Name: Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a visualizar trampas extracelulares de macrófagos mediante microscopía confocal en muestras pulmonares de humanos y ratones. Este protocolo detallado permite estudiar respuestas inmunitarias e inflamación con alta reproducibilidad.

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Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Monash, la salud nacional y Consejo de investigación médica y el pulmón de Monash e Instituto del sueño. Los autores desean dar las gracias al personal de inmunología clínica en salud de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass y Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) ayuda con la microscopía confocal de imágenes, y los autores reconocen las instalaciones MMI de la Universidad de Monash. Los autores reconocen las instalaciones y asistencia científica y técnica de la plataforma de la histología de Monash.

este protocolo sigue experimentos aprobados en: (1) los seres humanos por el Comité de ética de Monash Medical Centre y (2) animales por el Comité de ética de la Universidad de Melbourne.
 1. macrófagos de lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li>BAL de uso para obtener los macrófagos del pulmón en: (1) humanos sujetos por broncoscopia 6 y (2) ratones utilizando aspiración intra traqueal 13 . 
	Nota: La adquisición de los macrófagos generalmente hace algunos activación de estas células. Los macrófagos se obtienen de pacientes que requieren una broncoscopia para investigar un problema médico y no todos los temas pueden ser adecuados para el análisis de METs (esto deberá ser determinado para cada proyecto individual).
	<ol><li>Tomar la solución BAL y el giro de (500 x g por 10 min) para formar una pelotilla, lavar dos veces con medio de cultivo (Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) con suero de ternera fetal de 5% y 1% L-glutamina) a temperatura ambiente y luego diluir las células en 4 mL de cultura medi Um.</li>
		<li>Si es necesario, mediante solicitud formal cuenta diferencial; la mayoría de las células (generalmente &#62; 80%) serán los macrófagos 6. 
		Nota: Esto será generalmente interpretado por un servicio de histología clínica utilizando la apariencia morfológica de las células diferentes tipos 6.</li>
		<li>Realizar una célula macrófago viable contar con la solución BAL mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro. 
		Nota: Solución BAL se obtiene de los seres humanos y ratones como se menciona en el paso 1.1.</li>
		<li>Agregar de 1-4 x 10 5 macrófagos para placas de 24 pocillos en cubreobjetos en 500 μl de medio de cultivo por pozo y dejar toda la noche a 37 ° C, las células se adhieran al cubreobjetos. Para muestras humanas, añadir antibióticos (p. ej., penicilina y estreptomicina, 10 4 U/mL) para prevenir la contaminación bacteriana.</li>
	</ol></li></ol> 2. Etiquetado/microscopia de la inmunofluorescencia de los macrófagos de BAL Nota: las células se adhieren sobre cubreobjetos según lo mencionado arriba.
<ol><li>Lave las células una vez con tampón fosfato salino (PBS) y el medio de cultivo. Fijar las células en fijador de paraformaldehido periodato/lisina (PLP) de 2% durante 10 minutos</li>
	<li>Lavar las células brevemente en PBS y luego permeabilizar en 0.2% Tween 20 en PBS durante 20 min</li>
	<li> Células de bloque con sueros de pollo 10% en 5% albúmina de suero bovino (BSA) diluido en PBS durante 30 minutos</li>
	<li>Incubar con control primario y el isotipo de anticuerpos por 1 h a temperatura ambiente en concentraciones de 1: 100 (detalles más específicos se enumeran en la Tabla de materiales) a 37 ° C. 
	Nota: Las muestras de BAL, un marcador específico de macrófagos generalmente no es necesario.</li>
	<li>Después de la adición de anticuerpos primarios, lave las células en PBS e incubar más con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las secciones en PBS y Monte con medio de montaje basado en DAPI de visualización mediante un microscopio confocal (como se mencionó anteriormente) en laser excitaciones 405, 488, 561 y 647 nm y 40 X, 1,0 NA aceite objetivo.</li>
</ol> 3. Muestras de tejido pulmonar Nota: para los estudios en vivo del tejido pulmonar, estudio de las muestras después de la exposición relevante (por ejemplo, según lo descrito por O &#39; Sullivan et al. 7). la exposición que es más relevante para este experimento son microorganismos infecciosos, especialmente bacterias. Cepas de ratón que podrían ser utilizadas para este método son hombre, ratones C57BL/6 y BALB/c, 10-12 semanas de edad y peso 25-30 g.
<ol><li>Euthanize ratones, a través de una inyección intraperitoneal de ketamina (400 mg/kg) y xilacina (40 mg/kg). Abrir la cavidad torácica y exponer los pulmones y el corazón usando tijeras y pinzas quirúrgicas.
	<ol><li>Infundir PBS caliente usando una aguja de calibre 21 en el ventrículo derecho para lavar la sangre de los vasos por 30 s, luego infundir 10 mL de fijador PLP 2% durante 30 s (en el ventrículo derecho).</li>
		<li>Usar caliente PBS (42 ° C) para lavado de la cavidad torácica abierta. Intubar la tráquea con una aguja de calibre 21 y un pedazo de 0,8 mm tubo cortado a la medida e inyectar 800 μl de precalentado (hasta 42 ° C), bajo punto de fusión punto de solución de agarosa al 3%.</li>
		<li>Lazo frente a la tráquea con seda trenzada (4.0 USP). Coloque el hilo alrededor de la tráquea, justo debajo del punto de inserción de la cánula y garantizar por medio de un nudo simple. Para que solidifique la agarosa, administrar PBS helado alrededor de los pulmones. Retire los pulmones y el corazón como a una cuadra de la cavidad torácica, usando tijeras y disección Roma. Quite individualmente cada pulmón y luego fijarlos por 16 h en 2% PLP o formalina al 4 ° C.</li>
		<li>Almacenar a los especímenes en PBS a 4 ° C hasta el tejido seccionado. Estos métodos de obtención de tejido pulmonar han sido previamente descritos 13.</li>
	</ol></li> <li>Para preparar el tejido pulmonar las muestras utilizan los pasos siguientes.
	<ol><li>Fix pulmón tejidos (resecados en el paso 3.1) del tejido en formalina 10% de tampón natural durante 24 h a temperatura ambiente. Transferencia de 75% de etanol y coloque en un procesador de tejidos en un ciclo de 12 h, (2.5 h en 75% EtOH, 3 h en EtOH absoluto, 3,5 h en solvente 3B y 3 h en parafina).</li>
		<li>Embed en parafina estándar para crear formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) los bloques que se almacenan a temperatura ambiente. 
		Nota: En esta etapa, es generalmente conveniente cortar las secciones del pulmón para portaobjetos estándar.</li>
		<li>Cortar las secciones del pulmón FFPE en 4-5 μm de espesor utilizando un micrótomo y Monte en carga, portaobjetos recubiertos como se describió anteriormente o &#39; Sullivan et al. 7</li> <li>montar diapositivas, poner 3 gotas de medio de montaje de 60 mm x 24 mm cubreobjetos (tamaño 1.5), invertir la diapositiva sobre el cubreobjetos y empuje hacia fuera exceso medio. Herméticamente sellado con esmalte de uñas y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparación/microscopia de muestras de tejido pulmonar <ol><li>a la cera, rehidratar y prepare la muestra de tejido de pulmón FFPE con solución de recuperación de antígeno.
	<ol><li>Horno seco el FFPE desliza durante 60 min a 60 ° C. Luego que los portaobjetos en solución de xileno durante 30 min y la transferencia de solución de etanol 70% por 5 min a temperatura ambiente. Enjuague en agua del grifo.</li>
		<li>Lugar en envoltura plástica resistente al calor y recuperación de HIER-antígeno en una olla a presión durante 10 minutos en 10 m/mol/L Tris, pH 9.0 de 1 mmol/EDTA. Fresco durante 20 min lavado dos veces en agua corriente durante 5 minutos en un rockero, luego una vez con PBS en rocker.</li>
		<li>Bloque con suero de pollo 10% 5% BSA/PBS por 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Manchar el tejido.
	<ol><li>Definir METs en macrófagos, añadir anticuerpos primarios (MMP-9, H3Cit y F4/80) en el 1% BSA/PBS durante 16 horas a 4 ° C en la dilución 1/100 (detalles específicos sobre cantidades de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales). Lave dos veces con PBS durante 5 minutos en un eje de balancín de.</li>
		Anticuerpos <li>lograr detección fluorescente por la incubación con secundario correspondiente en 1% BSA/PBS durante 40 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos son: anti-ratón (1) pollo 488 (verde), (2) pollo contra cabra 594 (rojo) y anti-ratón (3) el burro (ahora rojos) 647.</li>
		<li>Lavar las secciones en PBS y Monte con DAPI que contiene el medio de montaje para la tinción de la cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Obtener imágenes fluorescentes usando un láser confocal de barrido cabeza conectada a un microscopio invertido.
	Láseres de <ol><li>Excite la preparación con 405, 488, 561 y 647 nm. Capturar imágenes de 512 x 512 píxeles de plano solo haciendo clic en la línea secuencial, nivelación de botón (2 promedio de la línea) usando 20 X 0.1 aceite aire NA y NA 40 X 1.0 objetivos.</li>
		<li>Obtener por lo menos diez campos de vista por la sección de análisis de datos y para cada resultado (es decir, alta potencia 10 campos de vista (HFOV) para el control, 10 para la muestra estimulada, etc., para cada ratón). 
		Nota: Para obtener una muestra representativa de todo el campo, un sistema de matriz puede utilizarse en los que se divide el campo en diferentes secciones y para cada muestra diferente de la misma matriz se utiliza para seleccionar campos de vista (por ejemplo, el campo se puede dividir en 9 secciones, y desde el centro y las 4 esquinas, se toman dos VOAF).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensional (3D) imagen de METs Nota: METs son estructuras 3-d, tomando z-stack múltiples imágenes, que se reconstituyen, pueden dar valiosa información.
<ol><li>Sección las muestras de pulmón de bloques de parafina, a 200 μm con un vibratome a una amplitud de 1,8 mm y velocidad de 0.1-0.5 mm/s.</li>
	<li>Bloque de tejido pulmonar con 20% de suero correspondiente (10% de suero de ternero fetal y suero de pollo 10%) y luego permeabilizar en PBS suplido y 3,75% Triton-X 100 de 7 h a temperatura ambiente en agitación suave.</li>
	<li>Mancha las secciones de 16 h a 4 ° C con los anticuerpos primarios pertinentes (MMP-9, H3Cit y F4/80) en volúmenes de 200 μL en tubos de microcentrífuga (concentraciones de anticuerpos aparecen en la Tabla de materiales).</li>
	<li>Lávese las secciones en PBS 3 veces durante 10 minutos antes de la incubación con los anticuerpos secundarios relevantes a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Mancha las secciones del pulmón para DAPI (1:5, 000) en la solución por 20 min, antes de agregar el cubreobjetos al microscopio portaobjetos en PBS.</li>
	<li>Obtención de imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal invertido (40 x 1,3 NA) equipado con 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm y láseres de 635 nm.</li>
	<li>Grabar 3D z-pilas de 0.54 μm de grosor con el seccionamiento de z óptimo para el objetivo de 40 x 1,3 NA aceite. 
	Nota: El software utilizado variará dependiendo del microscopio individual. Un ejemplo de cómo el software se puede utilizar para un microscopio se proporciona en archivo adicional 1.</li>
</ol> 6. Análisis de imagen Nota: el análisis de las muestras requiere el uso de software de análisis de imágenes específicas y los ejemplos se enumeran en la Tabla de materiales. Mientras que el análisis de los resultados dependerá del programa específico utilizado, los puntos enumerados a continuación son importantes.
<ol><li>Las muestras de análisis de BAL <ol><li>definir el número de macrófagos, seleccione el canal azul para DAPI y asignar un tamaño mínimo para las células (p. ej., &#62; 18 μm de diámetro). El software relevantes, medir el número de macrófagos por campo.</li>
		<li>Cuenta el número de células que tienen las características de un MET por la presencia de cromatina extracelular detectada por DAPI con coexpresión de marcadores (por ejemplo, MMP12, PAD2 y H3Cit). 
		Nota: El número de marcadores que pueden ser analizadas depende del número de láseres disponibles, pero idealmente además de DAPI, por lo menos dos otros marcadores deben ser incluidos. Otras menos parámetros específicos para la expresión de MET (p. ej., número de células con un núcleo agrandado y cromatina extracelular) se puede utilizar.</li>
		<li>Para comparar la expresión MET BAL muestras (entre el control, humo y humo/DNasa tratado grupos), analizan un mínimo de 100 macrófagos BAL por ejemplo.</li>
		<li>Para medir el anticuerpo secundario e isotipo controlar los niveles de fluorescencia; medir un mínimo de 100 células en cada muestra de su fluorescencia. Medir el nivel medio de la fluorescencia de fondo para cada marcador (por ejemplo, H3Cit) utilizando el software estándar de.</li>
		<li>Para definir expresión MET, contar las células con el fenotipo típico (e.g., cromatina extracelular con coexpresión de H3Cit y MMP9) y para cada MET, medir el nivel de fluorescencia de marcadores (por ejemplo, H3Cit y MMP9). Excluir las células produciendo METs si su coloración no era sobre el control de fondo e isotipo.</li>
		<li>Para muestras humanas de BAL, analizar un mínimo de 100 células por cada muestra el porcentaje de macrófagos que hacen METs. Para las muestras de murinas, como las células son más pequeñas y METs son más difíciles de definir, analizar un mayor número de células por cada muestra (p. ej., 200 macrófagos).</li>
	</ol></li> <li>Análisis de muestras de tejido pulmonar <ol><li>para determinar la presencia de METs en tejido pulmonar, utilice el marcador de macrófagos específicos como F4/80.</li>
		<li>Definir la presencia de METs en tejido pulmonar por medio de la co-localización de F4/80 en las células que expresan la cromatina extracelular con otros parámetros que se enumeran en la sección 6.1.</li>
		<li>Determinar los niveles de fluorescencia en muestras con anticuerpo secundario del fondo y los controles de isotipo. Excluir METs del análisis que sobre el fondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen ninguna revelaciones a realizar en relación con este trabajo.

El método descrito en este informe se basa en que para la determinación de la presencia de redes14. Los macrófagos son el tipo celular dominante en muestras de BAL y este método de colección es especialmente adecuado para el estudio de METs. Si glóbulos rojos están presentes en el BAL, estas células deben lisis mediante el uso de cloruro de amonio. El procedimiento de BAL generalmente activa los macrófagos y por lo tanto se espera que habrá METs presentes en las muestras no estimuladas. Los macróf...

Neutrófilos trampas extracelulares (redes), primero fueron descritos por Brinkmann et al. 1 que predominantemente se producen en respuesta a la infección (especialmente a las bacterias) y tienen un papel importante en host defense1,2. También se han descrito para ocurrir en respuesta a enfermedades no infecciosas, incluyendo vasculitis y lupus eritematoso sistémico (les); y a los mitógenos forbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Se ha reconocido recientemente que otros tipos celulares pueden también producir trampas extracelulares, incluyendo los macrófagos. Trampas extracelulares del macrófago (MET) todavía no son una entidad bien definida en la literatura4,5. Recientemente hemos establecido los métodos para detectar la presencia de METs tanto in vitro e in vivo6,7. En este artículo, se describen la medida de METs usando microscopia confocal.
Características clave de NETosis que la distinguen de otras vías celulares (tales como apoptosis8) son la extrusión de la cromatina en relación con: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) la expresión de proteasas de gránulo10 y (3) participación de peptidil arginina deiminase (PAD) 411,12. Macrófagos también expresan H3Cit, proteasas de gránulo y almohadilla, y estas características pueden utilizarse para definir la presencia de METs.
METs de pueden tener un papel particularmente importante en el pulmón, como el macrófago es la célula dominante presente en los alvéolos y las vías respiratorias del pulmón y tiene la función inicial en la dirección del cellular la respuesta inmune a la infección/inflamación. Además, mientras que gran parte del pulmón es espacio vacío (por ejemplo, dentro de los alvéolos), los METs son potencialmente capaces de expandirse en el espacio disponible, a diferencia de órganos sólidos.
El método más utilizado para definir la presencia de redes es mediante microscopía confocal. Aún no existe una forma claramente definida para medir METs. La técnica para la medición de redes ha sido adaptada para medir la presencia de METs en el presente Protocolo. Los principales requisitos para este método son el acceso a la microscopia confocal y el software apropiado de imágenes para análisis.

<table><tbody><tr><td><Muestras > humanos: Anticuerpos primarios</Conejo fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>H3Cit (Citrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Conejo antihumano MMP12</td><td>Novus Biológico</td><td>NB110-57214</td><td>Concentración 1:100 no cuantificable</td></tr><tr><td>Ratón antihumano MMP9</td><td>Novus Biológico</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascitis, sin concentración dado</td></tr><tr><td>Conejo anti-humano PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Ratón anti-humano PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Ovejas anti-humano NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Observaciones</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Muestras de ratón: Anticuerpos primarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Conejo anti-ratón H3Cit (Citrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rata anti-ratón F4/80</td><td>De fabricación propia (hibridoma)</td><td>De fabricación propia</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Oveja antihumana Anti-HNE /NE</td><td>Zafiro Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Ratón antihumano y tímido; y tímido; y tímido; y tímido; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Portaobjetos Super-frost plus</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong</td><td>gold Sondas moleculares</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-cabra AF 594</td><td>Life tecnologías</td><td>A-21468</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-ratón AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ovejas AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-ratón AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ovejas AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Control de isotipos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>En casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>En</td><td></td><td></td></tr> casa <tr><td>Ratón IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>En</td><td></td><td></td></tr><tr><td>casa Ratón IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Oveja IgG</td><td>En casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Programas de software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para la intensidad media de los fluorforos, se puede utilizar una aplicación de oficina estándar como Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Microscopios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Microscopio de barrido confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Microscopio de barrido confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Fuentes de tejidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muestras de BAL humano de la sala de broncoscopia del Centro</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Médico MonashMuestras de LBA de ratón y tejido pulmonar del Departamento de Farmacología de la Universidad de Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para becerro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Otros reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudán negro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído/periodato/lisina (PLP) fijador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Formalina natural</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Disolvente 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Cuberitos 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Ratones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 negro 6</td><td>Monash plataforma de investigación animal (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de macrófagos trampas extracelular mediante microscopía confocal

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Un método primario utilizado para definir la presencia de neutrófilos trampas extracelulares (redes) es la microscopia confocal. Hemos modificado microscopía confocal establecido métodos para visualizar las trampas extracelulares del macrófago (MET). Estas trampas extracelulares se definen por la presencia de cromatina extracelular con coexpresión de otros componentes como gránulo proteasas, las histonas citrulinado y peptidil arginasa deiminase (PAD). La expresión de METs es generalmente medida después de la exposición a un estímulo y en comparación con muestras no estimuladas. Las muestras también se incluyen para el control del fondo y el isotipo. Las células son analizadas utilizando el software de análisis de imagen bien definida. La microscopia confocal puede utilizarse para definir la presencia de METs en vitro y en vivo en el tejido pulmonar.

METs se pueden visualizar de muestras de BAL, en tejido pulmonar y en secciones gruesas de pulmón con imágenes 3D. En la figura 1se muestra un ejemplo de METs visualizado en una muestra de BAL. La morfología de los METs variarán según su etapa de maduración. La primera característica detectable en microscopia es el movimiento del núcleo al borde de la celda. Esto es seguido por cromatina extracelular con otros mediadores Co expresados, como proteasas H3Cit y ...

Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

El objetivo general de este método es demostrar cómo se pueden visualizar y estudiar las trampas extracelulares de macrófagos utilizando microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación, como las respuestas a la infección y otros estímulos inmunitarios. La principal ventaja de esta técnica es que es una modificación de un método bien establecido que se ha utilizado para estudiar las trampas extracelulares de neutrófilos.La demostración de este procedimiento será Roleen Sharma. Después de obtener macrófagos pulmonares de humanos y ratones mediante lavado broncoalveolar, o BAL, de acuerdo con el protocolo de texto, use azul de tripán y un hemocitómetro para realizar un recuento de células viables en la solución de BAL. Pipetear de uno a cuatro veces 10 al quinto macrófagos en 500 microlitros de medio de cultivo en cubreobjetos en los pocillos de placas de 24 pocillos, luego incubar las células a 37 grados Celsius durante la noche para que las células se adhieran.Retire el medio de cultivo y use PBS para lavar las células una vez. A continuación, añada un 2% de paraformaldehído-periodato-lisina, o fijador PLP, e incube las muestras durante 10 minutos. Después de usar PBS para lavar brevemente las células, agregue 0.2%TWEEN 20 en PBS e incube las células durante 20 minutos.A continuación, para bloquear las células, agregue 10% de suero de pollo en 5%BSA, diluido en PBS e incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, sustituya la solución en bloque por una concentración de uno a 100 de anticuerpos primarios y de control de isótopos e incube las células a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, use PBS para lavar las células antes de agregar los anticuerpos secundarios correspondientes.A continuación, incubar las muestras durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células en PBS, monte las muestras con un medio de montaje basado en DAPI y, a continuación, visualice las muestras con un microscopio confocal. Para tratar previamente las muestras de FFPE con una solución de recuperación de antígenos, seque los portaobjetos en el horno a 60 grados centígrados durante 60 minutos.A continuación, transfiera los portaobjetos a una solución de xileno durante 30 minutos antes de transferir las muestras a etanol al 70% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de usar agua del grifo para enjuagar los portaobjetos, colóquelos en una envoltura de plástico resistente al calor y sométalos a una mayor recuperación de antígenos colocándolos en una olla a presión en Tris-EDTA pH 9.0 durante 10 minutos. Enfríe las muestras durante 20 minutos y transfiérelas al agua del grifo.Luego colócalos en una mecedora durante cinco minutos. Repita el lavado con agua del grifo y luego lave las correderas una vez en PBS en el balancín. Para bloquear las muestras, agregue 10% de suero de pollo en 5%BSA PBS e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, para definir las trampas extracelulares de macrófagos, o METs en macrófagos, se añada una dilución de uno a 100 de anticuerpos primarios en 1%BSA PBS y se incuban los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Use PBS para lavar las muestras dos veces en un balancín durante cinco minutos cada una. Añadir los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes en PBS al 1%BSA e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 40 minutos.Después de los lavados de PBS, utilice un medio de montaje que contenga DAPI para teñir la cromatina y montar las muestras. Utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio invertido, capture imágenes fluorescentes utilizando objetivos de aire 20X 0.1 NA y 40X 1.0 NA aceite. Capture imágenes de un solo plano de 512 por 512 píxeles haciendo clic en el botón de nivelación secuencial de línea.Obtenga al menos 10 campos de vista por sección para el análisis y los datos de cada resultado. Para teñir las secciones en tubos de microcentrífuga, agregue los anticuerpos primarios relevantes en volúmenes de 200 microlitros e incube las muestras a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Lave las secciones en PBS tres veces durante 10 minutos antes de agregar los anticuerpos secundarios apropiados e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora.Utilice DAPI para teñir las secciones pulmonares en solución e incubar las muestras durante 20 minutos antes de agregar cubreobjetos a las secciones en portaobjetos de microscopio en PBS. Utilice un microscopio confocal invertido con un objetivo 40X 1.3 NA, equipado con láseres de 405 nanómetros, 440 nanómetros, 473 nanómetros, 543 nanómetros y 635 nanómetros, para capturar imágenes y registrar pilas Z 3D, de 0,54 micras de grosor, con un corte Z óptimo. Finalmente, analice las imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.A continuación se muestra un ejemplo de METs en una muestra de BAL. La primera característica detectable es el movimiento del núcleo hacia el borde de la célula, como se ve en esta etapa anterior de MET que tiene una forma aproximadamente esférica. A esto le sigue la cromatina extracelular con otros mediadores coexpresados, como el H3Cit y las proteasas granulares, como se observa en este MET más maduro.La etapa temprana de MET está en la parte superior izquierda y la etapa posterior MET está debajo de esta hacia el centro. En esta figura se muestran los METs del tejido pulmonar. A medida que los pulmones se inflan con líquido para definir la arquitectura pulmonar, los MET se empujarán contra las paredes alveolares.La morfología de los METs también variará dependiendo del plano en el que se haya cortado el tejido. Las secciones estándar utilizadas para las muestras de tejido pulmonar tienen un grosor de cuatro a cinco micras. Las secciones de tejido más gruesas permiten tomar múltiples imágenes y los MET se pueden ver en 3D.Aquí se presenta un ejemplo de una imagen 3D de tejido pulmonar de ratón cortado en secciones de 25 a 35 micras. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días de tinción más imágenes si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser suave con los lavados.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la zimografía para responder a preguntas adicionales como la expresión de la proteasa. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para el estudio de las respuestas inflamatorias de los macrófagos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar MET usando microscopía confocal.No olvide que trabajar con PLP puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y protección para los ojos al realizar este procedimiento.

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Se describe un método para seleccionar de forma individual, manipular, y los agentes patógenos de imágenes en vivo con una trampa óptica acoplada a un microscopio de disco giratorio. La trampa óptica proporciona un control espacial y temporal de los organismos y los coloca junto a las células huésped. Microscopía de fluorescencia captura dinámica de interacciones intercelulares con perturbación mínima para las células.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

En este video, describimos un protocolo para la inmunotinción y la visualización basada en microscopía confocal de trampas extracelulares (MET) de macrófagos en tejido pulmonar murino. Los macrófagos residentes en los tejidos se caracterizan por la expresión del marcador de glicoproteína de superficie F4/80 específico de macrófagos, mientras que los MET se visualizan marcando los marcadores MET metaloproteinasa 9 de la matriz, la histona H3 citrulinada y la cromatina extracelular.

Caracterización de trampas extracelulares de macrófagos en muestras de tejido pulmonar de ratón

Este video demuestra el inmunomarcaje de trampas extracelulares de macrófagos, METs, en macrófagos broncoalveolares a partir de líquido de lavado broncoalveolar, y su visualización utilizando un microscopio confocal.

Visualización de Trampas Extracelulares en Macrófagos a partir de Fluidos de Lavado Broncoalveolar Humanos

Este video demuestra la estimulación in vitro de trampas extracelulares (METs) de macrófagos en macrófagos humanos derivados de monocitos utilizando diferentes estímulos inflamatorios como TNF-alfa, PMA y HOCL. El video también muestra el método de tinción con tinción de MET con tinte SYTOX para su visualización.

Estimulación in vitro y visualización de trampas extracelulares de macrófagos

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Aprende a visualizar trampas extracelulares de macrófagos mediante microscopía confocal en muestras pulmonares de humanos y ratones. Este protocolo detallado permite estudiar respuestas inmunitarias e inflamación con alta reproducibilidad.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

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