Name: Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende un protocolo optimizado para extraer proteínas de la válvula mitral humana con fines de análisis proteómico. Este método permite identificar marcadores diagnósticos y terapéuticos en enfermedades valvulares cardíacas.

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El Ministerio de Salud de Italia apoyó este estudio (RC 2013-BIO 15). Damos las gracias a Barbara Micheli por su excelente asistencia técnica.

En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de los donantes. El tejido para el trasplante y la investigación se recopila sólo después del consentimiento de los padres; En la hoja de consentimiento, autorizan (o no) el uso del tejido cardíaco para investigación sólo si no es adecuado para el uso clínico humano ( es decir, problemas microbiológicos, funcionales y serológicos), siguiendo las directrices del comité de ética deCentro Cardiológico de Monzino. 1. Preparación de la válvula mitral <ol><li> Cosechar la válvula mitral humana tan pronto como sea posible después de la explicación del órgano (tiempo de isquemia fría de 4-12 h). </li><li> En una habitación limpia, retire el corazón de la bolsa de transporte que contenga una solución fría (4 ° C) ( es decir, una solución salina o medio balanceado Eurocollins o Wisconsin). Colóquelo en un cubo y colóquelo en un gabinete de bioseguridad (flujo de aire vertical de riesgo biológico, clase A, clasificación de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP)) para proceder con la preparación de la válvula. </li><li> Coloque el corazón sobre un paño desechable estéril en el gabinete. Usando un bisturí desechable estéril, corte el corazón completamente, perpendicularmente a su eje principal, a nivel de los ventrículos izquierdo y derecho, a unos 4 cm del ápice. </li><li> Mueva la aorta ascendente y la arteria pulmonar para mostrar el techo de la aurícula izquierda. </li><li> Con fórceps y picos esterilizados en autoclave, corte alrededor de la aurícula izquierdaEl túnel de la aurícula izquierda, haciendo visible la válvula mitral y permitiendo identificar el gran folíolo mitral (anterior) y el pequeño folíolo mitral (posterior). NOTA: Las comisuras antero-lateral y medial posterior definen el borde del folíolo anterior y el área posterior. </li><li> Usando tijeras esterilizables en autoclave y fórceps no traumáticos, disecar la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo alrededor de la circunferencia de toda la válvula mitral . </li><li> Identificar la continuidad de la válvula mitro-aórtica. NOTA: El ventrículo izquierdo contiene toda la válvula mitral y los acordes. </li><li> Separar el folíolo valvar mitral anterior del folíolo mitral posterior, cortando el folíolo posterior a lo largo de la inserción con el ventrículo (comisura). </li><li> Lave el folíolo posterior en la solución salina. Cortar el folleto en trozos pequeños (&lt;1 cm 2 ) y envolverlos individualmente en papel de aluminio. Snap-freeze con nitrógeno líquido. Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido. <ol><li> Desinfectar la mesa del gabinete con una solución de alcohol isopropílico al 70% y una solución de peróxido de hidrógeno al 6% al final del procedimiento. </li></ol></li></ol> 2. Extracción de proteínas <ol><li> Utilice un fórceps para recoger la muestra almacenada en nitrógeno líquido e inmediatamente colóquela en hielo seco mientras esté envuelta en el papel de aluminio. No deje la muestra descongelar durante las transferencias. </li><li> Antes de la molienda, enfríe el mortero de porcelana / zirconio y los pilones de un sistema de molienda ( por ejemplo, CryoGrinder), junto con la muestra, poniéndolos en un matraz de Dewar que contiene nitrógeno líquido (~ 500 ml). Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido. </li><li> Ponga el mortero y las majas en una caja de poliestireno que contiene hielo seco. Retire la muestra de la lámina de aluminio y póngala en el mortero. </li><li> MolerÉl muestra con el mortero grande contra el mortero 15-20 veces, con el destornillador para girar el mortero. Mezclar la muestra con la punta de una espátula pre-enfriada durante el proceso de molienda. <ol><li> Repita con el pequeño mortero. </li></ol></li><li> Transfiera la muestra molida a un tubo previamente pesado ( p. Ej., Tubo de centrífuga de 15 ml), invirtiendo el tubo, colocándolo sobre el mortero e invirtiéndolo para mover la muestra al tubo. Utilice una espátula previamente enfriada para recuperar todo el material del mortero. <ol><li> Mantenga el tubo con la muestra en hielo seco para evitar la descongelación de la muestra durante la transferencia. </li></ol></li><li> Calcular el peso neto de la muestra. </li><li> Limpiar el mortero y los pilones después de cada muestra y descontaminarlos en autoclave o calentarlos a 200 ° C durante 2 h. </li><li> Transferir la muestra en polvo del tubo de centrífuga al tubo de vidrio de un homogeneizador por inversión. </li><li> Añadir filtro de urea filtrada(8 M de urea, 2 M de tiourea, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris y 55 mM de ditiotreitol) al tubo de vidrio, 200 mu l de tampón de urea por cada 10 mg de tejido en polvo. NOTA: La muestra residual en polvo que queda en el tubo de centrífuga puede recuperarse utilizando parte del volumen calculado de tampón de urea. </li><li> Homogeneizar la muestra utilizando un agitador equipado con un mortero de vidrio borosilicato y un pilón de politetrafluoroetileno (PTFE). Presione lentamente el mazo sobre la muestra con un movimiento de torsión (1.500 rpm) 10 veces. </li><li> Recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 ml. Extraer de nuevo la muestra restante con tampón de urea fresco, añadiendo la mitad del volumen utilizado durante la primera extracción. </li><li> Repita el paso 2.10. </li><li> Recuperar el sobrenadante y combinarlo con el sobrenadante de la etapa 2.11. Colocar el sobrenadante combinado en un rotador de tubo durante 30 min. </li><li> Centrifugar el tubo durante 30 min a 13.000 xg y 4 ° C. </li><li> Recuperar el sobrenadanteD medir la concentración de proteína usando el ensayo de proteína Bradford, según las instrucciones del fabricante. Guarde la muestra a -80 ° C hasta su uso. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura. En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas mu...

La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas dentro de las células 1 , 2 . Además, las proteínas dictan en última instancia la función de la célula y por lo tanto dictan su fenotipo, que puede experimentar cambios dinámicos en respuesta a los factores autocrinos, parácrinos y endocrinos; Mediadores sanguíneos; temperatura; Tratamiento farmacológico; Y la enfermedad se desarrollanCión. Por lo tanto, un análisis de la expresión centrado en el nivel de proteína es útil para caracterizar el proteoma y para desentrañar los cambios críticos que se le ocurren como parte de la patogénesis de la enfermedad [ 3] . Por lo tanto, las oportunidades que presenta la proteómica para aclarar las condiciones de salud y enfermedad son formidables, a pesar de los desafíos tecnológicos existentes. Las áreas de investigación particularmente prometedoras a las que la proteómica puede contribuir incluyen: la identificación de la expresión alterada de la proteína a cualquier nivel ( es decir, células enteras o tejidos, compartimentos subcelulares y fluidos biológicos); La identificación, verificación y validación de nuevos biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad; Y, con suerte, la identificación de nuevas proteínas objetivo que se pueden utilizar con fines terapéuticos, así como para la evaluación de la eficacia de los medicamentos y la toxicidad [ 4] . Capturar la complejidad deEl proteoma representa un desafío tecnológico. Las herramientas proteómicas actuales ofrecen la oportunidad de realizar análisis a gran escala y de alto rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de niveles alterados de proteínas. Además, la introducción de técnicas de fraccionamiento y enriquecimiento, destinadas a evitar la interferencia causada por las proteínas más abundantes, también ha mejorado la identificación de proteínas mediante la inclusión de las proteínas menos abundantes. Finalmente, la proteómica se ha complementado con el análisis de las modificaciones postraduccionales, que progresivamente emergen como importantes moduladores de la función de las proteínas. Sin embargo, la preparación de la muestra y la recuperación de proteínas en los especímenes biológicos en análisis siguen siendo los pasos limitantes en el flujo de trabajo proteómico y aumentar el potencial de posibles trampas [ 5] . De hecho, en la mayoría de las técnicas de biología molecular que deben ser optimizadas, los primeros pasos son homogenizat de tejidoIon y lisis celular, especialmente durante el análisis de proteínas de baja abundancia para las que no existen métodos de amplificación. Además, la naturaleza química de las proteínas puede influir en su propia recuperación. Por ejemplo, el análisis de proteínas altamente hidrófobas es muy difícil, ya que fácilmente precipitan durante el enfoque isoeléctrico, mientras que las proteínas trans-membrana son casi insolubles (revisado en la Referencia 5). Además, la variabilidad de la composición del tejido crea una barrera significativa para desarrollar un método de extracción universal. Finalmente, debido a que casi todos los especímenes clínicos son de cantidad limitada, es esencial para permitir la preparación de proteínas con máxima recuperación y reproducibilidad de cantidades mínimas de muestra [ 6] . Este trabajo describe un protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral cardiaca humana normal, que representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico. La válvula mitral normal es un compLex estructura situada entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo del corazón ( Figura 1 ]. Desempeña un papel importante en el control del flujo sanguíneo desde la aurícula hasta el ventrículo, evitando el reflujo y asegurando el nivel adecuado de suministro de oxígeno a todo el cuerpo, manteniendo así un adecuado gasto cardíaco. Sin embargo, a menudo se considera que es un tejido &quot;inactivo&quot;, con una baja celularidad y pocos componentes, principalmente en la matriz extracelular. Esto se debe a que, en condiciones normales, las células valvulares intersticiales residentes (VICs) presentan un fenotipo quiescente con una baja tasa de biosíntesis de proteínas [ 7] . Sin embargo, se ha demostrado que, en un estado patológico, el número de VICs en la esponja aumenta y su síntesis de proteínas se activa, junto con otros cambios funcionales y fenotípicos [ 8] . Por lo tanto, no es sorprendente que los datos mínimosLa literatura se centra en el análisis de las válvulas mitológicas patológicas 9,10, en las que el aumento del número de VIC activados podría explicar el número relativamente elevado de proteínas identificadas. En conclusión, el presente protocolo puede servir para desarrollar la comprensión de los mecanismos patógenos responsables de las enfermedades de la válvula mitral a través del estudio de los componentes de la válvula valvular mitral. De hecho, una mayor comprensión de los procesos patológicos subyacentes podría ayudar a mejorar el manejo clínico de las enfermedades valvulares, cuyas indicaciones actuales para la intervención se basan principalmente en consideraciones hemodinámicas.

<table><tbody><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> salina <td>0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Medio de transporte equilibrado del órgano. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener el medio equilibrado Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>medio de transporte del órgano equilibrado. Combine 400 mL de Eurocollins A con 100 mL de Eurocollins B para obtener un medio equilibrado Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>Medio de transporte de órganos equilibrado</td></tr><tr><td>Riesgo biológico de aire de flujo vertical</td><td>Burdinola</td><td></td><td>Clase A Clasificación GMP</td></tr><tr><td>Matraz Dewar</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de criomolinillo</td><td>OPS diagnóstico</td><td>CG 08-01</td><td>Sistema de molinillo que contiene morteros, majas y destornilladores</td></tr><tr><td>Pinza</td><td></td><td></td><td></td>de acero inoxidable</tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td></td>de acero inoxidable</tr><tr><td>Bisturí estéril desechable</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de acero inoxidable Esterilizable en</td><td></td><td></td><td>autoclave</td></tr><tr><td>Ganzúas</td><td></td><td></td> de acero inoxidable <td>esterilizables</td></tr> <tr><td>en autoclaveCortina estéril desechable</td><td>Mon& Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Solución esterilizante con alcohol</td><td></td><td></td> isopropílico <td>70% alcohol isopropílico</td></tr><tr><td>Solución esterilizante con peróxido de</td><td></td><td></td> hidrógeno <td>al 6% Peróxido de hidrógeno</td></tr><tr><td>Micropipeta, 1 mL, con puntas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL VWR</td><td>international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,7 mL VWR</td><td> tampón</td><td></td> de urea de PIER90410 <td></td></tr><tr><td></td><td>internacional 8 M de urea, 2 M de tiourea, 4 % p/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td>Urea Sigma aldrich U6504-1KG Para ser utilizado para Tampón de urea Thiourea Sigma aldrich T8656 Para ser utilizado para Tampón de urea CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR Para ser utilizado para tampón de urea <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>Para ser utilizado para Tampón de Urea</td></tr><tr><td>Jeringa 50 mL</td><td>PIC</td><td></td><td>Para ser utilizado para filtrar Tampón de Urea</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Para filtrar Tampón de urea</td></tr><tr><td>PFTE Mortle, 2 mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Mortero de vidrio de borosilicato</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Parte del homogeneizador Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Agitador</td><td>VELP scientifica</td><td>Agitador DLH</td><td>Para ser utilizado para la homogeneización por Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford Ensayo de proteínas</td><td>Laboratorios Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de aluminio</tr><tr><td>Hielo Caja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de poliestireno</td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>Para la centrifugación de tubos de centrífuga de 1,7 mL a 13.000 x g</td></tr><tr><td>Congelador -80&deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td></td><td></td><td></td>de precisión</tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>para esterilización</td></tr><tr><td>Guantes criogénicos para nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td></td><td></td> profesional de ventilación forzada y convección de aire natural <td>para esterilización</td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X solución</td></tr><tr><td>ProteoExtract Kit de Precipitación de Proteínas</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>versión 2.7</td><td>Plataforma de software para el análisis de ontologías genéticas</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>versión 3.0.3</td><td>Plugin para análisis de ontología génica</td></tr><tr><td>Anticuerpo AlphaB Crystallin/CRYAB Novus</td><td>Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón contra CryAB</td></tr><tr><td>Anticuerpo Septin-11</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra septina-11</td></tr><tr><td>Anticuerpo FHL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra FHL-1</td></tr><tr><td>Anticuerpo dermatopontin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra dermatopontina</td></tr><tr><td>Cabra Anti ratón IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>Anticuerpo secundario para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Cabra Anti conejo IgG HRP</td><td>Laboratorios Bio-Rad</td><td>170-5046</td><td>Anticuerpo secundario para inmunotransferencia</td></tr></tbody></table>

protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados ​​en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.

La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados ​​en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) 11 y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) 12 ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli 13 Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa 14 . <p class="jove_content" fo...

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer eficientemente proteínas de la válvula mitral cardíaca humana, adecuadas para análisis proteómico. Este método podría ayudar a descubrir mecanismos patógenos en el campo de las enfermedades de las válvulas cardíacas, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y pronósticos de enfermedades y, con suerte, de dianas terapéuticas. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un flujo de trabajo de extracción eficiente compatible con muchas aplicaciones analíticas.Los resultados constituyen una caracterización más exhaustiva del proteoma de la válvula mitral cardíaca. Además, este protocolo también puede aplicarse a otros sistemas, como la válvula mitral porcina, que presenta un gran parecido con la válvula humana y se utiliza como modelo experimental para evaluaciones de la función valvular. La procedimiento experimental será demostrado por Stefania Ghilardi, una técnica de mi laboratorio.para preparar la válvula mitral humana, comience con un corazón extraído que haya estado bajo isquemia fría durante cuatro a 12 horas. En un cuarto limpio, retire el corazón de la bolsa de transporte y colóquelo en un cubo esterilizado. A continuación, transfiera el corazón a una cabina de seguridad biológica.Allí, utilizando un escalpelo desechable, corte perpendicularmente al eje mayor a la altura de los ventrículos izquierdo y derecho, aproximadamente a cuatro centímetros del ápice. Luego, coloque el corazón sobre un campo estéril. A continuación, desplace la arteria aorta ascendente y la arteria pulmonar para acceder al techo de la aurícula izquierda.En el techo de la aurícula izquierda, utilice pinzas y espátulas para cortar alrededor de la orejuela izquierda y exponer la válvula mitral. La válvula mitral está completamente contenida en el ventrículo izquierdo. Por lo tanto, exponga la valva mitral grande y la valva mitral pequeña.Las comisuras anterolateral y posteromedial definen el límite de las áreas anterior y posterior. Ahora, con tijeras y pinzas no traumáticas, diseque la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo que rodea la válvula mitral. Durante este disecado, identifique la continuidad entre la válvula mitral y la aórtica.A continuación, separe la valva mitral anterior de la valva mitral posterior cortando a lo largo de las comisuras que delimitan la valva posterior. Una vez finalizado el procedimiento, sane la superficie de la cabina con una solución de alcohol isopropílico al 70 % y una solución de peróxido de hidrógeno al 6 %. Ahora, lave la valva posterior de la válvula mitral con solución salina.Luego, corte la válvula en trozos pequeños, cada uno menor a un centímetro cuadrado. Envuelva los trozos individualmente en papel de aluminio y congélelos rápidamente con nitrógeno líquido. Para iniciar la extracción de proteínas, use pinzas para retirar una muestra del nitrógeno líquido y colóquela inmediatamente sobre hielo seco.No permita que la muestra se descongele. A continuación, coloque el mortero, los pistilos asociados y la muestra en un frasco dewar lleno de nitrógeno líquido. Es fundamental que el nitrógeno líquido se utilice para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda.Este paso evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere capacitación técnica para un manejo seguro. Una vez congelado rápidamente, coloque el mortero y el pistilo en una caja de poliestireno que contenga hielo seco. Asimismo, coloque una espátula sobre el hielo seco.A continuación, retire la muestra del papel de aluminio y colóquela en el mortero. Coloque el pistilo grande encima. Usando un destornillador para girar el pistilo, muela la muestra de 15 a 20 veces.Mientras muele, mezcle la muestra con la punta de una espátula fría. Después de usar el mortero grande, repita el proceso de molienda con un mortero más pequeño. Obtener un polvo fino es fundamental para una extracción eficiente de proteínas.Ahora, vierta la muestra en polvo en un tubo de centrífuga de 15 mililitros de masa conocida. Luego, cepille cualquier material restante hacia el mortero utilizando una espátula fría. Mantenga el tubo con la muestra sobre hielo seco y determine rápidamente la masa de la muestra.A continuación, vierta la muestra en un tubo de homogenizador de vidrio. Luego, añada 200 microlitros de tampón de urea por cada 10 miligramos de muestra. Al hacer esto, recupere los residuos que quedan en el tubo enjuagándolos con la alícuota de tampón de urea.Ahora, homogenice la muestra utilizando un pistilo motorizado de PTFE que funcione a 1.500 rpm. Presione lentamente el pistilo sobre la muestra con un movimiento de giro 10 veces. A continuación, transfiera el sobrenadante viscoso de color amarillo a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 mililitros utilizando una pipeta de vidrio.Ahora repita la homogeneización en la muestra restante utilizando la mitad de urea. Recupere el sobrenadante y combínelo con la recolección anterior. A continuación, coloque el tubo en un rotador de tubos durante 30 minutos.Después de 30 minutos, coloque el tubo en una centrífuga fría y centrifugue la muestra a 13.000 G durante media hora. Luego, recupere el sobrenadante y mida la concentración de proteína utilizando el ensayo de proteína de Bradford.Después de realizar el protocolo prescrito, el extracto proteico se estudió mediante una variedad de métodos tras algunos tratamientos adicionales. Un total de 422 proteínas fueron identificadas en el tejido de la válvula mitral mediante electroforesis bidimensional, enfoque isoeléctrico en fase líquida, cromatografía líquida-espectrometría de masas y cromatografía líquida bidimensional-espectrometría de masas. Las 422 proteínas fueron clasificadas utilizando análisis de Ontología Genética.Las regiones extracelulares contenían varias proteínas esperadas y otras proteínas intracelulares y de superficie celular. Muchas de ellas se identificaron por primera vez en válvulas mitrales. Se confirmó la presencia de cuatro de estas proteínas, previamente no identificadas en válvulas mitrales, mediante anticuerpos en tres muestras únicas.Las proteínas son Septina-11, proteína con cuatro dominios y medio LIM uno, Dermatoponina y cristalina alfa B. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer proteínas de la válvula mitral cardíaca para su identificación y cuantificación. Una vez dominado, este protocolo puede realizarse en casi dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, para obtener el mayor rendimiento de proteínas con alta integridad proteica, es fundamental que las muestras no se descongelen durante ninguna de las transferencias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El análisis de la expresión de proteínas en válvulas de ratones embrionarios jóvenes se ha visto obstaculizado por el limitado tejido disponible. Este manuscrito proporciona un protocolo para la preparación de proteínas a partir de regiones de válvulas de ratón embrionarias en desarrollo para el análisis de Western blot.

Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región

Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.

Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Las mitocondrias han especializado los ribosomas que divergieron de sus contrapartes bacterianas y citoplasmáticas. Aquí mostramos cómo mitoribosomes puede obtenerse su compartimiento nativo en las células HEK. El método implica el aislamiento de las mitocondrias de las células de suspensión y consiguiente depuración de mitoribosomes.

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores 

Aprende un protocolo optimizado para extraer proteínas de la válvula mitral humana con fines de análisis proteómico. Este método permite identificar marcadores diagnósticos y terapéuticos en enfermedades valvulares cardíacas.

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

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