Evaluación de la función Microvascular del tejido adiposo humano mediante videomicroscopía

El objetivo general de esta técnica de videomicroscopía es examinar las propiedades funcionales de microvasos aislados en respuesta a estímulos farmacológicos y fisiológicos, proporcionando información sobre la fisiopatología y los mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular en humanos. Este método es útil para comprender los mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción de la microvasculatura local dentro de la grasa, que se ha relacionado con enfermedades sistémicas. Las principales ventajas de esta técnica son que los vasos sanguíneos permanecen funcionales después de ser retirados del cuerpo humano durante un período de tiempo y son fácilmente examinados por sus propiedades fisiológicas.

La relevancia clínica de este enfoque experimental es que nos permite identificar vías que están alteradas diferencialmente en condiciones de enfermedad y potencialmente descubrir nuevas dianas terapéuticas. Bajo un microscopio de disección de tejidos, use microtijeras y micropinzas para eliminar cuidadosamente la grasa circundante y el tejido conectivo de las pequeñas arterias dentro de la muestra adiposa. Es fundamental distinguir las arterias de las vénulas.

Las arterias suelen tener un diámetro más pequeño, muestran un tono mayor y responden de manera más robusta que las vénulas. Cuando se haya aislado la arterial, use suturas de nailon o seda para atar las ramas. A continuación, use una jeringa de 10 mililitros para llenar lentamente el tubo con solución fresca de Krebs.

A continuación, conecte tubos de goma a los depósitos de presión y pipetas capilares de vidrio dentro de la cámara. A continuación, traslade la arteria disecada a la cámara del órgano y canule el vaso en las pipetas capilares de vidrio. Asegure cuidadosamente ambos extremos de la arteria en las pipetas con suturas de nylon.

Una vez que el recipiente esté seguro, retire lentamente el tampón Krebs de la cámara y agregue dos mililitros de solución fresca de Krebs a la cámara. A continuación, conecte la cámara del órgano a la platina de un microscopio invertido equipado con una cámara de vídeo. Encienda el software de detección de bordes a una frecuencia de muestreo de un kilohercio.

Conecte la tubería presurizada restante al segundo depósito de presión lleno de solución Krebs y, a continuación, conecte los depósitos de presión al transductor de presión. Cuando se hayan conectado todos los tubos, ajuste el bloque calefactor a 37 grados centígrados. A continuación, utilice la unidad de control de presión para aumentar gradualmente la presión intraluminal a cinco mililitros de mercurio cada cinco minutos para lograr la presión experimental adecuada dentro de la luz del vaso sanguíneo aislado.

Deje que el recipiente se equilibre durante 20 a 30 minutos una vez que la presión alcance los 60 mililitros de mercurio y registre el diámetro de la arteria adiposa en reposo. Al final del período de equilibrio, se debe constreñir previamente el vaso sanguíneo hasta aproximadamente el 55% del diámetro basal en reposo añadiendo un microlitro de endotelina 1 directamente al baño cada cinco minutos hasta que el diámetro del vaso se haya constreñido adecuadamente. Para la vasodilatación dependiente del endotelio inducida por flujo, se induce un flujo continuo en el espacio intraluminal de la arteria en direcciones iguales y opuestas para que se pueda desarrollar una diferencia de presión a través del vaso sin alterar la presión intraluminal media de 60 milímetros de mercurio.

Después de tres a cinco minutos, mida la dilatación mediada por flujo. Aumente cada incremento del gradiente de presión en un cambio de agua de 10 centímetros cada cinco o seis minutos hasta un máximo de 100 centímetros de agua. Después de evaluar la dilatación del recipiente mediada por flujo, regrese los depósitos de presión a la misma altura para detener la inducción del flujo.

Luego, de inmediato, pero con cuidado, reemplace la solución de la cámara con una solución fresca de Krebs sin alterar la arteria suspendida y permita que el vaso comience a regresar al diámetro de referencia durante 20 a 30 minutos. Una vez que la arteria ha vuelto al diámetro basal en reposo, se puede evaluar una vasodilatación sutil dependiente del endotelio mediada por colina. Esto comienza por pre-constreñir el vaso a aproximadamente el 55% de su diámetro en reposo con endotelina 1, como se demostró anteriormente.

Una vez lograda la preconstricción, añadir dos microlitros de dosis crecientes de acetilcolina directamente al baño. Registre el cambio en el diámetro arterial cinco minutos después de la administración de cada dosis. Una vez finalizada la respuesta a la dosis de acetilcolina, evaluar la vasodilatación independiente del endotelio y la viabilidad de los vasos mediante la administración secuencial de papaverina y vasodilatador independiente del endotelio directamente en el baño.

Las respuestas de vasodilatación dependientes del endotelio al aumento del flujo y al estrés puro o acetilcolina se atenúan significativamente en las arterias adiposas viscerales frente a las subcutáneas en la obesidad humana. Sin embargo, la vasodilatación independiente del endotelio en respuesta a la papaverina no se altera diferencialmente entre los dos componentes, lo que sugiere que la disfunción vascular en los dominios viscerales es en gran medida el resultado de la disfunción a nivel del endotelio, al menos en las primeras etapas de la enfermedad. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en tres a cinco horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo y ser diligente, ya que incluso los daños menores en los vasos sanguíneos pueden sesgar los resultados. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la transfección de siRNA de los vasos sanguíneos, para responder preguntas adicionales sobre el impacto de genes específicos en la función vasomotora en las enfermedades humanas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del tejido adiposo y la microcirculación exploraran el impacto del microambiente del tejido adiposo en la salud vascular local en la obesidad humana.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sondear directamente la fisiopatología de segmentos enteros intactos de vasos sanguíneos humanos, que se extraen de sujetos vivos, un proceso que no se puede replicar mediante imágenes no invasivas.