Name: Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la arborización axonal de neuronas motoras en embriones de ratón transgénicos Hb9::GFP mediante microscopía de hoja de luz. Este método permite analizar patrones tridimensionales con alta resolución.

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LSFM experimentos y análisis de datos se realizaron en parte con los microscopios ópticos avanzados de la división de servicio instrumento de Sinica de la Academia y con la asistencia de la Sra. Chen Shu Shen. Agradecemos a la Sra. Sue-Ping Lee de la proyección de imagen núcleo centro de IMB considerable asistencia técnica con Imaris análisis de imagen. Inglés edición base de IMB científica revisó el manuscrito. Este trabajo es financiado por el Premio de desarrollo de carrera Academia Sinica (CDA-107-L05), más (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).

Todos los animales se mantuvieron en un patógeno específico (SPF) animal servicio gratuito, aprobado y supervisado por la IACUC de Academia Sinica.
1. fijación
<ol><li>Recolectar embriones de día embrionario 12.5 (E12.5) luego decapitar y los desentrañan.</li>
	<li>Fijar los embriones individualmente en placas de 24 pocillos con 1 mL o bien recién preparado paraformaldehído al 4% en el 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) durante la noche. Incubar a 4 ° C en un agitador.</li>
	<li>Lavar los embriones fijados por lo menos 3 x, de 5-10 minutos, con 1 mL de PBS 1 x e incubar durante una noche a 4 ° C en un agitador para eliminar el paraformaldehido residual.</li>
</ol>2. whole-mount inmunotinción
<ol><li>Permeabilizar cada embrión en 1 mL de 0.5% PBS-Tritón-X-100 (SAFT) durante la noche a 4 ° C en un agitador.</li>
	<li>Bloque de cada muestra con 1 mL de 10% FBS preparado en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C en un agitador.</li>
	<li>Incubar el embrión con 1 mL de anticuerpo primario anti-GFP (1:1, 000 dilución 10% SBF) a 4 ° C durante 72 h con agitación constante para intensificar la señal GFP de nervios motores.</li>
	<li>Después de la incubación del anticuerpo primario, lave con 1 mL de 0.5% Saft en el transcurso de 1-2 días a 4 ° C en un agitador, cambiando el 0.5% Saft por lo menos tres veces.</li>
	<li>Aplicar 1 mL de anticuerpo secundario (1:1, 000 dilución 10% FBS) e incubar durante la noche en la oscuridad a 4 ° C con agitación constante.</li>
	<li>Lavar 3 x con 1 mL de 0.5% Saft a 4 ° C en un agitador en el transcurso de 2-3 días. Mantener las muestras en PBS 1 x a 4 ° C hasta el día antes de la proyección de imagen. Nota: Embriones pueden ser disecados en segmentos más pequeños antes claro, dependiendo de que parte de los embriones a ser reflejada. Miembros anteriores se conservan en este enfoque experimental (figura 1A).</li>
	<li>Incubar el embrión en un reactivo comercial de claro con un índice de refracción de 1.49 nD en un tubo de 1,5 mL, protegido de la luz a temperatura ambiente durante la noche, para representar el embrión transparente para la proyección de imagen. Nota: El volumen del reactivo claro es aproximadamente cinco veces del volumen de muestra.</li>
</ol>3. LSFM (2-3 h)
<ol><li>
Preparación de la muestra
	<ol>
<li>Establecer 5 X / 0.1 iluminación óptica y 5 X / 0.16 óptica de detección. Montar el soporte de muestra y tubo capilar de la muestra (1,5 mm de diámetro interno, verde) y coloque en el microscopio. Nota: Refiérase al Manual de operación del microscopio para los procedimientos de configuración detallada.</li>
		<li>Monte el embrión de la siguiente manera:<ol>
<li>Preparar la P200 punta, cortando la parte superior para que coincida con el diámetro del tubo capilar y quite la parte puntiaguda (~ 3 mm) para la fijación de la muestra.</li>
			<li>Se funden al final romas de punta de la pipeta con una pequeña llama.</li>
			<li>Apagar la llama y colocar rápidamente el embrión verticalmente sobre el extremo fundido.</li>
			<li>Ajuste la parte superior de la punta de la pipeta con la muestra capilar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Permitir que el tampón de cámara se equilibren con el embrión durante 1 min limpiar escombros o burbujas.</li>
		<li>Utilizando el software de imágenes, seleccione localizar capilar en la pestaña de localizar y ajustar la x, y, z ejes para colocar el capilar de la muestra.</li>
		<li>Seleccionar muestra de localizar y zoom de 0.6 X para centrarse en el embrión. Gire el embrión para asegurarse de que el eje de la extremidad de la imagen se alinea con la trayectoria de la luz de las dos fuentes de luz (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adquisición de imágenes
	<ol>
<li>En la ficha de adquisición , defina los parámetros de trayectoria de la luz como objetivos de detección, laser bloqueo filtro divisor de viga, cámaras y láser. Nota: El canal GFP se utiliza en este experimento (longitud de onda de excitación: 488 nm; filtro de emisión: BP 505 a 545 nm, divisor de viga: SPS LP 560).</li>
		<li>Marque la casilla scan de pivote para la reducción de la sombra.</li>
		<li>Definir los ajustes de adquisición: bit de profundidad de 16 bits; zoom, 0.36-0,7 X; iluminación del solo-lado (izquierda) o iluminación de doble lado.</li>
		<li>Haga clic en continuo y ajustar la intensidad de láser, tiempo de exposición, energía del laser y posición de la ficha técnica de iluminación para la adquisición de imágenes más nítidas. Nota: La potencia del láser se mantiene tan baja como sea posible para minimizar el fotodaño.</li>
		<li>Pulse detener para finalizar la adquisición de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adquisición multidimensional
	<ol>
<li>Definir la pila z desplazando la posición Z de la primera y la última imagen. Haz clic en Optimal para establecer el número de segmento.</li>
		<li>Haga clic en Inicio experimento para adquirir la pila de z seleccionada.</li>
		<li>Cuando esté hecho, guardar la imagen en formato .czi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procesamiento de imágenes (opcional)
	<ol>
<li>Proceder con fusión bilateral bajo el canal de Lightsheet de procesamiento si se aplica iluminación de doble lado. MultiView de procesamiento es necesario si se adquieren múltiples vistas para combinar imágenes desde múltiples ángulos.</li>
		<li>Crear una imagen 2D, utilizando los datos de los píxeles de intensidad máximos en el eje de proyección en el canal de Proyección de intensidad máxima .</li>
		<li>En canal de copia , haga clic en subconjunto para seleccionar subconjuntos de imágenes del conjunto original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cuantificación de arborización del axón (a 30 Min para cada nervio Individual)
<ol><li>Abra el archivo de imagen en el software de análisis de imagen (por defecto, la imagen que contiene los datos XYZ se abre en modo Surpass y una vista 3D prestados).</li>
	<li>Ajustar el color de la imagen, brillo y contraste mediante la ventana de Ajuste de la pantalla (edición | Mostrar pantalla de ajuste) para detectar filamentos basados en el contraste de intensidad local.</li>
	<li>Haga clic en el icono de Añadir nuevos filamentos y seleccione el algoritmo Autopath (ningún lazo) en el menú desplegable.</li>
	<li>Seleccione la región de interés (en este caso, el axón divide en segmentos de interés). Haga clic en siguiente cuando haya terminado.</li>
	<li>Definir los puntos de partida y semillas mediante la asignación de las mediciones de diámetro más grande y más delgado, que pueden ser medidas usando el modo de corte .</li>
	<li>Asignar un punto de partida en el borde de la región de interés. Para conseguir manual adición o eliminación de puntos de partida, primero cambie el modo puntero (navegar | Seleccione) y luego Shift + clic derecho en los puntos de interés.</li>
	<li>Seleccione manual umbrales de puntos semilla asegurar que todos los de la arborización visible está marcada. Cambiar el modo puntero (navegar | Seleccione) y luego Shift + botón izquierdo del ratón en los puntos de interés manualmente agregar o quitar puntos de semilla. Nota: Es importante eliminar manualmente los ruidos de fondo y las señales de los nervios vecinos.</li>
	<li>Marque la casilla quitar puntos de semilla alrededor de puntos de partida.</li>
	<li>Asegurarse de quitar desconectado segmentos para permitir la exclusión de los puntos que están muy lejos y que puede representar el ruido de fondo. Indicar la Longitud máxima de la brecha en el siguiente paso para definir el límite superior para la exclusión.</li>
	<li>Ajustar el umbral para sustracción de fondo, que utiliza un filtro gaussiano para estimar la intensidad de fondo de cada voxel.</li>
	<li>Establecer el umbral automático para el diámetro de la dendrita utilizando el algoritmo de área de sección transversal aproximada .</li>
	<li>Sáltese los pasos para el cálculo de la columna vertebral.</li>
	<li>Acabar el proceso y elegir el estilo deseado y el color.</li>
	<li>Desmarque la casilla de volumen en propiedades para ver solamente los axones reconstruidos.</li>
	<li>En la pestaña de estadísticas , seleccione detallado. Usar filamento de . Puntos de la Terminal de dendrita cuantificar los terminales de los nervios motores como indicador de arborización del axón motor. Nota: Anotación estadística puede agregarse si se desea.</li>
	<li>Exportar la imagen del axón reconstruido como un archivo .tif.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
<li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).</li>
<li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A%3AEphA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+%28DINE%29+during+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li>
<li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li>
<li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret%2FGfralpha+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li>
<li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li>
<li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
<li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li>
<li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685(2017).</li>
<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varios pasos en el protocolo pueden ser sometidos a cambios en determinadas circunstancias. Por ejemplo, la duración de la fijación depende de la edad de los embriones, variando de 2 h a 1 o más días utilizando paraformaldehido recién hechos. Puesto que la fijación se lleva a cabo antes de la inmunotinción de Monte todo, para los anticuerpos que son sensibles a la proteína reticulación, metanol puede utilizarse como un agente fijador alternativo. Para un alto cociente signal-to-noise a la coloración, es necesario optimiz...

MNs espinales son parte del sistema nervioso central pero inervan músculos periféricos para controlar el movimiento. En la médula espinal en desarrollo, progenitores de MN (pMNs) se establecen según las señales que emanan de la notocorda y somitas adyacentes. Todos distinguen MNs poste-mitotic se generan luego de pMNs, eventualmente dando lugar a una serie de subtipos de MN en el eje rostrocaudal de la médula espinal1,2. MNs espinales están organizadas topográficamente y anatómicamente bien. La disposición morfológica se correlaciona con la posición de sus respectivos objetivos en la periferia3. Al llegar a sus objetivos de músculo, axones reciben factores neurotróficos exógenos y celular que inducen a extenderse y ramificarse en los músculos. Inervación y ramificación defectos pueden contribuir a la falla para formar a uniones neuromusculares (NMJ). Por ejemplo, factores de neurotrophic glial-derivado (GDNF)-Pea3 inducida es indispensable para la arborización de axon en maximus cutáneos (CM) y4,5de los músculos latissimus dorsi (LD). Además, embriones de ratón knockout DINE muestran defectuosa arborization de nervios frénicos en el diafragma, causando mortalidad y fallo respiratorio inmediatamente después del nacimiento6,7. Por lo tanto, este último paso de la maduración de la MN (por ejemplo, proyección axonal y ramificación) es fundamental para asegurar la comunicación entre las neuronas y las células diana.
Para ver los patrones de la arborización, los investigadores normalmente realizan proyección de imagen confocal o microscopía de fluorescencia de dos fotones de muestras seccionadas o conjunto de montaje8,9,10. Ambas de estas técnicas de microscopía generan aceptable resolución y profundidad de penetración. Microscopía de fluorescencia de dos fotones consiste en la excitación de fluoróforos por absorción simultánea de dos fotones de menor energía11. Puesto que la excitación de dos fotones utiliza la radiación infrarroja, la frecuencia de excitación disminuida contribuye a la dispersión reducida y mejor penetración del tejido hasta 1 mm de tejido, permitiendo la proyección de imagen con mayor profundidad. La microscopia confocal quita filtros fuera de enfoque de señales y sólo recoge la luz dentro del plano focal12. Con este enfoque, imágenes de muestras de diferentes planos focales pueden combinarse para producir una imagen tridimensional (3D) mediante una función de Z-stack. Sin embargo, intensidad de la señal se reduce ya que la mayoría de la luz es bloqueada y aberturas numéricas alta ocultar la profundidad de campo. Más importante aún, ambas técnicas contribuyen al fotoenvejecimiento severo y fototoxicidad puesto que la muestra entera recibe iluminación incluso cuando sólo un plano es reflejado en un momento dado.
Para evitar estas deficiencias, LSFM se ha convertido en una alternativa favorecida, con las ventajas de ser rápido y eficiente a la luz y menos fototóxico13,14. Además, LSFM permite la proyección de imagen multi-view. Este enfoque es particularmente adecuado para visualizar motor axons y sus dispersión terminales ya que esparcir a través del espacio 3D. LSFM supera a las otras dos opciones ya que las muestras se montan en un escenario que permite una rotación alrededor de un eje vertical y los movimientos a lo largo de la x, y y z ejes. Este montaje no sólo permite una visión mínimamente bloqueada de la muestra sino también la elección de un camino de iluminación conveniente, un defecto de la microscopia confocal y de dos fotones, que requieren el montaje de muestras en una lámina plana. Por lo tanto, LSFM es la herramienta más apropiada para la proyección de imagen 3D de arborización de axón y para la cuantificación de los terminales de los nervios motores en embriones de ratón.

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>005029</td><td>Recoger embriones de día embrionario 12.5 (E12.5)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído (PFA)</td><td></td><td></td><td>Para 200ml: Añadir 20ml 10X PBS, 8g PFA en ddH2O. Ajuste el pH a 7,4 con NaOH (10N). Filtre, esterilice y almacene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Para 1L: Añadir 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4 y rellenar con ddH2O. Autoclave y almacenamiento en RT.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Oveja policlonal anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 reactivo de limpieza</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml micro tubo</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Pinza</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris striaght afiladas/afiladas</td> Bisturíes de microcirugía <td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>, de un solo uso</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 microscopio</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.0 software de análisis de imágenes</td><td>Bitplane, Zúrich, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (ratones Hb9::GFP)</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la navegación del axón motor y cuantificación de arborización de axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Neuronas de motor espinales (MNs) extienden sus axones a comunicarse con sus objetivos innervating, así control de movimiento y las tareas complejas en vertebrados. Por lo tanto, es fundamental para descubrir los mecanismos moleculares de cómo motor axones vaya a arborize y estimular su músculo periférico orienta durante el desarrollo y la degeneración. Aunque de líneas transgénicas de ratón Hb9::GFP durante mucho tiempo han servido para visualizar trayectorias de motor axón durante el desarrollo embrionario, descripciones detalladas de todo el espectro de la arborización terminal del axón permanecen incompletas debido a la complejidad del patrón y limitaciones de la microscopía óptica actual. Aquí, describimos un protocolo mejorado que combina la microscopia de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (LSFM) y análisis de imagen robusta cualitativa y cuantitativamente visualizar desarrollo motor axons. Este sistema puede ser fácilmente adoptado para cruzar mutantes genéticos o modelos de la enfermedad de MN con Hb9::GFP líneas, revelando nuevos mecanismos moleculares que conducen a defectos en la navegación del axón motor y arborización.

LSFM ofrece visualización 3D detallada de arborización de trayectoria y axón de MN en ratón embriones. En campo claro, los tejidos aparecen totalmente transparentes después de estar inmerso en el reactivo comercial claro. No hay contracción o hinchamiento de la muestra fue notado después de hasta una semana de almacenamiento en la limpieza de reactivo antes de la proyección de imagen. Bajo canal de la fluorescencia, las neuronas motoras están marcadas con GFP transgenically expreso (<stro...

Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

El objetivo general de este protocolo es permitir la evaluación cualitativa y cuantitativa de los patrones de arborización de los axones de las neuronas motoras utilizando un microscopio de lámina de luz y software de análisis de imágenes en embriones de ratón. Este método puede ayudar a comprender el desarrollo de las neuronas motoras en coordinación con el movimiento complejo. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden observar e visualizar los patrones de arborización de los axones de las neuronas motoras desde varios ángulos y analizar cuantitativamente cada nervio individual.Ya-Ping Yen y Ee Shan Liau, dos estudiantes graduados de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, fije los embriones individualmente en una placa de 24 pocillos con un mililitro de paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS por pocillo a cuatro grados Celsius en un agitador durante la noche. Al día siguiente, lavar los embriones fijados al menos tres veces, cada una durante cinco a 10 minutos, con un mililitro de PBS 1X e incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados.A continuación, permeabilice cada embrión en un mililitro de 0,5% PBST durant

visualization-motor-axon-navigation-quantification-axon-arborization

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Este video muestra un método para rastrear el transporte axonal en neuronas motoras utilizando un sistema de cámara microfluídica. Consiste en cultivar tejidos de médula espinal embrionarios de ratón en pocillos recubiertos de polímeros con medio nutritivo para inducir el crecimiento axonal. El movimiento de los orgánulos teñidos con colorante fluorescente en imágenes en vivo confirma el transporte axonal bidireccional.

Seguimiento del transporte axonal de orgánulos en neuronas motoras mediante un dispositivo microfluídico

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Visualización de la navegación de axones motores y cuantificación de la arborización de axones en embriones de ratón mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. J. Vis. Exp. (2018). Este video demuestra el uso de la microscopía de fluorescencia de...

Visualización de proyecciones de neuronas motoras y ramificación de axones mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Fuente: Boyer, N. P. et. al., Imagen y análisis del transporte de neurofilamentos en el nervio tibial de ratón extirpado. J. Vis. Exp. (2020) Este video muestra el método de fotoactivación de fluorescencia para analizar Transporte de neurofilamentos en axones mielinizados de nervios periféricos. Mediante el seguimiento de neurofilamentos marcados con fluoróforos verdes fotoactivados, la técnica proporciona información sobre el transporte axonal en enfermedades neurodegenerativas.

Imágenes de fotoactivación de fluorescencia del transporte de neurofilamentos en axones de ratón mielinizados 

Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

Presentamos aquí un protocolo optimizado para genotipar, teñir y preparar ratones fetales para la obtención de imágenes de proyecciones de axones nociceptores periféricos en todo el animal, como un método eficaz para evaluar los fenotipos de crecimiento sensorial de axones en ratones modificados genéticamente en desarrollo.

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a visualizar y cuantificar la arborización axonal de neuronas motoras en embriones de ratón transgénicos Hb9::GFP mediante microscopía de hoja de luz. Este método permite analizar patrones tridimensionales con alta resolución.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (Video) | JoVE Journal

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

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