Modelado Quimioterapia Leucemia resistente In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es modelar mejor la leucemia linfoblástica aguda resistente, o LLA, in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el tratamiento de la LLA refractaria sobre cómo el microambiente de la médula ósea influye en la resistencia quimioterapéutica de las células LLA. Las principales ventajas de esta técnica son que es considerablemente más barata y requiere menos tiempo que la utilización de modelos animales tradicionales para examinar la defensa de los fármacos en células ALL refractarias.

Comience sembrando de cinco a 20 veces 10 a la sexta células leucémicas en 10 mililitros de medio de cultivo específico para tumores en una placa de 100 milímetros de 80 a 90% de células estromales de médula ósea confluentes u osteoblastos. Cada cuatro días, incline la placa hacia un lado y aspire todo menos un mililitro del medio, teniendo cuidado de no perturbar la capa de células adherentes. Luego, agregue con cuidado nueve mililitros de medio de cultivo de células leucémicas frescas gota a gota en la esquina de la placa a lo largo del costado para garantizar una interrupción mínima de las células adheridas.

Después del 12º día de cocultivo, pipetee suavemente el medio de cultivo hacia arriba y hacia abajo sobre la placa aproximadamente de cinco a 10 veces para recolectar las células leucémicas flotantes. Y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, vuelva a sembrar las células en una nueva placa de 80 a 90% de células estromales de médula ósea confluentes, u osteoblastos, como se acaba de demostrar.

Para el cuarto día, se habrán formado tres subpoblaciones de células leucémicas, con las células leucémicas suspendidas flotando libremente en el medio. Las células leucémicas Phase Bright se adhieren a la superficie de la monocapa de células adherentes, y las células leucémicas Phase Dim migraron por debajo de la monocapa. Para preparar las columnas de cuentas G10, primero vuelva a calentar 30 mililitros de medio de cultivo celular por columna a 37 grados centígrados en un baño de agua.

A continuación, use pinzas para tirar de la lana de vidrio en hebras finas y sueltas. Y agregue varias capas de hebras ligeramente empaquetadas a una jeringa de 10 mililitros por columna necesaria. Cuando la jeringa esté llena en 2/3, conecte una llave de paso unidireccional en la posición cerrada a la punta y sujete la jeringa en un soporte de anillo lo suficientemente alto como para que se pueda colocar un tubo de recolección cónico de 50 mililitros debajo de la llave de paso.

Ahora, coloque un tubo de recolección debajo de la columna de la jeringa. Y utilice una pipeta de 10 mililitros para añadir gotas de partículas G10, suspendidas en PBS, sobre la lana de vidrio. Continúe agregando las partículas G10 hasta que se forme un pellet de dos mililitros.

Luego, agregue dos alícuotas de mililitros del medio precalentado a la columna. Y abra lentamente la válvula de llave de paso, de modo que el medio fluya fuera de la columna gota a gota. Cuando 10 mililitros de medio se hayan drenado completamente a través de la columna, cierre la llave de paso.

Deseche el flujo y coloque un nuevo tubo de recolección debajo de la columna. Para recolectar la subpoblación de tumores en suspensión, aspire el medio de la placa de cocultivo de células leucémicas y use el mismo medio para enjuagar suavemente la placa una vez. Luego, transfiera la subpoblación de células leucémicas en suspensión flotante a un tubo cónico de 15 mililitros.

Para cosechar la subpoblación de tumores Phase Bright, agregue 10 mililitros de medio fresco nuevamente a la placa de cocultivo. Y enjuague aproximadamente cinco veces lo suficientemente vigoroso como para eliminar las células leucémicas adherentes sin desalojar la monocapa de células adherentes. Luego, transfiera la subpoblación de Phase Bright a su propio tubo cónico de 15 mililitros.

Para recolectar la subpoblación de tumores Phase Dim, elimine el medio restante con un enjuague de PBS de un mililitro. Y separar las células con tres mililitros de tripsina a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, golpee suavemente los lados de la placa para desalojar las células adheridas, seguido de la adición de un mililitro de FBS para detener la reacción enzimática.

Luego, enjuague el suero de tres a cinco veces para separar los agregados de células grandes. Y transferir la subpoblación de Phase Dim no purificada a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Cuando se hayan recolectado todas las subpoblaciones, gire las celdas.

Y vuelva a suspender cada uno de los pellets en un mililitro de medio precalentado. Con la llave de paso completamente cerrada, para cada subpoblación, utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir todo el volumen de un mililitro de células, gota a gota, en la parte superior de una de las columnas G10 preparadas, asegurándose de que las células permanezcan encima o dentro del pellet G10. Deje que las células se incuben en el gránulo G10 durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Luego, agregue de uno a tres mililitros de medio fresco precalentado a la columna. Y abra la llave de paso para que el medio salga lentamente de las columnas, gota a gota. Continúe agregando medio precalentado a las columnas, en incrementos de uno a dos mililitros.

Cuando se haya recolectado un total de 15 a 20 mililitros de células leucémicas, cierre la llave de paso y tape el tubo de recolección. A continuación, gire las celdas y vuelva a suspender el pellet en el tampón de análisis posterior adecuado. Después de la tripsinización de la capa de células adherentes, se observan dos poblaciones distintas de células mediante el análisis de dispersión frontal frente a lateral.

Después de la separación de G10, se recupera una población pura de células ALL. De particular interés, todas las células Phase Dim recuperadas de células estromales de médula ósea, o cocultivos de osteoblastos, presentan poca o ninguna muerte después de su exposición a la quimioterapia citotóxica. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar realizar estos pasos lo más correctamente posible para reducir cualquier cambio fenotípico que pueda ocurrir en las células leucémicas.

Esta técnica proporciona una forma para que los investigadores en el campo de la investigación de la leucemia modelen la leucemia resistente a la quimioterapia en un modelo in vitro que se asemeja más al microambiente de la médula ósea.