Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1^{+ +} de Tim-3 CD8 células⁺ T

El objetivo general de este análisis de inmunofluorescencia multiplexada es contar automáticamente las células en función de su fenotipo. Este método permite la multifluorescencia y el recuento automático de células para analizar el fenotipo y la función de las células inmunitarias tumorales dentro de un microambiente tumoral. Esta tecnología facilitó la generación de dos tipos de pronósticos compuestos para la predicción por sus marcadores derivados directamente del microambiente tumoral.

Generalmente, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el procedimiento de tipificación de fenotipos es muy largo y los datos sin procesar resultantes requieren un procesamiento adicional. La idea de este método fue cuando intentamos caracterizar el fenotipo y las interacciones inmunológicas de las células miranty annhodge. Después de descongelar, use una toalla de papel para secar cuidadosamente los portaobjetos alrededor de las secciones de tejido y luego rodee los pañuelos con un bolígrafo de barrera hidrofóbica.

Cuando la barrera se haya secado, fije las muestras en acetona al 100% durante cinco minutos, seguido de dos minutos de secado al aire, luego lave los portaobjetos en TBS durante 10 minutos. Trate previamente los portaobjetos con 3 gotas de Avidin al 0,1 % durante 10 minutos en la oscuridad, luego golpee o deslice los portaobjetos para cubrir el tejido con la solución de Avidina. Agregue 3 gotas de 01% de biotina a cada muestra, luego golpee o pase la biotina por las muestras seguido de un lavado con TBS como se acaba de demostrar.

A continuación, bloquee cualquier unión inespecífica con 100 microlitros de suero normal al 5% en TBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, golpee los portaobjetos para eliminar el exceso de suero e incube los portaobjetos en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos primarios de interés durante una hora en una cámara humidificada. Lave los portaobjetos marcados con anticuerpos en TBST durante cinco minutos.

Después del secado, etiquete las células con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos secundarios de interés durante 30 minutos en la cámara humidificada, seguido de un lavado de 10 minutos en TBS. Incube los portaobjetos marcados con anticuerpos secundarios secos con 100 microlitros del cóctel de anticuerpos terciarios de interés durante 30 minutos, seguidos de 10 minutos de un lavado con TBS. Al final del lavado, seque los portaobjetos y monte los pañuelos con un medio de montaje complementado con dapi.

A continuación, trébol de cada portaobjetos con un cubreobjetos y deje que el medio de montaje se asiente durante al menos dos horas. Para escanear los portaobjetos, abra el software del microscopio y cargue el protocolo de escaneo de imágenes. Cargue el primer portaobjetos en la platina del microscopio.

Luego, en la barra de control, haga clic en establecer exposición y ajuste el tiempo de exposición para cada filtro hasta que se obtenga una señal suficiente pero no saturante. Haga clic en iniciar en el panel superior y abra la carpeta LabID. Introduzca el ID de la primera diapositiva y haga clic en Siguiente.

Para obtener una visión general del portaobjetos bajo luz de campo brillante con un aumento de 4x, haga clic en Imágenes monocromáticas y busque la muestra. Para seleccionar el área de tejido que se va a escanear, presione la tecla de control y use el cursor para seleccionar o anular la selección de las regiones de interés que se escanearán con un aumento de 4x. Para obtener una imagen fluorescente roja/azul/verde de cada región, haga clic en Imagen de baja potencia.

Para la selección de campo de alta potencia, presione la tecla de control y seleccione al menos cinco regiones de interés que correspondan a las áreas del tejido que se escanearán con un aumento de 20x. A continuación, para obtener una adquisición de imágenes multiespectrales de cada campo, haga clic en Imagen de alta potencia y haga clic en Almacenamiento de datos para almacenar las imágenes en la carpeta de ID de laboratorio adecuada. Para crear un nuevo proyecto en el menú archivo, seleccione nuevo proyecto, en el menú de características de búsqueda, seleccione segmentación de celdas y, en el menú de tipificación de fenotipos, seleccione tipificación de fenotipos y, a continuación, haga clic en configurar.

En formato de imagen, seleccione multiespectral. En el formato de muestra, elija fluorescencia. Para integrar las imágenes representativas en el proyecto, en el menú de archivos, haga clic en abrir imagen y seleccione de 10 a 30 imágenes representativas de toda la serie.

Para eliminar la fluorescencia automática, abra el portaobjetos sin teñir y seleccione la fuente de la biblioteca y los fluoróforos adecuados. Haga clic en fluorescencia automática y seleccione el área de fluorescencia automática en la diapositiva en blanco. Para generar una imagen compuesta, seleccione preparar todo para integrar la biblioteca de fluorescencia y los espectros de fluorescencia automática.

Haga clic en el icono del ojo para abrir el panel del editor de vistas y anule la selección de la autofluorescencia para recortar la señal de autofluorescencia. Seleccione un color apropiado para cada marcador. Para segmentar las células, en el menú de compartimentos, seleccione núcleos y membrana.

En el menú de núcleos, establezca DAPI como la contratinción nuclear. Haga clic en segmentar células y comprobar la segmentación de los núcleos en las membranas celulares. Para fenotipar las celdas, en el menú de fenotipo, haga clic en agregar.

Para crear las categorías de fenotipo de celda, seleccione más de cinco representativos para Fluoróforo y combinación de fluoróforo, y haga clic en clasificar el tren. El clasificador está creando un algoritmo que atribuye un fenotipo a cada celda con un intervalo de confianza. Amplíe y compruebe los fenotipos de las células.

A continuación, haga clic en fenotipo todo para guardar el algoritmo de fenotipo y el proyecto de imagen, en el menú de archivos seleccione guardar proyecto. A continuación, asigne un nombre al proyecto y guárdelo. Para realizar un análisis por lotes de la serie, seleccione análisis de baño y seleccione el proyecto guardado.

Seleccione una carpeta para almacenar los datos agrupados. Agregue las imágenes que se van a analizar y luego haga clic en ejecutar. Al final del análisis, verifique la calidad de la imagen compuesta y verifique la tipificación fenográfica de todas las imágenes dentro de la serie.

El análisis de las células T CD8 positivas infiltrantes del tumor en una muestra clara de carcinoma de células renales mediante imágenes multiespectrales de fluorescencia revela que aproximadamente la mitad de las células T positivas para CD8 son positivas simples para PD-1 y alrededor de 1/3 son positivas dobles para PD-1 y Tim-3. Después de integrar estas diversas señales celulares en una sección de tejido, la medición de la intensidad de la florescencia de PD-1 en las células T positivas para PD-1 Tim-3 positivas frente a las células T positivas para PD-1 y Tim-3 negativas para CD8, revela que la IMF de PD-1 es mayor cuando se coexpresa Tim-3, lo que refuerza la relevancia funcional de la expresión de Tim-3. En este experimento representativo, el 66% de los pacientes con tumor renal también fueron positivos para la expresión del ligando PD-1 y el 100% fueron positivos para el ligando Tim-3 Galactin-9.

La puntuación clínica de los tejidos tumorales de pacientes con carcinoma de células renales también demostró la correlación positiva entre el número y el porcentaje de células T CD-8 positivas infiltrantes del tumor que expresan PD-1 y Tim-3 y los parámetros de puntuación pronóstica, pero no los CD-8 positivos para PD-1 que no expresan Tim-3. Curiosamente, los pacientes con carcinoma de células renales con linfocitos T CD-8 positivos que expresan PD1 con y Tim 3 por encima del porcentaje medio tenían más probabilidades de recaer, mientras que se encontró que la expresión de PD-1 sin la expresión conjunta de Tim-3 no se correlacionaba con la recaída del paciente. Mientras intenté este procedimiento, es importante recordar revisar el fenotipo de las células con dos investigadores separados, incluido un patólogo si es posible.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros asuntos, como la citometría, para responder preguntas adicionales sobre el impacto funcional del propio fenotipo después de la estimulación x-vivo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer exploraran las respuestas inmunitarias en los órganos afectados.