Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren Drosophila Motor Neuron Degeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine mechanische Schädigung von Motoneuronen in Drosophila-Larven zu induzieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neurodegenerativen Forschung zu beantworten, wie z.B. die zeitliche Abfolge zellulärer Ereignisse, die zur Neurodegeneration führen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie kostengünstig ist und Geräte verwendet, die die meisten Drosophila-Labore bereits haben.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Neurodegeneration antreiben. Um das Protokoll zu beginnen, wählen Sie 10 Larven des zweiten oder dritten Stadiums aus einem Fläschchen oder einer Flasche Drosophila aus, die wandernde Larven des dritten Stadiums enthalten, die bei 25 Grad Celsius kultiviert wurden. Nehmen Sie die einzelnen Larven mit einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig auf, ohne sie zusammenzudrücken.

Setzen Sie die 10 Larven direkt in eine Glasschale mit kaltem 1x PBS, um Speisereste zu entfernen und die Beweglichkeit der Larven zu verlangsamen. Identifizieren Sie die Larven des dritten Stadiums an ihren Spiracles am vorderen Ast und die Larven des zweiten Stadiums an ihrer geringeren Größe und den keulenartigen vorderen Spiracles. Setzen Sie jede Larve auf ein CO2-Betäubungsgerät.

Rollen Sie jede Larve unter einem Präpariermikroskop vorsichtig auf ihre dorsale Seite, um die segmentalen Nerven in der gesamten Kutikula sichtbar zu machen. Es ist wichtig, jede Larve vorsichtig auf die Rückenseite zu rollen, um die Segmentnerven durch die Kutikula vor einer Verletzung sichtbar zu machen. Beginnen Sie an den Mundhaken und positionieren Sie die Pinzette der Größe 5 etwa zur Hälfte bis zu zwei Dritteln der Länge der Larve.

Nach der Positionierung kneifen Sie etwa ein Drittel der ventralen Kutikula mit den Forceps der Größe 5 zusammen. Um sicherzustellen, dass die Segmentnerven der Larven verletzt werden, wenden Sie genügend Kraft an, um die Segmentnerven zu zerquetschen, aber lassen Sie die Kutikula intakt. Um die richtige Kraftmenge zu bestimmen, zerkleinern Sie 10 Larven und stellen Sie sicher, dass die Sterblichkeitsrate nach fünf Stunden unter 50 % liegt. Übertragen Sie die Larven vorsichtig auf eine Fruchtsaft-Agarplatte, die etwa 0,5 Gramm Hefepaste enthält.

Platzieren Sie jede Larve so, dass ihr vorderes Ende auf der Hefepaste liegt, um sie weiter zu füttern. Legen Sie Agarplatten mit Hefepaste und 10 verletzten Larven auf den Boden einer leeren 100 x 15 Millimeter großen Petrischale. Decken Sie die Petrischale mit einem feuchten Papiertuch ab und achten Sie darauf, dass das Papiertuch weder die Larven noch die Agarplatten berührt.

Stellen Sie dann die Petrischale in ein luftdichtes Gefäß bei Raumtemperatur. Entnehmen Sie schließlich Larven zur Dissektion nach bestimmten Zeiträumen nach der Verletzung. Vor der Verletzung zeigen neuromuskuläre Wildtyp-Verbindungen (NMJs) den präsynaptischen aktiven Zonenmarker Brp in Apposition mit dem postsynaptischen Marker Dlg über den gesamten NMJ.

Eine mechanische Schädigung der segmentalen Nerven kann eine mittelschwere bis schwere Neurodegeneration induzieren, bei der den mit Dlg gefärbten Butons nun das präsynaptische Wirkzonenprotein Brp fehlt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die neuronale Verletzungen untersuchten, um die zeitliche Abfolge zellulärer Ereignisse zu erforschen, die zur Neurodegeneration an der neuromuskulären Verbindung in Drosophila führten.