fuera de la cabina de bioseguridad, agregue 10 microlitros de azul de tripano a los 10 microlitros de suspensión celular en el tubo de microcentrifugado. A continuación, cargue 10 microlitros de la suspensión celular con azul de tripano en un contador de hemocitómetro desechable para contar las células.En la cabina de flujo laminar, utilice una micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de la suspensión celular al centro de cada matriz y de cada placa de Petri de control. Luego, coloque las placas de Petri cubiertas en un incubador ajustado a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas. A continuación, agregue suavemente un mililitro de DMEM 5/5 calentado a cada MEA.Agregue cuidadosamente el medio, una gota a la vez, alrededor de los bordes internos de la MEA, y evite lavar las células fuera del centro de la matriz. Posteriormente, coloque una tapa que contenga una membrana FEP permeable a gases en cada MEA antes de devolverlas al incubador. Después de dos días, realice un reemplazo completo del medio con DMEM+ tibio extrayendo el medio del recipiente.Coloque cuidadosamente la punta de la pipeta sobre la pared interna y dispense un mililitro de DMEM+ calentado. Para las alimentaciones posteriores, retire 500 microlitros de medio de la placa y dispense 500 microlitros de DMEM+ calentado nuevamente. En este procedimiento, inspeccione las muestras de la placa cada dos días bajo un microscopio para observar la cobertura celular sobre la matriz y la contaminación por bacterias o hongos. Antes de sacar los cultivos del incubador, conecte el controlador de temperatura y encienda el sistema, permitiendo que la placa base calentada del preamplificador alcance 35 grados Celsius.Luego, coloque el cultivo tapado en el preamplificador, de modo que la línea negra en el pozo de la MEA se alinee con la tierra de referencia. Asegúrese de que los pines del preamplificador queden alineados para que la parte superior del preamplificador quede fija, y la tapa del cultivo permanezca colocada. A continuación, presione inicio en el entorno de software para comenzar a visualizar las señales.En la ventana principal, seleccione Spikes, Detection, Automatic, cambie el valor de desviación estándar a menos cinco y haga clic en Refresh para restablecer el umbral. Después de visualizar las señales, haga clic en Stop, Record y Play para comenzar a grabar la actividad. Las neuronas de ratón embrionarias se siembran en MEA de 60 canales, lo que permite la grabación simultánea de la actividad neuronal a través de la red desde cada electrodo.A continuación se muestra un gráfico raster representativo de la actividad proveniente de ocho electrodos en respuesta a la estimulación antes y después del entrenamiento. La línea vertical roja indica el momento del estímulo, y las marcas negras indican potenciales de acción. Antes del entrenamiento, hay una respuesta inmediata al pulso de estímulo en todos los canales.Después del entrenamiento, la red muestra una respuesta de actividad más prolongada, así como una respuesta inmediata a la estimulación. Aquí se muestra el promedio de 12 redes entrenadas y 10 redes de control; las redes entrenadas indican frecuencias de potenciales de acción significativamente alteradas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y asociar tejido neuronal de ratones embrionarios, y ser capaz de cultivar, registrar y estimular redes neuronales mediante matrices de microelectrodos.

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Neurociencia

Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales.

Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

El video demuestra cómo usar una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs). Se registra la actividad electrofisiológica de un MEA multipocillo que contiene un cocultivo neurona-astrocito para detectar potenciales de acción de múltiples neuronas en la red, lo que confirma la diferenciación exitosa de las hiPSC en neuronas.

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Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

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