Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

El objetivo general de este procedimiento es aislar y asociar tejido neuronal de ratón E17, con el fin de cultivar, registrar y estimular redes neuronales sobre matrices de microelectrodos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la dinámica de redes, en relación con los mecanismos básicos del aprendizaje y la memoria. La principal ventaja de esta técnica es que las matrices de microelectrodos pueden registrar simultáneamente desde múltiples sitios y, por lo tanto, ofrecen una mejor resolución espacial y temporal en comparación con el registro tradicional en un solo sitio mediante micropipetas de vidrio.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la dinámica de redes en el aprendizaje y la memoria, también puede utilizarse para investigar la toxicidad de fármacos o diseñar paradigmas para medicina personalizada de próxima generación. La demostración visual de este proceso es fundamental, ya que la manipulación del tejido durante el proceso de disección y disociación es difícil de aprender únicamente mediante la lectura de protocolos. Para preparar el arreglo, añada de 40 a 50 microlitros de laminina descongelada al centro de cada MEA y 0,2 mililitros de laminina a las placas de control, utilizando puntas de pipeta estériles.

Cubra todas las MEA y las placas de control en la cabina de bioseguridad y transfiéralas a una incubadora a 37 grados Celsius durante una hora. Después de una hora, retire cuidadosamente el exceso de laminina del centro de las MEA mediante succión con pipetas Pasteur estériles y deje que la superficie se seque al aire antes del siembra. A continuación, vierta medio L-15 en cuatro placas de Petri de 100 milímetros, cúbralas y colóquelas en un congelador a menos 20 grados Celsius durante aproximadamente 40 a 60 minutos, hasta que el medio tenga una consistencia de pulpa, pero no esté completamente congelado.

Para prepararse para la disección, coloque un recipiente de vidrio de Petri boca abajo en una bandeja llena de hielo. Ahora rocíe el abdomen inferior del animal con etanol al 70 %. Usando tijeras quirúrgicas pequeñas, realice un corte en forma de V a través de la piel y la grasa subcutánea del abdomen inferior, extendiendo el corte hasta los extremos distales de la cavidad torácica y exponiendo el útero.

Utilizando pinzas, levante cuidadosamente el útero entre los embriones. Corte el tejido conectivo con tijeras de disección hasta que el útero quede completamente libre. Luego enjuague brevemente el útero con etanol al 70 % para eliminar cualquier rastro de sangre y colóquelo en uno de los cuatro platos de Petri llenos con L-15 frío.

Posteriormente, libere cada embrión del útero y de la bolsa embrionaria interna utilizando dos pares de pinzas de punta fina. Coloque los embriones liberados en el segundo recipiente lleno de L-15 frío, luego transfiera las cabezas al tercer recipiente de Petri y los cuerpos al cuarto. En la cabina de flujo laminar, coloque un trozo de papel de filtro autoclaveado sobre la etapa de vidrio fría del recipiente de Petri y coloque una cabeza de embrión sobre el papel de filtro.

A continuación, coloque el borde cortante de la hoja inferior de las tijeras de iris en la base del cráneo, manteniendo la hoja inferior contra la superficie interna del cráneo y alejada del cerebro; corte a través de la placa occipital y luego a lo largo de la línea media entre las placas parietales. Continúe cortando en dirección rostral entre las placas cartilaginosas del cráneo frontal. Luego, comenzando desde el centro de la placa occipital, realice un corte perpendicular hacia la izquierda y otro hacia la derecha del corte central.

Después, deslice cuidadosamente una espátula pequeña entre la superficie ventral del cerebro y las placas óseas inferiores del cráneo, hasta que quede completamente debajo del cerebro. Luego, levante la espátula para extraer el cerebro. Utilizando una espátula limpia, primero retire el bulbo olfatorio y luego seccione el lóbulo frontal siguiendo un patrón trapezoidal.

A continuación, transfiera el tejido a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio de almacenamiento. En este procedimiento, utilice dos hojas de bisturí estériles para picar finamente el tejido. Luego agregue 2,5 mililitros de la mezcla de DNasa y papaína al tejido picado en la placa de Petri.

Agite suavemente la placa de Petri para asegurar que todo el tejido esté libre en la solución y no adherido al fondo de la placa. Posteriormente, coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius durante 15 minutos. En la cabina de flujo laminar, utilice una pipeta de transferencia estéril de gran apertura para transferir todo el medio y el tejido a un tubo criogénico estéril de cinco mililitros.

Coloque la punta de la misma pipeta de transferencia cerca del fondo del tubo y pase suavemente la mezcla de arriba abajo de 10 a 15 veces. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM 5/5 calentado a la mezcla de células disociadas y tape el tubo de centrífuga. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo y luego centrifugue a 573 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En la cabina de seguridad biológica, deseche todo el sobrenadante sin romper el botón celular. Posteriormente, agregue un mililitro de DMEM 5/5 calentado al botón celular en el tubo para resuspender las células. Utilice una pipeta de transferencia estéril de pequeño diámetro para desagregar el botón celular, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea homogénea.

Luego, transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrifugado. Fuera de la cabina de bioseguridad, agregue 10 microlitros de azul de tripano a los 10 microlitros de suspensión celular en el tubo de microcentrifugado. A continuación, cargue 10 microlitros de la suspensión celular con azul de tripano en un contador de hemocitómetro desechable para contar las células.

En la cabina de flujo laminar, utilice una micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de la suspensión celular al centro de cada matriz y de cada placa de Petri de control. Luego, coloque las placas de Petri cubiertas en un incubador ajustado a 37 grados Celsius durante tres a cuatro horas. A continuación, agregue suavemente un mililitro de DMEM 5/5 calentado a cada MEA.

Agregue cuidadosamente el medio, una gota a la vez, alrededor de los bordes internos de la MEA, y evite lavar las células fuera del centro de la matriz. Posteriormente, coloque una tapa que contenga una membrana FEP permeable a gases en cada MEA antes de devolverlas al incubador. Después de dos días, realice un reemplazo completo del medio con DMEM+ tibio extrayendo el medio del recipiente.

Coloque cuidadosamente la punta de la pipeta sobre la pared interna y dispense un mililitro de DMEM+ calentado. Para las alimentaciones posteriores, retire 500 microlitros de medio de la placa y dispense 500 microlitros de DMEM+ calentado nuevamente. En este procedimiento, inspeccione las muestras de la placa cada dos días bajo un microscopio para observar la cobertura celular sobre la matriz y la contaminación por bacterias o hongos. Antes de sacar los cultivos del incubador, conecte el controlador de temperatura y encienda el sistema, permitiendo que la placa base calentada del preamplificador alcance 35 grados Celsius.

Luego, coloque el cultivo tapado en el preamplificador, de modo que la línea negra en el pozo de la MEA se alinee con la tierra de referencia. Asegúrese de que los pines del preamplificador queden alineados para que la parte superior del preamplificador quede fija, y la tapa del cultivo permanezca colocada. A continuación, presione inicio en el entorno de software para comenzar a visualizar las señales.

En la ventana principal, seleccione Spikes, Detection, Automatic, cambie el valor de desviación estándar a menos cinco y haga clic en Refresh para restablecer el umbral. Después de visualizar las señales, haga clic en Stop, Record y Play para comenzar a grabar la actividad. Las neuronas de ratón embrionarias se siembran en MEA de 60 canales, lo que permite la grabación simultánea de la actividad neuronal a través de la red desde cada electrodo.

A continuación se muestra un gráfico raster representativo de la actividad proveniente de ocho electrodos en respuesta a la estimulación antes y después del entrenamiento. La línea vertical roja indica el momento del estímulo, y las marcas negras indican potenciales de acción. Antes del entrenamiento, hay una respuesta inmediata al pulso de estímulo en todos los canales.

Después del entrenamiento, la red muestra una respuesta de actividad más prolongada, así como una respuesta inmediata a la estimulación. Aquí se muestra el promedio de 12 redes entrenadas y 10 redes de control; las redes entrenadas indican frecuencias de potenciales de acción significativamente alteradas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y asociar tejido neuronal de ratones embrionarios, y ser capaz de cultivar, registrar y estimular redes neuronales mediante matrices de microelectrodos.