Etiquetado de anexina V y yoduro de propidio

Annexin V and Propidium Iodide Labeling

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Cell Biology

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Annexin V and Propidium Iodide Labeling

4.3: The Transwell Migration Assay

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09:09 min

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April 30, 2023

Overview

Tinción con anexina V y propidio yoduro (PI) ofrece a los investigadores una manera de identificar distintos tipos de muerte celular: necrosis o apoptosis. Esta técnica se basa en dos componentes. La primera, anexina V, es una proteína que se une a ciertos fosfolípidos llamados phosphatidylserines, que normalmente ocurren solamente en el folleto de la interno, orientada al citoplasma de la membrana de la célula, pero se convierten en “la vuelta” al prospecto externo durante las primeras etapas de la apoptosis. El segundo componente es la molécula del tinte de ADN PI, que sólo puede entrar las células cuando se rompen sus membranas, una característica de necrosis y apoptosis tardía.

Este artículo de video comienza con una revisión de los conceptos detrás de anexina V y PI la coloración y destaca cómo diferenciales patrones de tinción puede utilizarse para distinguir entre las células que avanza por caminos diferentes de la muerte. A continuación repasamos un protocolo generalizado de esta técnica, seguido de una descripción de cómo los investigadores actualmente están utilizando anexina V y PI tinción para comprender mejor la muerte celular.

Procedure

Anexina V y propidio yoduro (PI) el etiquetado de células es una técnica utilizada para identificar la muerte de la célula y distinguir entre sus diferentes vías: apoptosis, o programado muerte celular y necrosis. Las células experimentan cambios morfológicos distintos dependiendo de la vía. Al identificar las condiciones específicas que conducen a una célula a la apoptosis o necrosis, los científicos obtienen penetración en fisiología celular y la fisiopatología de la enfermedad. Anexina V y PI etiquetado, seguido por citometría de flujo, se ha establecido como uno de los métodos más eficientes para categorizar el tipo de muerte celular.

Hoy, describiremos cómo este análisis ayuda en la identificación de las vías de muerte celular, de cómo llevar a cabo esta técnica y algunos interesantes experimentos de ejemplo que utilizan este método para responder preguntas importantes en el campo de la biología celular.

En primer lugar, echemos un vistazo a los principios de la anexina V y PI la coloración.

Como se mencionó anteriormente, las células apoptóticas exhiben características morfológicas distintivas. Estos incluyen la contracción de la célula, blebbing de membrana, fragmentación nuclear y la aparición de cuerpos apoptóticos. Además, después de la inducción de la apoptosis, es decir, en la etapa temprana de la apoptosis, aparecen ciertos cambios característicos en la membrana. Una membrana de la célula normal tiene la fosfatidilserina o residuos de PS en el prospecto interno. Sin embargo, en células apoptóticas tempranas algunos de estos residuos de PS se translocan a la superficie externa, pero ¿cómo?

Para entenderlo, vamos a dar un paso atrás. Durante la apoptosis, es bien sabido que se activan caspasas citosólicas. Estas enzimas a su vez activan una enzima unida a la membrana llamada scramblase. Scramblase “descompone” la membrana celular por translocación de residuos de PS desde el lado citoplasmático a la superficie externa. En contraste, durante la necrosis PS residuos permanecen donde están, pero la membrana se rompe. Anexina V y PI etiquetado aprovechar estas diferencias en las alteraciones de la membrana de los dos tipos de muerte celular.

Anexina V conjugada con el tinte fluorescente, como el isotiocianato de fluoresceína, comúnmente conocido como FITC-es un ligando de la membrana impermeable, natural de PS y por lo tanto fácilmente identifica temprano células apoptóticas atando a PS externalizada. Sin embargo, tras la ruptura de la membrana, que ocurre durante la necrosis y también durante etapas posteriores de la apoptosis, anexina también pueden enlazar a PS en la cara interna y dar falsos positivos.

Para evitar esto, los científicos utilizan PI. Esta molécula de ADN vinculante tinte es impermeable la membrana y sólo puede entrar en una célula cuando se rompe la membrana. Por lo tanto, si una célula es annexin sólo manchado lo es apoptótica temprana, mientras que una célula que es PI y annexin manchado podría ser apoptóticos o necróticos o finales.

Ahora que usted ha aprendido los principios básicos detrás de este ensayo, vamos a ir a través del procedimiento de tinción y análisis de la muerte celular.

En primer lugar, las células cosechadas y se centrifugó a baja velocidad para evitar cualquier alteración morfológica y resuspendió en buffer de lavado fisiológicas tales como tamponada fosfato salino, también conocido como PBS. Tras otro paso de centrifugación, las células se resuspendió en anexina V tampón vinculante que contiene calcio, que es necesario para anexina enlace a PS. anexina V conjugada con FITC entonces se agrega a la solución, que se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad para permitir la anexina y Asociación de PS. En el siguiente paso, PI es directamente a la anexina tinción solución celular y se incubó en la oscuridad. Después de la incubación, las células son lavadas en PBS por centrifugación, suspendidas en tampón de lavado y mantenidas en hielo. Ahora están listos para el análisis.

Actividad de fluorescencia de las células es analizada por citometría de flujo, una técnica basada en el laser que captura datos de fluorescencia de las células suspendidas en una corriente de fluido. Después de la calibración de la fluorescencia usando células teñidas por separado con cada tinte, se adquieren datos de dos células. Señales de fluorescencia de la población de células se utilizan para crear una trama donde intensidad de annexin-limite FITC se traza en el eje logarítmico y PI en el eje logarítmico. Células que son FITC anexina positivas y negativas de PI se agrupan en la parte inferior derecha de la parcela, que representa las células apoptóticas tempranas, y doble positivos células anexina-FITC y PI se producirán en la parte superior derecha, que representa la apoptosis tardía o células necróticas. Las células que permanecen sin manchas o insignificante manchada para anexina y PI son células vivas.

Ya que ahora sabes por qué los biólogos de la célula dependen de esta técnica para estudiar la muerte celular, por qué no repasamos algunas de sus aplicaciones.

Mediante este procedimiento, los científicos pueden seguir que proteínas intracelulares participan en la apoptosis. En este video, los investigadores analizaron el efecto de cisplatino, un fármaco contra el cáncer, en células del riñón normal para ver si induce apoptosis. Un conjunto de células fue transduced para sobreexpresar una forma activa de la enzima proteína cinasa de C o PKC, y el otro conjunto era transduced con una forma no funcional, PKC negativa dominante. Las células expresando PKC y tratados con cisplatino experimentaron la apoptosis con el tiempo, pero las células que expresan la PKC negativo dominante inactivo fueron resistentes a la apoptosis, indicando que la enzima es un jugador clave en la vía de apoptosis inducida por cisplatino.

Los investigadores también utilizan estas manchas para probar el potencial citotóxico de células T específicas. Células de T citotóxicas puede reconocer proteínas de membrana específicas en su célula diana e inducir su muerte en Unión a él. Aquí, los investigadores incubaron antígenos específicos de células T con las células del tumor blanco y anexina V y luego observó inducción de apoptosis de las células tumorales por el compromiso de la célula de T. Flujo de datos de citometría reveló el porcentaje de muerte de la célula objetivo en presencia y ausencia de células de T citotóxicas.

Por último, los científicos utilizan este método para evaluar la viabilidad de las células después de la entrega del gene. En este caso, los investigadores quisieron evaluar la supervivencia de la célula después nucleofection — un método que utiliza una combinación de productos químicos y un campo eléctrico aplicado para crear transitoria los poros en las membranas celulares y nucleares, facilitando la entrega del gene. Mediante el uso de anexina V más un tinte llamado D 7-aminoactinomycin o 7-AAD, que, similar a PI se une al ADN, demostraron eso muerte de baja celular nucleofection causada por apoptosis o necrosis.

Sólo has visto video de Zeus de anexina V y PI etiquetado. En este video, nosotros brevemente discuten las características distintivas de la apoptosis y las células necróticas, revisó los principios detrás de este método, visto comúnmente un procedimiento generalizado para esta técnica y previsualizar algunas aplicaciones. Dada la importancia de entender cómo las diferentes células mueren bajo diferentes condiciones, anexina V y PI etiquetado sirve como una herramienta importante para biólogos de célula interesado en este fenómeno. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Annexin V and propidium iodide (PI) labeling of cells is a technique used to identify cell death, and distinguish between its different pathways: apoptosis, or programmed cell death, and necrosis. Cells undergo distinct morphological changes depending on the pathway. By identifying the specific conditions that lead a cell to undergo apoptosis or necrosis, scientists gain insight into cellular physiology and the pathophysiology of disease. Annexin V and PI labeling, followed by flow cytometry, has been established as one of the most efficient methods to categorize the type of cell death.

Today, we’ll describe how this assay helps in identification of cell death pathways, how to perform this technique, and some exciting example experiments that use this method to answer important questions in the field of cell biology.

First, let’s take a look at the principles behind annexin V and PI staining.

As mentioned earlier, apoptotic cells exhibit distinctive morphological features. These include cell shrinkage, membrane blebbing, nuclear fragmentation, and the appearance of apoptotic bodies. In addition, following induction of apoptosis—that is, at the early apoptotic stage—certain characteristic changes appear on the membrane. A normal cell membrane has all the phosphatidylserine or PS residues on the inner leaflet. However, in early apoptotic cells some of these PS residues are translocated to the outer surface—but how?

To understand that, let’s take a step back. During apoptosis, it is well known that cytosolic caspases are activated. These enzymes in turn activate a membrane-bound enzyme called scramblase. Scramblase “scrambles” the cell membrane by translocating PS residues from the cytoplasmic side to the outer surface. In contrast, during necrosis PS residues remain where they are, but the membrane itself ruptures. Annexin V and PI labeling capitalize on these differences in membrane alterations of the two types of cell death.

Annexin V conjugated with fluorescent dye, such as fluorescein isothiocyanate—commonly known as FITC—is a membrane impermeable, natural ligand for PS, and therefore easily identifies early apoptotic cells by binding to the externalized PS. However, following membrane rupture, which occurs during necrosis and also during later stages of apoptosis, annexin can also bind to PS on the inner face and yield false positives.

To avoid this, scientists use PI. This DNA binding dye molecule is again membrane impermeable, and can only enter a cell when the membrane is ruptured. Therefore, if a cell is only annexin stained it is early apoptotic, whereas a cell that is both PI and annexin stained could be either necrotic or late apoptotic.

Now that you’ve learned the basic principles behind this assay, let’s go through the procedure of staining and analyzing cell death.

First, cells are harvested and centrifuged at low speed to prevent any morphological disruption, and resuspended in physiological washing buffer such as phosphate buffered saline, also known as PBS. Following another centrifugation step, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to PS. Annexin V conjugated with FITC is then added to the solution, which is incubated at room temperature in the dark to allow annexin and PS association. In the next step, PI is directly added to the annexin staining cell solution and incubated in the dark. After incubation, cells are washed in PBS by centrifugation, resuspended in washing buffer, and kept on ice. Now they are ready for analysis.

Fluorescence activity of cells is analyzed by flow cytometry, a laser-based technique that captures fluorescence data from single cells suspended in a stream of fluid. After fluorescence calibration using cells separately stained with each dye, data from dual stained cells are acquired. Fluorescence signals from the cell population are used to create a plot where annexin-bound FITC intensity is plotted on the logarithmic X-axis, and PI on the logarithmic Y-axis. Cells that are annexin-FITC positive and PI negative will cluster on the lower right side of the plot, representing the early apoptotic cells, and cells double positive for annexin-FITC and PI will occur on the upper right, representing the late apoptotic or necrotic cells. The cells that remain unstained or insignificantly stained for both annexin and PI are live cells.

Since you now know why cell biologists rely on this technique to study cell death, why don’t we review some of its applications.

Using this procedure, scientists can follow which intracellular proteins are involved in apoptosis. In this video, researchers analyzed the effect of cisplatin, an anti-cancer drug, on normal kidney cells to see if it induces apoptosis. One set of cells was transduced to overexpress an active form of the enzyme protein kinase C, or PKC, and the other set was transduced with a non-functional form—dominant negative PKC. Cells expressing PKC and treated with cisplatin underwent apoptosis over time, but cells expressing the inactive dominant negative PKC were resistant to apoptosis, indicating that the enzyme is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway.

Researchers also use these stains to test the cytotoxic potential of specific T cells. Cytotoxic T cells can recognize specific membrane proteins on its target cell, and induce its death upon binding to it. Here, researchers incubated antigen-specific T cells with target tumor cells and annexin V, and then observed induction of tumor cell apoptosis by T cell engagement. Flow cytometry data revealed the percentage of target cell death in the presence and absence of cytotoxic T cells.

Lastly, scientists use this method to evaluate cell viability following gene delivery. In this case, researchers wanted to assess cell survival after nucleofection—a method that uses a combination of chemicals and an applied electric field to create transient pores in cellular and nuclear membranes, thereby facilitating gene delivery. By using annexin V plus a dye called 7-aminoactinomycin D or 7-AAD, which, similar to PI binds to DNA, they showed that nucleofection caused low cell death by either apoptosis or necrosis.

You’ve just watched JoVE’s video on annexin V and PI labeling. In this video, we briefly discussed the distinguishing features of apoptotic and necrotic cells, reviewed the principles behind this method, watched a generalized procedure for this commonly used technique, and previewed some applications. Given the importance of understanding how different cells die under different conditions, annexin V and PI labeling serves as an important tool for cell biologists interested in this phenomenon. As always, thanks for watching!

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