Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

El objetivo general de este método es demostrar cómo se pueden visualizar y estudiar las trampas extracelulares de macrófagos utilizando microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inflamación, como las respuestas a la infección y otros estímulos inmunitarios. La principal ventaja de esta técnica es que es una modificación de un método bien establecido que se ha utilizado para estudiar las trampas extracelulares de neutrófilos.

La demostración de este procedimiento será Roleen Sharma. Después de obtener macrófagos pulmonares de humanos y ratones mediante lavado broncoalveolar, o BAL, de acuerdo con el protocolo de texto, use azul de tripán y un hemocitómetro para realizar un recuento de células viables en la solución de BAL. Pipetear de uno a cuatro veces 10 al quinto macrófagos en 500 microlitros de medio de cultivo en cubreobjetos en los pocillos de placas de 24 pocillos, luego incubar las células a 37 grados Celsius durante la noche para que las células se adhieran.

Retire el medio de cultivo y use PBS para lavar las células una vez. A continuación, añada un 2% de paraformaldehído-periodato-lisina, o fijador PLP, e incube las muestras durante 10 minutos. Después de usar PBS para lavar brevemente las células, agregue 0.2%TWEEN 20 en PBS e incube las células durante 20 minutos.

A continuación, para bloquear las células, agregue 10% de suero de pollo en 5%BSA, diluido en PBS e incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, sustituya la solución en bloque por una concentración de uno a 100 de anticuerpos primarios y de control de isótopos e incube las células a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, use PBS para lavar las células antes de agregar los anticuerpos secundarios correspondientes.

A continuación, incubar las muestras durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células en PBS, monte las muestras con un medio de montaje basado en DAPI y, a continuación, visualice las muestras con un microscopio confocal. Para tratar previamente las muestras de FFPE con una solución de recuperación de antígenos, seque los portaobjetos en el horno a 60 grados centígrados durante 60 minutos.

A continuación, transfiera los portaobjetos a una solución de xileno durante 30 minutos antes de transferir las muestras a etanol al 70% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de usar agua del grifo para enjuagar los portaobjetos, colóquelos en una envoltura de plástico resistente al calor y sométalos a una mayor recuperación de antígenos colocándolos en una olla a presión en Tris-EDTA pH 9.0 durante 10 minutos. Enfríe las muestras durante 20 minutos y transfiérelas al agua del grifo.

Luego colócalos en una mecedora durante cinco minutos. Repita el lavado con agua del grifo y luego lave las correderas una vez en PBS en el balancín. Para bloquear las muestras, agregue 10% de suero de pollo en 5%BSA PBS e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, para definir las trampas extracelulares de macrófagos, o METs en macrófagos, se añada una dilución de uno a 100 de anticuerpos primarios en 1%BSA PBS y se incuban los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Use PBS para lavar las muestras dos veces en un balancín durante cinco minutos cada una. Añadir los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes en PBS al 1%BSA e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 40 minutos.

Después de los lavados de PBS, utilice un medio de montaje que contenga DAPI para teñir la cromatina y montar las muestras. Utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio invertido, capture imágenes fluorescentes utilizando objetivos de aire 20X 0.1 NA y 40X 1.0 NA aceite. Capture imágenes de un solo plano de 512 por 512 píxeles haciendo clic en el botón de nivelación secuencial de línea.

Obtenga al menos 10 campos de vista por sección para el análisis y los datos de cada resultado. Para teñir las secciones en tubos de microcentrífuga, agregue los anticuerpos primarios relevantes en volúmenes de 200 microlitros e incube las muestras a cuatro grados centígrados durante 16 horas. Lave las secciones en PBS tres veces durante 10 minutos antes de agregar los anticuerpos secundarios apropiados e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora.

Utilice DAPI para teñir las secciones pulmonares en solución e incubar las muestras durante 20 minutos antes de agregar cubreobjetos a las secciones en portaobjetos de microscopio en PBS. Utilice un microscopio confocal invertido con un objetivo 40X 1.3 NA, equipado con láseres de 405 nanómetros, 440 nanómetros, 473 nanómetros, 543 nanómetros y 635 nanómetros, para capturar imágenes y registrar pilas Z 3D, de 0,54 micras de grosor, con un corte Z óptimo. Finalmente, analice las imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación se muestra un ejemplo de METs en una muestra de BAL. La primera característica detectable es el movimiento del núcleo hacia el borde de la célula, como se ve en esta etapa anterior de MET que tiene una forma aproximadamente esférica. A esto le sigue la cromatina extracelular con otros mediadores coexpresados, como el H3Cit y las proteasas granulares, como se observa en este MET más maduro.

La etapa temprana de MET está en la parte superior izquierda y la etapa posterior MET está debajo de esta hacia el centro. En esta figura se muestran los METs del tejido pulmonar. A medida que los pulmones se inflan con líquido para definir la arquitectura pulmonar, los MET se empujarán contra las paredes alveolares.

La morfología de los METs también variará dependiendo del plano en el que se haya cortado el tejido. Las secciones estándar utilizadas para las muestras de tejido pulmonar tienen un grosor de cuatro a cinco micras. Las secciones de tejido más gruesas permiten tomar múltiples imágenes y los MET se pueden ver en 3D.

Aquí se presenta un ejemplo de una imagen 3D de tejido pulmonar de ratón cortado en secciones de 25 a 35 micras. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días de tinción más imágenes si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser suave con los lavados.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la zimografía para responder a preguntas adicionales como la expresión de la proteasa. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para el estudio de las respuestas inflamatorias de los macrófagos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar MET usando microscopía confocal.

No olvide que trabajar con PLP puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y protección para los ojos al realizar este procedimiento.