Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

El objetivo general de este protocolo es permitir la evaluación cualitativa y cuantitativa de los patrones de arborización de los axones de las neuronas motoras utilizando un microscopio de lámina de luz y software de análisis de imágenes en embriones de ratón. Este método puede ayudar a comprender el desarrollo de las neuronas motoras en coordinación con el movimiento complejo. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar e visualizar los patrones de arborización de los axones de las neuronas motoras desde varios ángulos y analizar cuantitativamente cada nervio individual.

Ya-Ping Yen y Ee Shan Liau, dos estudiantes graduados de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, fije los embriones individualmente en una placa de 24 pocillos con un mililitro de paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS por pocillo a cuatro grados Celsius en un agitador durante la noche. Al día siguiente, lavar los embriones fijados al menos tres veces, cada una durante cinco a 10 minutos, con un mililitro de PBS 1X e incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados.

A continuación, permeabilice cada embrión en un mililitro de 0,5% PBST durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador. Bloquee cada muestra con un mililitro de 10%FBS preparado en 1X PBS durante la noche a 4 grados centígrados en un agitador. Posteriormente, incubar cada embrión con un mililitro de anticuerpo primario anti-GFP a 4 grados centígrados durante 72 horas con agitación constante.

Después de la incubación primaria de anticuerpos, lavar cada embrión con un mililitro de 0,5% PBST en el transcurso de uno o dos días a cuatro grados centígrados en un agitador. Después, aplicar un mililitro de anticuerpo secundario e incubar durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados con agitación constante. Al día siguiente, lavar cada embrión con un mililitro de 0,5% PBST al menos tres veces a cuatro grados centígrados en una coctelera en el transcurso de dos a tres días.

A continuación, incubar cada embrión en un reactivo de aclarado comercial con un índice de refracción de 1,49 nd en un tubo de 1,5 mililitros protegido de la luz a temperatura ambiente durante la noche. Configure ópticas de iluminación 5X/0.1 y ópticas de detección 5X/0.16. Ensamble el portamuestras y el capilar de muestras.

Prepare la cámara de muestras llenándola con solución de limpieza. Para montar el embrión, prepare una punta de pipeta P200 cortando la parte superior para que se ajuste al diámetro del capilar y retire la parte puntiaguda para la fijación de la muestra. A continuación, derrita el extremo romo de la punta de la pipeta con una llama pequeña.

Apague la llama y adhiera rápidamente el embrión verticalmente al extremo derretido. Coloque la parte superior de la punta de la pipeta en el capilar de la muestra y coloque la cámara de muestra preparada en el microscopio. Con el software de imágenes, seleccione Localizar capilar en la pestaña Localizar y ajuste los ejes X, Y y Z.

A continuación, seleccione Localizar muestra y haga zoom a 0,6X para enfocar el embrión. Deje que el tampón de la cámara se equilibre con el embrión durante algún tiempo para eliminar cualquier residuo o burbuja. Para la adquisición de imágenes, en la pestaña Adquisición, defina los parámetros de la trayectoria de luz, como Objetivos de detección, Filtro de bloqueo láser, Divisor de haz, Cámaras y Láseres.

Marque la casilla de verificación Escaneo pivotante para la reducción de sombras. A continuación, defina la configuración de adquisición, Bit Bepth a 16 bits, Zoom en el rango entre 0,36 y 0,7X, iluminación de un solo sitio o iluminación de dos sitios. Haga clic en Continuo y establezca la intensidad del láser, el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de la hoja de luz.

A continuación, pulse Detener para finalizar la adquisición de la imagen. Es importante asegurarse de que la muestra transparente se coloque dentro de la trayectoria de luz más corta para permitir la adquisición detallada de imágenes de estructuras finas arborizadas en nervios motores individuales. Para la adquisición multidimensional, defina la pila Z moviendo la posición z de la primera y la última imagen.

Haga clic en Óptimo para establecer el número de segmento. A continuación, haga clic en Iniciar experimento para adquirir la pila Z seleccionada. Cuando esté hecho, guarde la imagen en formato czi.

Para cuantificar la arborización de los axones, abra el archivo de imagen en el software de análisis de imágenes. Ajuste el color, el brillo y el contraste de la imagen mediante la ventana Ajuste de pantalla para detectar filamentos en función del contraste de intensidad local. A continuación, haz clic en el icono Añadir nuevos filamentos y selecciona el Algoritmo de Autopath en el menú desplegable.

Seleccione la región de interés y, a continuación, defina los puntos inicial y de inicialización asignando las mediciones de diámetro más grande y más delgado que se pueden medir con el modo Sector. Asigne un punto de partida en el borde de la región de interés. Para lograr la adición o eliminación manual de puntos de inicio, primero cambie el modo de puntero, navegue por la selección y, a continuación, cambie y haga clic con el botón secundario en los puntos de interés.

A continuación, seleccione umbrales manuales para los puntos de siembra para asegurarse de que toda la arborización visible esté marcada. A continuación, añada o elimine manualmente los puntos de semilla. Marque la casilla Eliminar segmentos desconectados y elimine los puntos de inicialización alrededor de los puntos de inicio.

Posteriormente, ajuste el umbral para la sustracción de fondo y finalice el proceso. Es necesario eliminar los artefactos de fondo y confirmar que la ruta del detector refleje la verdadera arborización de los axones para una cuantificación precisa. Al final, elija el estilo y el color deseados.

En la pestaña Estadísticas, seleccione Detallado y use el número de filamento, puntos terminales de dendritas para cuantificar las terminales nerviosas motoras como indicador de la arborización de los axones motores. A continuación, exporte la imagen del axón reconstruido como un archivo tiff. LSFM proporciona una visualización 3D detallada de la arborización de los axones motores en embriones de ratón.

Las neuronas motoras se someten al protocolo descrito anteriormente y se marcan con GFP expresada transgénicamente. Para obtener una imagen de la arborización de los axones con mayor detalle y realizar la cuantificación, se puede ajustar la ampliación para que se pueda revelar cada estructura finamente arborizada. Por último, el patrón de arborización de los axones de los nervios individuales de las extremidades anteriores puede reconstruirse utilizando un software de análisis de imágenes.

El algoritmo de autopath en el software rastrea el filamento y cuantifica el número total de terminales de axones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar muestras e imágenes de los axones de las neuronas motoras de embriones de ratón utilizando un microscopio de fluorescencia de lámina de luz. Además, sabrá cómo evaluar cuantitativamente el patrón de arborización de cada nervio motor individual mediante MRS.