Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores

El objetivo general de este protocolo analítico es extraer y cuantificar simultáneamente los dos fármacos anticancerígenos doxorrubicina y mitomicina C, administrados conjuntamente por nanopartículas híbridas polímero-lípido, y el metabolito de la doxorrubicina, doxorrubicinol, en matrices biológicas utilizando un método de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa simple y robusto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanomedicina, como por ejemplo cómo diseñar un sistema nanoportador eficaz basado en la nanofarmacocinética de las combinaciones de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación simultánea de tres compuestos farmacológicos en la misma matriz biológica, sin necesidad de cambiar la fase móvil de la HPLC.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre los comportamientos biológicos de la doxorrubicina, la mitomicina C y el doxorrubicinol en los tumores de mama primarios. También se puede aplicar a otros tipos de cáncer tratados con medicamentos similares. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos eficientes de preparación de muestras son difíciles de aprender.

Para comenzar este procedimiento, recolecte y congele la sangre entera, los órganos principales y el tumor de mama como se describe en el protocolo de texto. Pese rápidamente los tejidos congelados y registre el peso en el cuaderno de notas del laboratorio. Luego, transfiéralos a un tubo cónico de fondo redondo de 13 mililitros.

A continuación, añade entre uno y cinco mililitros de tampón de lisis celular helado. Usando un homogeneizador de mano eléctrico, homogeneice el tejido con un movimiento de carrera hacia arriba y hacia abajo en hielo a 18.000 rpm. Después de esto, lave la sonda del generador de dientes de sierra de 10 milímetros del homogeneizador con agua destilada desionizada.

Lave la sonda con etanol al 70% y luego nuevamente con agua destilada desionizada. Transfiera 50 microlitros de homogeneizado de tejido o sangre completa a un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitros. Luego, pico con cinco microlitros de un estándar interno de 2.000 nanogramos por mililitro 4-MetilUmbeliferona.

Agregue un solvente de extracción helado que contenga 150 microlitros de acetonitrilo y 100 microlitros de acetato de amonio de cinco milimolares. Vórtice vigorosamente la mezcla durante dos minutos. Centrifugar a 3.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Después de esto, transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo y preenfriado. Utilice un chorro lento de gas nitrógeno para evaporar el sobrenadante a 60 grados centígrados con protección contra la luz. A continuación, reconstituya el residuo seco con 100 microlitros de metanol helado.

Vórtice vigorosamente durante 30 segundos. Centrifugar a 3.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un inserto de vial de HPLC.

Coloque los viales de muestra en una bandeja de muestreador automático para la inyección. Para comenzar, prepare la fase móvil de HPLC como se describe en el protocolo de texto. Establezca las condiciones iniciales de la composición de la fase móvil en 16,5 % de H2O y 83,5 % de acetonitrilo.

Ajuste el caudal isocrático a 1,0 mililitros por minuto. A continuación, separe los fármacos utilizando la condición de fase móvil de gradiente como se describe en el protocolo de texto. A continuación, configure el detector UV en dos canales: uno a 310 nanómetros para la 4-metilumbeliferona estándar interna y el otro a 360 nanómetros para la mitomicina C. Después de esto, configure el primer canal del detector de florescencia a una longitud de onda de excitación de 365 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 445 nanómetros para la 4-metilumbeliferona.

Establezca el segundo canal en una longitud de onda de excitación de 480 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 560 nanómetros para doxorrubicina y doxorrubicinol. Para empezar, utilice el muestreador automático para inyectar 15 microlitros de la muestra. La composición de la fase móvil de gradiente programada cambia automáticamente al aumentar la composición de acetonitrilo de cero a 18 minutos.

Después de 18 minutos, la condición de fase móvil se restablece a la condición inicial y se reequilibra para la siguiente inyección. Después de analizar cada muestra, anote los picos de los compuestos del medicamento y sus tiempos de retención. A continuación, utilice el software de HPLC para integrar el área máxima bajo la curva para los compuestos del fármaco.

Calcule el porcentaje de recuperación del fármaco y la relación del área bajo la curva entre cada compuesto del fármaco y el estándar interno, como se describe en el protocolo de texto. En este procedimiento, se detectan dos fármacos contra el cáncer, la doxorrubicina y la mitomicina C, junto con el metabolito de la doxorrubicina, el doxorrubicinol, sin interferencia biológica. El análisis de HPLC muestra que cada fármaco está bien separado de los demás.

El método de HPLC desarrollado muestra menos del 15% de variación en la precisión y exactitud intra e interdiaria para cada uno de los fármacos estudiados, tanto en sangre total como en diversas matrices biológicas, lo que indica una excelente reproducibilidad. A continuación, se determina la farmacocinética y la biodistribución de la administración conjunta de doxorrubicina y mitomicina C basada en nanopartículas pegiladas o de larga circulación. En la sangre, se observa que las concentraciones de fármacos administradas por las nanopartículas híbridas polímero-lípidos a lo largo del tiempo son al menos seis veces más altas que en las soluciones de fármacos libres equivalentes.

En un tumor de mama ortotópico, las nanopartículas híbridas de polímeros y lípidos pueden administrar conjuntamente doxorrubicina y mitomicina C en su proporción sinérgica de fármacos. En comparación con la solución farmacológica libre, se observa que las nanopartículas tienen una mayor acumulación tumoral. Esto se debe a la circulación sistemática prolongada, que permite que las nanopartículas aprovechen los efectos mejorados de permeabilidad y retención del tumor.

La formación cuantitativa de doxorrubicinol en el tumor de mama durante 24 horas, junto con la apoptosis tumoral mejorada, indica que la biodisponibilidad del fármaco es fundamental para diseñar una formulación de nanopartículas eficaz. Utilizando este método de HPLC, se demostró con éxito que las nanopartículas híbridas de polímeros y lípidos pueden administrar con precisión una combinación sinérgica de fármacos en las células cancerosas in vivo, lo que conduce a una quimioterapia mejorada. Esta técnica se puede realizar en unas dos horas si se realiza correctamente.

Para minimizar la posible depredación del fármaco, es importante recordar evitar la luz solar directa y mantener la muestra en hielo mientras se intenta este procedimiento. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la nanomedicina explorara la nanofarmacocinética de la combinación de fármacos y diseñara mejor la formulación de nanopartículas eficaz para la terapia contra el cáncer. Después de ver este video, debe comprender cómo extraer y detectar simultáneamente doxorrubicina, mitomicina C y el metabolito de la doxorrubicina, doxorrubicinol, en una amplia gama de muestras biológicas que contienen nanopartículas cargadas con la combinación de medicamentos.

No olvide que trabajar con medicamentos contra el cáncer y ácido puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben aplicar precauciones de seguridad como el uso de guantes, gafas y batas de laboratorio mientras se realiza este protocolo.