Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

El objetivo general de este procedimiento es extraer de manera eficiente proteínas de la válvula mitral cardíaca humana, adecuadas para el análisis proteómico. Este método puede ayudar potencialmente a descubrir mecanismos patogénicos en el campo de la enfermedad de las válvulas cardíacas, lo que permite la identificación de nuevos marcadores de enfermedad diagnóstica y pronóstica y, con suerte, de dianas terapéuticas. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un flujo de trabajo de extracción eficiente compatible con muchas aplicaciones analíticas.

El resultado es una caracterización más exhaustiva del proteico de la válvula mitral cardíaca. Además, este protocolo también se puede aplicar a otros sistemas, como la válvula mitral porcina, que tiene un gran parecido con la válvula humana y se utiliza en modelos experimentales para la evaluación de la función de la válvula. La demostración del procedimiento experimental estará a cargo de Stefania Ghilardi, una técnica de mi laboratorio.

Para preparar la válvula mitral humana, comience con un corazón explantado que haya estado bajo isquemia fría durante cuatro a 12 horas. En una sala limpia, retire el corazón de la bolsa de transporte y colóquelo en un balde esterilizado. A continuación, transfiera el corazón a un gabinete de bioseguridad.

Allí, con un bisturí desechable, se cortó perpendicularmente al eje mayor a nivel de los ventrículos izquierdo y derecho, a unos cuatro centímetros del ápice. Luego coloque el corazón en un paño estéril. Luego, haga a un lado la aorta ascendente y la arteria pulmonar para acceder al techo auricular izquierdo.

En el techo auricular izquierdo, use fórceps y picos para cortar alrededor de la aurícula izquierda para exponer la válvula mitral. La válvula mitral está completamente contenida en el ventrículo izquierdo. Por lo tanto, exponga la valva mitral grande y la valva mitral pequeña.

Las comisuras anterolateral y posteromedial definen el límite de la zona anterior y posterior. Ahora, con tijeras y pinzas no traumáticas, disecciona la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo que rodea la válvula mitral. Durante esta disección, identifique la continuidad de la válvula aórtica mitral.

A continuación, separe la valva de la válvula mitral anterior de la valva posterior de la válvula mitral cortando a lo largo de las comisuras que bordean la valva posterior. Cuando se complete el procedimiento, desinfecte la mesa del gabinete con una solución de alcohol isopropílico al 70% y una solución de peróxido de hidrógeno al 6%. Ahora, lave la valva posterior de la válvula mitral con solución salina.

Luego, corte la válvula en trozos pequeños, cada uno de menos de un centímetro cuadrado. Envuelva las piezas individualmente en papel de aluminio y congélelas con nitrógeno líquido. Para comenzar la extracción de proteínas, use pinzas para extraer una muestra del nitrógeno líquido e inmediatamente colóquela en hielo seco.

No permita que la muestra se descongele. A continuación, en un matraz dewar lleno de nitrógeno líquido, coloque el mortero, los morteros asociados y la muestra. Es fundamental que el nitrógeno líquido se utilice para congelar la muestra y enfriar el sistema de trituración.

Este paso evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere capacitación técnica para un manejo seguro. Una vez congelado, coloque el mortero y los majas en una caja de poliestireno que contenga hielo seco. Además, coloque una espátula sobre el hielo seco.

A continuación, retire la muestra del papel de aluminio y cárguela en el mortero. Y coloque el mortero más grande encima de él. Con un destornillador para girar el mortero, muela la muestra de 15 a 20 veces.

Mientras muele, mezcle la muestra con la punta de una espátula fría. Después de usar el mortero grande, repita el proceso de molienda con un mortero más pequeño. La obtención de un polvo fino es fundamental para una extracción eficiente de proteínas.

Ahora, vierta la muestra en polvo en un tubo de centrífuga de 15 mililitros de masa conocida. A continuación, cepille el material restante en el mortero con una espátula fría. Mantenga el tubo con la muestra sobre hielo seco y determine rápidamente la masa de la muestra.

A continuación, vierta la muestra en un tubo homogeneizador de vidrio. A continuación, añada 200 microlitros de tampón de urea por cada 10 miligramos de muestra. Al hacer esto, recupere los residuos que quedan en el tubo enjuagándolos con la alícuota del tampón de urea.

Ahora homogeneice la muestra utilizando un mortero PFTE motorizado que funcione a 1.500 rpm. Presione lentamente el mortero sobre la muestra con un movimiento giratorio 10 veces. A continuación, transfiera el sobrenadante amarillo viscoso a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 mililitros con una pipeta de vidrio.

Ahora repita la homogeneización en la muestra restante usando la mitad de urea. Recupera el sobrenadante y combínalo con la colección anterior. A continuación, coloque el tubo en un rotador de tubos durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, cargue el tubo en una centrífuga fría y centrifuga la muestra a 13.000 g durante media hora. Luego, recupera el sobrenadante. Y mida la concentración de proteínas utilizando el ensayo de proteínas de Bradford.

Después de realizar el protocolo prescrito, el extracto de proteína se estudió utilizando una variedad de métodos después de algunos tratamientos adicionales. Se identificaron un total de 422 proteínas en el tejido de la válvula mitral mediante electroforesis bidimensional, enfoque isoeléctrico en fase líquida, cromatografía líquida-espectrometría de masas y cromatografía líquida 2D-espectrometría de masas. Las 422 proteínas se clasificaron mediante análisis de ontología génica.

Las regiones extracelulares contenían varias proteínas esperadas y otras proteínas intracelulares y de la superficie celular. Muchos de los cuales se identificaron por primera vez en las válvulas mitrales. La presencia de cuatro de estas proteínas no identificadas previamente en las válvulas mitrales se confirmó con anticuerpos en tres muestras únicas.

Las proteínas son Septina-11, cuatro dominios LIM de cuatro y medio, proteína uno, Dermatoponina y alfa cristalino B.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer proteínas de la válvula mitral cardíaca para su identificación y cuantificación. Una vez dominado, este protocolo se puede realizar en casi dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, para obtener el mayor rendimiento de proteínas con alta integridad proteica, es vital que las muestras no se descongelen durante ninguna de las transferencias.