Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

El objetivo general de este procedimiento es aislar y asociar el tejido neuronal de ratón E17, con el fin de cultivar, registrar y estimular redes neuronales en matrices de microelectrodos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la dinámica de redes, ya que se relacionan con los mecanismos básicos del aprendizaje y la memoria. La principal ventaja de esta técnica es que las matrices de microelectrodos pueden grabar desde múltiples sitios simultáneamente y, por lo tanto, pueden proporcionar una mejor resolución espacial y temporal, en comparación con la pipeta de vidrio más tradicional en el registro de un solo sitio.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la dinámica de la red de aprendizaje y memoria, también se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos o diseñar paradigmas para la medicina personalizada de próxima generación. La demostración visual de este proceso es fundamental, ya que la manipulación del tejido, durante el proceso de disección y disociación, es difícil de aprender simplemente leyendo los protocolos. Para preparar la matriz, agregue de 40 a 50 microlitros de laminina descongelada en el centro de cada MEA y 0,2 mililitros de laminina en las placas de control, utilizando puntas de pipeta estériles.

Cubra todos los MEA y los platos de control en la biocampana y transfiéralos a una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, retire con cuidado el exceso de laminina del centro de los MEA mediante succión con pipetas Pasteur estériles y deje que la superficie se seque al aire antes de enchapar. A continuación, vierta el medio L-15 en cuatro placas de Petri de 100 milímetros, cúbralas y colóquelas en un congelador de menos 20 grados centígrados durante unos 40 a 60 minutos, hasta que el medio tenga una consistencia fangosa, pero no esté congelado.

Para prepararse para la disección, coloque una placa de Petri de vidrio boca abajo en una bandeja llena de hielo. Ahora rocíe la parte inferior del abdomen de los animales con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas pequeñas, haga una incisión en forma de V a través de la piel y la grasa subcutánea de la parte inferior del abdomen, extendiendo la incisión hasta los extremos distales de la cavidad torácica y exponiendo el útero.

Con fórceps, levante con cuidado el útero entre los embriones. Corte el tejido conectivo con unas tijeras de disección hasta que todo el útero quede libre. A continuación, enjuague brevemente el útero con etanol al 70% para eliminar la sangre y colóquelo en una de las cuatro placas de Petri llenas de L-15 frío.

Posteriormente, libere cada embrión del útero y del saco embrionario interior, utilizando dos pares de pinzas de punta fina. Coloque los embriones liberados en la segunda placa llena de L-15 frío, luego transfiera las cabezas a la tercera placa de Petri y los cuerpos a la cuarta. En la biocapucha, coloque una cuña de papel de filtro esterilizado en autoclave en la platina de la placa de Petri de vidrio enfriado y coloque una cabeza de embrión en el papel de filtro.

A continuación, coloque el borde cortante de la cizalla inferior de las tijeras del iris en la base del cráneo, manteniendo la cizalla inferior contra la superficie interna del cráneo y lejos del cerebro, corte a través de la placa occipital y luego a lo largo de la línea media entre las placas parietales. Continúe cortando rostralmente entre las placas cartilaginosas del cráneo frontal. Luego, comenzando en el centro de la placa occipital, haga un corte perpendicular a la izquierda y a la derecha del corte central.

Después de eso, deslice con cuidado una pequeña espátula entre la superficie ventral del cerebro y las placas inferiores del cráneo, hasta que esté completamente debajo del cerebro. A continuación, levanta la espátula para extraer el cerebro. Con una espátula limpia, primero retire el bulbo olfativo, luego diseccione el lóbulo frontal en un patrón trapezoidal.

A continuación, transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga medio de almacenamiento. En este procedimiento, utilice dos hojas de bisturí estériles para picar el tejido. A continuación, añade 2,5 mililitros de la mezcla de papaína Dnase al tejido picado en la placa de Petri.

Agite suavemente la placa de Petri para asegurarse de que todo el tejido esté libre en la solución y no se adhiera al fondo de la placa. Después, coloque el plato en una incubadora a 37 grados centígrados durante 15 minutos. En la biocapucha, utilice una pipeta de transferencia estéril de diámetro ancho para transferir todos los medios y tejidos a un tubo criogénico estéril de cinco mililitros.

Coloque la punta de la misma pipeta de transferencia cerca del fondo del tubo y cinutere suavemente la mezcla de 10 a 15 veces. A continuación, añada dos mililitros de DMEM 5/5 calentado a la mezcla de células disociadas y tape el tubo de la centrífuga. Mezclar suavemente por inversión y centrifugar a 573 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En la campana biológica, deseche todo el sobrenadante sin romper la paleta. Posteriormente, agregue un mililitro de DMEM 5/5 calentado a la paleta en el tubo para resuspender las celdas. Utilice una pipeta de transferencia estéril de pequeño diámetro para romper el palet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea homogénea.

A continuación, transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Fuera de la campana biológica, agregue 10 microlitros de azul de tripán a los 10 microlitros de suspensión celular en el tubo de microcentrífuga. A continuación, cargue 10 microlitros de la suspensión de células de azul de tripano en un chip de hemocitómetro de eliminación para contar las células.

En la biocapucha, utilice una micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de suspensión celular al centro de cada matriz y cada placa de Petri de control. A continuación, coloque las placas de Petri cubiertas en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres o cuatro horas. A continuación, agregue suavemente un mililitro de DMEM 5/5 calentado a cada MEA.

Agregue con cuidado el medio, gota a gota, alrededor de los bordes interiores del MEA y evite lavar las celdas lejos del centro de la matriz. Después, coloque una tapa que contenga una membrana FEP permeable al gas en cada MEA antes de devolverlos a la incubadora. Después de dos días, realice un reemplazo completo del medio con DMEM+ calentado extrayendo el medio del plato.

Coloque con cuidado la punta de la pipeta en la pared interior y dispense un mililitro de DMEM+ calentadoPara las alimentaciones posteriores, extraiga 500 microlitros de medio del plato y vuelva a dispensar 500 microlitros de DMEM+ calentado. En este procedimiento, inspeccione las muestras de la placa cada dos días bajo un microscopio, para buscar la cobertura celular sobre la matriz y la contaminación por bacterias u hongos. Antes de sacar los cultivos de la incubadora, conecte el controlador de temperatura y encienda el sistema, permitiendo que la placa base calentada del preamplificador alcance los 35 grados centígrados.

A continuación, coloque el cultivo tapado en el preamplificador, de modo que la línea negra del pozo MEA se alinee con la tierra de referencia. Asegúrese de que los pines del preamplificador estén alineados de modo que la parte superior del preamplificador esté asegurada y que la tapa del cultivo aún esté puesta. A continuación, presione iniciar en el entorno de software para comenzar a visualizar las señales.

En la ventana principal, seleccione Picos, Detección, Automático, cambie el valor de la desviación estándar a menos cinco y haga clic en Actualizar para restablecer el umbral. Después de visualizar las señales, haga clic en Detener, Grabar y Reproducir para comenzar la actividad de grabación. Las neuronas embrionarias de ratón están colocadas en MEA de 60 canales, lo que permite el registro simultáneo de la actividad neuronal a través de la red desde cada electrodo.

A continuación se muestra un gráfico ráster representativo de la actividad de ocho electrodos en respuesta a la estimulación antes y después del entrenamiento. La línea roja vertical indica el momento del estímulo y las marcas de verificación negras indican los potenciales de acción. En el pre-entrenamiento hay una respuesta inmediata al pulso de estímulo a través de los canales.

En el post-entrenamiento, la red exhibe una respuesta de actividad más prolongada, así como la respuesta inmediata a la estimulación. Aquí se muestra el promedio de 12 redes entrenadas y 10 redes de control, las redes entrenadas indican frecuencias de pico significativamente alteradas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y asociar tejido neuronal de ratones embrionarios, y ser capaz de cultivar, registrar y estimular redes neuronales a partir de matrices de microelectrodos.